Introducción
Cuando culminé la Licenciatura en Microbiología en 1974, además de
inexperiencia y deseos de descubrir especies bacterianas que
salvaran la humanidad, sentía animadversión a los
hongos, un
mundo para el cual nunca me he sentido preparado. Como la vida se
ensaña con nuestras debilidades, en más de una
ocasión he tenido que sumergirme en temas donde esas
curiosas formas solo nos admiten si jugamos sus reglas. Para esa
partida, en los inicios, solo dispuse de tres armas: Métodos de
Laboratorio en
Microbiología (Harrigan y McCance, 1968); The OXOID
Manual of
Culture Media, Ingredients and other Laboratory Services (OXOID
Limited, 1972) y el Atlas de Diagnóstico Micológico (Zapater,
1973).
En la actualidad existe abundante información sobre metodologías
efectivas para el aislamiento y estudio de estos microorganismos
a partir de casos clínicos y alimentos (Jarvis
y Williams, 1987; King, 1992; Hocking y Pitt, 1992;
Castañeda, 2001). Cuando se trata de aislarlos del
suelo, u otros
medios
naturales, las añejas propuestas que les hago a
continuación pueden resultar útiles; se trata de
variantes implícitas en las fuentes
mencionadas, en otras que pasaron fugazmente por mis manos y,
sobre todo, a los golpes, reveses y modestos éxitos
logrados en más de treinta años tras un microscopio y con
la aguja o el asa en ristre.
Aislamiento de mohos y
levaduras
a) Medios de cultivo
Existen muchos medios de cultivo que propician el crecimiento
de los hongos. En general su pH oscila
alrededor de 5,4. Este pH es muy adecuado una vez que se ha
aislado el hongo, sin embargo, para los aislamientos primarios
deben utilizarse medios de cultivo con un pH menor, sobre todo si
se trata de muestras con presencia de bacterias; un
pH de 3,5 resulta adecuado a tal fin. Deben preferirse aquellos
medios que propicien el crecimiento de la mayoría de los
hongos (Jarvis y Williams, 1987; Pit. 1992; Pit et al.,
1992; Skaar y Sterwing, 1996)
b) Las muestras
El material blando se agita de forma continua, durante 2
minutos, o más, en un matraz con perlas de vidrio, o en una
licuadora durante 30 segundos, o en un homogeneizador
peristáltico durante 1 minuto, empleando como diluyente
una solución de peptona al 0,1% p/v (King, 1992) a la que
se puede añadir 0,05 % de tween 80 p/v (Jarvis y Williams,
1987). El material duro se muele en un molinillo de granos.
También se puede emplear en algunos casos solución
fisiológica, solución reguladora de fosfatos o
agua destilada
con o sin humectante (Hocking y Pitt, 1992).
En los productos
secos, o jugos concentrados, debe evitarse el choque
osmótico. A ese fin, se diluyen con una solución de
sacarosa o glucosa al 20%
p/v. Si se trata de productos salados se emplea un
diluyente con 5% p/v de NaCl. Cuando la muestra tiene
gran cantidad de azúcares y es muy ácida, debe
diluirse (1+1) con solución de peptona al 0,1% p/v y
ajustar el pH a 3,5 – 4,0 (Jarvis y Williams, 1987).
Cuando el interés
radica en aislar mohos, el pH de los medios comerciales
(5,4 o mayores) se puede reducir adicionando ácido
tartárico al 10% (1 mL por cada 100 mL de medio de
cultivo ya estéril y a 50 ºC). Los medios no deben
calentarse luego de esta acidificación pues
provocaría la hidrólisis del agar y, con ello, la
pérdida de sus propiedades gelificantes.
Si en los aislamientos de mohos se desea inhibir el
crecimiento de bacterias esto se logra incorporando al medio de
cultivo Rosa de Bengala, Rosa de
Bengala-Dicloran (0,035 – 0,067 g/L), entre otros, o
antibióticos como Penicilina (50 UI/mL) y Estreptomicina
(100 UI/mL).
Los medios con Rosa de Bengala y Rosa de Bengala-Dicloran es
preciso guardarlos en la oscuridad para evitar la
formación de un compuesto inhibidor por degradación
fotoquímica del colorante. Las soluciones de
Dicloran (2,6 Dicloro 4-Nitroanilina) (Jarvis y Williams, 1987) y
Rosa de Bengala no es necesario esterilizarlas y se conservan
bien en refrigeración.
Un antibiótico muy útil es el Cloranfenicol,
como es termoestable, se puede añadir al medio antes de
esterilizar. Otras variantes termosensibles se agregan
asépticamente al medio estéril fundido, tal es el
caso de la Clortetraciclina (10 mL de solución acuosa al
1% p/v en 1 L de medio).
Una vez efectuada la siembra, los medios se incuban
a 25 ºC durante 5 días (Pitt et
al., 1997). Aunque tales condiciones de incubación son
las sugeridas en la generalidad de los textos, de acuerdo al
área geográfica resultan de utilidad las
recomendaciones de Jarvis y Williams (1987) al respecto de
colocar las placas dentro de una bolsa plástica
acompañada de un recipiente con agua para evitar la
desecación, durante 3 a 7 días a 25 °C en las
regiones subtropicales; a 30 °C en las tropicales, y a 22
°C en las templadas.
Si se desea favorecer el aislamiento de
levaduras se debe alcanzar el pH óptimo mediante
adición de ácido clorhídrico o ácido
fosfórico, no con ácidos
orgánicos pues muchos inhiben el crecimiento de las
levaduras. Se procede de igual forma a como se explicó
para los mohos.
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