PCR en tiempo real: la nueva era de la información genética

1. Resumen
2. Introducción
3. tiempo
   real
4. Marcadores
   Fluorescentes
5. Análisis de la curva
   de fusión
6. Umbral y
   valores
   umbral del ciclo (threshold cycle values)
7. Optimización de PCR en
   tiempo real
8. Estrategias
   para la cuantificación de ARNm en PCR en tiempo
   real
9. Genes de
   referencia
10. Aplicaciones de
    la PCR en tiempo real
11. Futuras
    perspectivas de la PCR en tiempo real
12. Conclusión
13. Referencias 

Resumen

La identificación de la expresión genética y
de secuencias específicas de ADN o ARN es un
factor crucial cuando se trabaja con técnicas
de biología
molecular. Para obtener esta información algunas pruebas han
sido desarrolladas, siendo la PCR una de las más usadas.
Sin embargo esta técnica tiene algunas limitaciones como
la dificultad de cuantificar el producto de la
PCR y el riesgo de
provocar contaminación en el laboratorio.
Para hacer frente a estas desventajas, la PCR en tiempo real ha
sido desarrollada. Esta técnica brinda una gran cantidad
de datos con una
alta sensibilidad y especificidad usando plataformas modernas que
evitan la contaminación que puede ser causada en
laboratorio por ácido nucleídos. Por otro lado
algunas consideraciones como el escoger la estrategia de
cuantificación y marcadores fluorescentes, así como
la interpretación de los datos obtenidos,
deben ser tomadas en cuenta cuando se usa la PCR en tiempo real.
En este artículo se revisan los conceptos básicos
de la PCR en tiempo real y del manejo de los datos obtenidos con
esta técnica de laboratorio.

Palabras clave: PCR en tiempo real | cuantificación
genética | biología molecular | genes de referencia
| ADN complementario | transcriptasa reversa

(Real Time PCR: the new age of
genetic information)

Abstract

Identification of gene expression and specific sequences of
DNA or RNA is a crucial fact when working with molecular biology
techniques. In order to obtain this information some tests have
been developed, being PCR one of the most used ones. However,
this technique has some limitations as the difficulty to quantify
the PCR product and the risk to carry out laboratory
contamination. In order to face these disadvantages real time PCR
has been developed. This technique comes out with an elevated
data output with a high sensibility and specificity using modern
platforms that avoid laboratory contamination that could be
caused by nucleic acids. Nevertheless, several considerations,
like the choice of the strategy of quantification and fluorescent
markers as well as data interpretation, must be taken into
account when working with real time PCR. This review goes through
the basic concepts on the real time PCR technique and handling of
obtained data.

Keywords: real time PCR | genetic quantification | molecular
biology | reference genes | complementary DNA | reverse
transcriptase

Tipo de trabajo: Artículo de de revisión
bibliográfica

Descripción de los recursos:
texto,
imágenes, 1.46 MB aproximadamente.

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INTRODUCCIÓN

En todos los organismos vivos las células
regulan sus actividades mediante la activación o
desactivación de la expresión de sus genes. La
expresión genética es generalmente proporcional al
número de copias de ARN mensajero (ARNm) de un gen
determinado. Este es un hecho crucial cuando se trata de
identificar la presencia de productos
celulares específicos ya que el ARNm es traducido en los
ribosomas para formar proteínas.
Por lo tanto es posible obtener datos relativos a la producción de elementos biológicos
si la expresión de los genes de una célula es
conocida (McPherson et al.,  2008).

Con el fin de abordar esta premisa, una técnica
conocida como northern blotting ha sido generalmente utilizada.
En este método ARN
purificado es separado por electroforesis en gel de agarosa y
luego identificado con sondas de ADN específicas (Smith
& Old, 1993). Aunque esta técnica se sigue utilizando
para investigar la expresión genética celular su
principal desventaja es la exigencia de cantidades relativamente
grandes de ARN, impidiendo su uso cuando las cantidades de ARNm
son limitadas (McGuire et al.,  2004).

Para superar esta limitación se ha desarrollado la
técnica de PCR en tiempo real, también llamada PCR
cuantitativa en tiempo real. Esta técnica está
basada en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y
 se usa para amplificar y al mismo tiempo cuantificar
moléculas de ADN o ADN complementario (ADNc)
específicas y así acceder a datos fiables y
precisos sobre la expresión genética de las
células en estudio (Heid et al.,
 1996).