Indice
1.
Introducción.
2. Métodos de análisis de
aminoácidos en alimentos.
3. Técnicas de separación
de aminoácidos
4. Reactivos de
derivatización.
5. Derivatización
pre-columna frente a post-columna
6.
Bibliografía.
Los aminoácidos, péptidos y proteínas
son componentes importantes de los alimentos. Por un
lado proporcionan los elementos necesarios para la síntesis
proteica. Por otro lado, los aminoácidos y péptidos
contribuyen directamente al sabor de los alimentos y son
precursores de los componentes aromáticos y las sustancias
coloreadas que se forman mediante las reacciones térmicas
y/o enzimáticas que ocurren durante la obtención,
preparación y almacenamiento de
los mismos.
Aminoácido. Los aminoácidos son ácidos
carboxílicos que contienen un grupo amino.
Existen unos cien en la naturaleza. En el
hidrolizado total de las proteínas
existen veinte aminoácidos que tienen, con algunas
excepciones, la fórmula general siguiente:
R-CH-COOH
NH2
En el caso más sencillo, el radical R es un
átomo
de Hidrógeno (ácido aminoacético o glicina),
en los demás aminoácidos R es un resto
alifático, aromático o heterocíclico, que
puede ser portador de otros grupos
funcionales.
Existen diez aminoácidos, denominados aminoácidos
esenciales, que el organismo es incapaz de sintetizar y que deben
ser aportados por la alimentación. El
organismo no los puede sintetizar porque carece del mecanismo
necesario para elaborar los cetoácidos correspondientes;
se ha comprobado que si se le suministran éstos y sales de
amonio es capaz de elaborarlos.
Los aminoácidos constituyentes de las proteínas
son, aproximadamente, veinte: alanina, arginina, asparagina,
ácido aspártico,
cisteína, ácido glutámico, glutamina,
glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano,
tirosina y valina.
Todos ellos son aminoácidos excepto dos, que son
iminoácidos, la prolina y la hidroxiprolina, que
también pueden considerarse como aminoácidos por su
similitud estructural. Se les llama aminoácidos porque el
grupo amino
está unido al carbono de la
cadena que es, por convenio, el átomo de
carbono
adyacente al grupo carboxilo.
Los aminoácidos contienen tantos grupos ácidos
como básicos, por lo que tienen propiedades ácidas
y básicas débiles y se les llama anfolitos. Se
comportan como anfipróticos porque pueden aceptar o donar
electrones. Las moléculas de aminoácidos
transportan una carga negativa y otra positiva, lo que da como
resultado una carga total nula, esta forma se conoce como
"zwitterion" del aminoácido. La carga total transportada
por un aminoácido depende del pH de la
solución y de los valores de
la constante de acidez de los grupos ionizables presentes. Si el
pH es mucho
mayor que el valor de la
constante de un grupo, se libera un protón y la
molécula tendrá una carga negativa, pero si el pH
es menor, tendrá carga positiva. El hecho de que a
diferentes valores de pH
el aminoácido tenga distintas formas y lleve distintas
cargas netas se utiliza en muchos métodos
analíticos, como en la electroforesis y en la cromatografía de intercambio iónico.
El punto iso-iónico de una molécula es el pH
en el que el número de cargas negativas debidas a los
protones perdidos es igual al número de cargas positivas
debidas a los protones ganados, entonces predomina la forma
zwitteriónica. El punto isoeléctrico es el pH en el
que las moléculas no presentan migración
en un campo
eléctrico y puede determinarse experimentalmente por
electroforesis; en los aminoácidos es igual que el punto
iso-iónico.
Un aspecto importante en el análisis de los aminoácidos es el
hecho de que no se pueden detectar en el visible-UV. Existen
varios reactivos que reaccionan con los aminoácidos dando
compuestos coloreados o fluorescentes y que, por tanto, pueden
utilizarse para análisis cualitativos o cuantitativos. Esto
es lo que se denomina derivatización de los
aminoácidos. Los métodos
fluorimétricos tienen muchas ventajas respecto a la
espectrofotometría para el análisis de
aminoácidos.
Necesidades proteicas. Se requiere un criterio para fijar
las necesidades o exigencias en proteínas para el ser
humano. Por ello se establece una "proteína de referencia"
o "patrón".
Conocida la composición en aminoácidos de las
proteínas de los distintos alimentos que se consumen y
cuales han demostrado poseer mayor valor
biológico, a saber: la de la leche, la del
huevo y las de la carne; y teniendo en cuenta la
composición cuali-cuantitativa en aminoácidos, se
ha adoptado dicha "proteína de referencia" o
"patrón".
En la calidad de las
proteínas influye el contenido en aminoácidos
esenciales, y es importante la presencia de "limitantes". En
efecto, se llama así al aminoácido esencial que en
una proteína dada se encuentra en cantidad relativa
más baja con respecto a la proteína patrón
porque limita el aprovechamiento de esa proteína a los
fines biológicos.
Es importante determinar el contenido en aminoácidos, en
conjunto, para estimar el grado de proteólisis
enzimática que ha sufrido el producto,
así como la proporción de cada uno de ellos, como
componentes de la proteína, cuando se desea establecer su
valor biológico.
La determinación de aminoácidos en alimentos
permite extraer algunas conclusiones acerca de su
composición; por ejemplo, la gelatina usada como espesante
se diferencia rápida y sencillamente, de otros
hidrocoloides (grasas vegetales, almidón, etc.), en
función
de su composición aminoacídica.
