Identificación del género Clostridium (página 2)

Generalmente, las células
vegetativas tienen forma de bacilos, pudiendo variar desde
bacilos cocoides cortos a largos bacilos filamentosos. Pueden
aparecer sueltos, en parejas o en cadenas. La mayoría de
las especies suelen teñirse como grampositivas, pero hay
excepciones como C. clostridioforme y C. ramosum que
suelen ser gramnegativos incluso en cultivos jóvenes de 24
h. Clostridium tetani puede aparecer como gramnegativo
después de la formación de esporas. Las esporas
pueden tener forma oval o esférica y aparecer en
situación terminal o subterminal. La demostración
de esporas, es difícil en algunas especies como C.
perfringens, C. ramosum y C. clostridioforme.

La mayoría de las especies son móviles por medio
de flagelos perítricos; C. perfringens, C. ramosum y C.
innocuum son inmóviles. Raramente producen
catalasa pero cuando lo hacen, la reacción es
débilmente positiva. La mayoría son anaerobios
obligados moderados, con excepciones como C. haemolyticum y C.
novyi tipo B, que son anaerobios obligados estrictos (no
crecen cuando se exponen a niveles de oxígeno
mayores al 0,5%) o C. tertium, C. carnis, C. histolyticum
y alguna cepa de C. perfringens, que son
aerotolerantes.

Algunas especies son sacarolíticas (fermentación de la glucosa),
otras proteolíticas (hidrólisis de la gelatina) y
otras pueden tener ambas características. Algunas especies
producen lecitinasa o lipasa que pueden demostrarse en agar yema
de huevo. La lecitinasa (alfa-toxina, fosolipasa C) produce un
halo opaco alrededor de la colonia por lisis de la lecitina y la
lipasa transforma las grasas en
glicerol y ácidos
grasos, dando una capa iridiscente que cubre la superficie de la
colonia.

DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO DE INFECCIONES DE PIEL Y
TEJIDOS
BLANDOS POR Clostridium

Selección, recolección y transporte
adecuado de muestras clínicas

Se seguirán las precauciones debidas para la toma de
muestras que

puedan contener bacterias
anaerobias.

-En infecciones de tejidos o abscesos con superficie intacta,
la toma se efectuará por punción percutánea
y aspiración, procurando que no penetre aire, previo
lavado y desinfección.

-En focos o heridas abiertas, debe limpiarse el orificio del
drenaje con solución salina estéril y tomar la
muestra de la
parte más profunda por aspiración.

-En la gangrena gaseosa son buenas muestras las procedentes
del desbridamiento quirúrgico de las lesiones, así
como las obtenidas por aspiración de las burbujas o
ampollas que se forman en la piel.

-Generalmente, las muestras en escobillón no son
adecuadas y únicamente se utilizarán ante la
imposibilidad de obtener la muestra de las formas anteriormente
indicadas.

-El material obtenido debe enviarse en tubo estéril o
vial de transporte de anaerobios lo antes posible al laboratorio
para su procesamiento.

Medios de cultivo e incubación

Para la recuperación de bacterias del género
Clostridium a partir de muestras clínicas, se
pueden utilizar los siguientes medios: agar
sangre para
anaerobios, como agar Brucella, agar sangre PEA, agar Schaedler,
agar sangre para anaerobios CDC, etc. Es conveniente incluir un
medio con yema de huevo para investigar la producción de lipasa y lecitinasa y un
medio líquido de enriquecimiento, como el tioglicolato. La
incubación se hará a 35-37ºC en anaerobiosis
(cámaras, jarras o bolsas con generadores de atmósfera
anaerobia).

Identificación de especies de
Clostridium

El examen de la típica morfología
tanto microscópica como de la colonia permite una
identificación presuntiva y rápida de algunas
especies de Clostridium frecuentemente aisladas (tabla 2).
Además, junto con la utilización de pruebas
bioquímicas sencillas como el estudio de la
producción de lecitinasa y lipasa en agar yema de huevo,
la hidrólisis de la gelatina y de la urea y la
producción de indol por el método
rápido (p-dimetil-aminocinnamaldehído), constituyen
un método fácil y poco costoso para la
identificación, incluso definitiva, de algunas de
ellas.

Por las características particulares de algunas
especies, se pueden presentar ciertos problemas en
el proceso de
identificación que pueden ser fácilmente
resueltos:

-Las especies que se tiñen gramnegativas pueden
identificarse como grampositivas por la resistencia a un
disco de colistina de 10 μg y la sensibilidad a uno de
vancomicina de 5 μg.

-Las especies aerotolerantes se pueden diferenciar de miembros
del género Bacillus porque Clostridium crece
mucho mejor en anaerobiosis, es catalasa negativo (o muy
débilmente positiva) y esporula sólo en condiciones
anaerobias, mientras que Bacillus crece mejor en
aerobiosis, es catalasa positivo y generalmente no esporula
enanaerobiosis.

-Las esporas de algunas especies son difíciles de
observar y puede ser necesaria una técnica de selección
de esporas, bien por tratamiento con calor a
70-80ºC o con etanol.

Cuando son visibles, es suficiente la tinción de Gram,
las tinciones especiales para esporas no suelen ofrecer ventajas
adicionales.

-Las colonias pueden presentar un aspecto pleomórfico
dando la impresión de un cultivo mixto. Debe hacerse un
subcultivo de una simple colonia para comprobar el mismo
pleomorfismo.

Para la identificación definitiva, los métodos
utilizados tradicionalmente para anaerobios, como la
determinación de sus características fermentativas
y bioquímicas con los medios líquidos prerreducidos
(PRAS) y la determinación de los productos
metabólicos por cromatografía líquido-gaseosa o el
análisis de los ácidos grasos de la
pared han proporcionado en general buenos resultados. Sin
embargo, estas técnicas
están sólo disponibles en algunos laboratorios.

En los últimos años, el interés
por la utilización de métodos asequibles a todos
los  tipos de laboratorios clínicos ha dado lugar a
la aparición de sistemas
comerciales para laidentificación rápida de
anaerobios. Unos están basados en pruebas
bioquímicas (API 20 A o Minitek) y consiguen los
resultados en 24-48 h. Otros como Anaerobe ANI Card, Rapid ID 32
A, Rapid Anaerobe ID, Crystal Anaerobe ID o RapID-ANA
están basados en la detección de enzimas
preformadas a partir de sustratos cromogénicos y la lectura se
realiza a las 4 h.

El porcentaje de identificación correcta que se obtiene
con ellos oscila entre 60-80%. Casi el 100% de las cepas de C.
perfringens son identificadas correctamente mientras que los
mayores fallos se producen con cepas de C. inocuum, C.
difficile, C. sporogenes, C. tetani y C.
clostridioforme.

SENSIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS

Los antibióticos activos frente a
bacterias anaerobias, son activos frente a la mayoría de
cepas de Clostridium, pero existen algunas
excepciones.

· Clostridium ramosum, C. butyricum y C.
clostridioforme, pueden producir ß-lactamasas
inducibles por antibióticos
ß-lactámicos. La presencia de estas
enzimas se puede investigar por el método de la
cefalosporina cromogénica, utilizando como sustrato
nitrocefina (Cefinaseâ, Becton-Dickinson). Aunque se
ha detectado un aumento de la resistencia a la penicilina en
C. perfringens, no se ha demostrado la producción
de ßlactamasas en esta especie, lo cual
podría reflejar otros mecanismos como la
disminución en la afinidad por las proteínas
fijadora de penicilina (PBP).

· La resistencia a la clindamicina se ha documentado en
cepas de C. perfringens, C. ramosum, C. difficile, C. tertium,
C. subterminale, C. butyricum, C. sporogenes y C.
innocuum. En el año 1991 Alados et al.
encontraron un 9% de resistencia a este antibiótico en las
cepas de C. perfringens aisladas en el Hospital Virgen de
las Nieves de Granada.

· Clostridium tertium es resistente a los
ß-lactámicos, clindamicina y metronidazol y
la mayoría de las cepas de C. innocuum son
sólo moderadamente sensibles a lavancomicina.

La realización de pruebas de sensibilidad in
vitro a los antimicrobianos en estas bacterias están
indicadas en pacientes con enfermedad grave, que requieren
tratamientos prolongados, que no responden al tratamiento
empírico, en especies generalmente asociadas a resistencias y
como vigilancia de los patrones de resistencia de la comunidad y
hospitalaria.

La dilución en agar es el método de referencia
del NCCLS, pero para las pruebas habituales en los laboratorios
clínicos los paneles comerciales de microdilución
en caldo (Sensititre o ATB ANA) y el E-test® son
unas buenas opciones, presentando además, una buena
correlación con dicho método de referencia. Con el
E-test®, el metronidazol puede dar falsas resistencias,
problema que parece eliminarse si la placa es pre-reducida en
atmósfera anaerobia durante 18-24 h antes de la prueba.
Por el contrario, la clindamicina puede dar falsos sensibles,
recomendándose para este antibiótico un periodo de
incubación de 48 h que permita detectar la
expresión retrasada de la resistencia inducible.

MATERIAL

♥ Asa bacteriológica

♥ Mechero

♥ Tubos con caldo glucosado con sello

♥ Tubos con caldo lactosado con sello

♥Tubos con gelatina bacteriológica con sello

♥ Tubos con leche con
sello

♥ Tubos con medio SIM con sello

♥Cultivo Clostridium sesión anterior

PROCEDIMIENTO

1.- Colocar los tubos de caldo glucosado, lactosado y leche en
agua
hirviendo, para extraerles el aire previamente al desarrollo de
la práctica.

2.- Debe enfriar sin mover para evitar aireación

3.- Sembrar cuidadosamente con el cultivo obtenido en la
sesión anterior

4.- Sembrar el tubo de gelatina por picadura e incubar a
temperatura
ambiente.

5.- Incubar los tubos de caldo glucosado, lactosado y leche
así como el medio de SIM a 37º C durante 48 hrs y
comparar con la siguiente tabla de pruebas bioquímicas e
interpretar resultados.

RESULTADOS

           
La siembra realizada la clase anterior
a la práctica de identificación fue ciertamente
infructuosa, es decir, no hubo crecimiento colonial sugestivo de
clostridium por lo que se nos sugirió realizar las pruebas
bioquímicas con una colonia producto de
la
contaminación para la cual solo fue positiva la prueba
de glucosa y todas las demás pruebas negativas por lo cual
podemos estar seguros que no
era ninguna especie de clostridium.

CONCLUSIONES

El género clostridium representa un grupo de
bacterias con gran importancia clínica pues las enfermedades causadas por
estas bacterias son de muy variadas formas y pueden conducir a
la muerte como
es el caso de una infección por C. perfringens o una
intoxicación por toxina botulínica o incluso el
mismo tétanos, en caso de sospecha de cualquiera de estas
enfermedades se debe actuar ante las sospecha y brindar el
tratamiento adecuado, la identificación de la especie
involucrada en la patología así como el
antibiograma respaldan el tratamiento.

BIBLIOGRAFÍA

Murray, Patrick. 1997. Microbiología
médica. 2da Edición. Editorial Harcourt Brace.
Barcelona.  Páginas consultadas: 166-174

Davis, Bernard, Dulbecco Renato, Eisen Herman y Ginsberg
Harold. 1990. Tratado de microbiología. Editorial.
Salvat. Barcelona. Páginas consultadas: 514-519.

Jawetz Ernest. 1990. Microbiología
médica. 13a edición. Editorial El manual moderno.
México.
Páginas consultadas: 188-193

Autor:

Aguilar Franco Alejandra

Baéz Rodríguez Elizabeth

Barajas Calderón Verenice

Chávez Núñez Rafael

González Coronel Luz
Nayeli

González Tamayo Celia Paloma

Urbieta López Jissel

Rodríguez Cruz Liliana