Objetivos.
En primer lugar recogemos los distintos métodos oficiales
y estándares para el análisis de aminoácidos
en alimentos, encontrados en Métodos Oficiales de
Análisis editados por el Ministerio de Agricultura,
Pesca y
Alimentación (1986) y en Methods of
Analysis of AOAC (1995), así como algunos métodos
recomendados.
Posteriormente, en la discusión, tratamos sobre las
distintas técnicas
de separación (cromatográficas y electroforesis),
del analizador automático de aminoácidos, de los
distintos reactivos derivatizantes y el tipo de detección
apropiada para cada uno, y las ventajas y desventajas de la
derivatización, tanto antes (precolumna) como
después (postcolumna) de la separación.
2. Métodos de
análisis de aminoácidos en
alimentos.
Métodos oficiales.
Determinación de prolina en miel.
Reacción de la prolina con ninhidrina en medio
ácido y posterior determinación a 517 nm de la
absorbancia del compuesto formado.
Preparación de la muestra:
Suponiendo que la miel ya ha sido separada del panel por
escurrimiento a través de un filtro de luz de malla,
optaremos por realizar el siguiente paso, la
homogeneización. Reblandecer la muestra
calentando entre 25-30ºC agitándola al mismo tiempo. Una vez
homogeneizada se calienta a 50ºC al baño María
hasta que se consiga la fusión y
se deja enfriar rápidamente.
Determinación de hidroxiprolina en carnes.
Previa hidrólisis en medio ácido de las
proteínas y oxidación de la hidroxiprolina. El
derivado formado con el p-dimetilaminobenzaldehido se valora
colorimétricamente a 560 nm..
Preparación de la muestra: Primero, se quitan las
diferentes capas protectoras del producto para
poder tomar
una muestra representativa. Se parten trozos de 0,5 – 1 cm y se
cortan dichos trozos en pequeños cubos. Después se
pasan por una trituradora varias veces hasta conseguir una mezcla
homogénea. Se guarda en frascos limpios y secos para
prevenir la pérdida de humedad. Se conserva en refrigeración de forma que evite su
deterioro y cualquier cambio en su
composición.
Métodos estándares.
Determinación de prolina en miel.
Determinación de hidroxiprolina en carnes.
Determinación de aminoácidos en preparados
vitamínicos.
Determinación de lisina en suplementos nutricionales.
Los grupos amino de las proteínas reaccionan con DNFB
dando lugar a los derivados lisina-DNFB. Posteriormente se
produce una hidrólisis ácida y la
determinación en un analizador de aminoácidos de la
lisina.
Determinación de triptófano en
alimentos.
La muestra es hidrolizada en medio básico, seguidamente se
realiza un ajuste de pH. El triptófano es separado por
cromatografía líquida de intercambio
iónico y determinado por un detector UV a 280
nm.
Determinación de aminoácidos sulfurados en
alimentos (metionina y cisteína).
En primer lugar las proteínas son oxidadas con
ácido perfórmico para conseguir ácido
cisteico y metionina sulfonada, luego se realiza una
hidrólisis ácida con HCl. Realizamos una
cromatografía de intercambio iónico
aplicándole un detector que sea capaz de medir a 570
nm.
Métodos recomendados.
Análisis de aminoácidos por HPLC seguido del
método del
fenilisotiocianato.
(Lab. Enzymology and Physical Chemistry of Proteins).
A continuación, incluimos un protocolo
típico del análisis de aminoácidos en
harinas:
– Dejar a reflujo la muestra con HCl 6N durante 24 horas.
Evaporar a sequedad en evaporador rotatorio.
– Añadir agua y
evaporar a sequedad.
– Realizar el examen cromatográfico de una solución
problema al 10% de la muestra tratada en solución – acuosa
de isopropanol a 10%.
– El sistema solvente:
n-butanol/Hac/H2O en proporción 12:3:5.
– Soporte papel Whatman
nº1.
– Longitud del papel 50
cm.
– Método
cromatográfico descendente.
– Duración: 12 horas.
– Solución reveladora: solución acetónica de
ninhidrina al 0.25%.
– Condiciones de revelado: 20 min a 105ºC.
– Comparación frente a muestras puras de clorhidratos de
aminoácidos.
3. Técnicas
de separación de aminoácidos.
A menudo es necesario identificar y cuantificar los
aminoácidos individuales de una mezcla, tanto en estudios
metabólicos como en las investigaciones
de la estructura de
las proteínas.
El uso de la cromatografía en capa fina o de la
electroforesis son adecuados para averiguar el número y la
cantidad relativa de los diferentes aminoácidos presentes
en una muestra (análisis cualitativo), aunque para los
análisis cuantitativos es necesaria la
cromatografía de gases o un
analizador de aminoácidos.
Cromatografía en capa fina.
Una importante aplicación de la cromatografía en
capa fina es la de servir como guía para el desarrollo de
las condiciones óptimas para realizar separaciones por
cromatografía de líquidos en columna. Proporciona
una idea rápida de los aminoácido mayoritarios
existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son
la rapidez y el bajo coste de los ensayos
experimentales. De hecho, algunos cromatografistas son de la
opinión de que los ensayos en
capa fina deberían preceder siempre al uso de la
columna
En la cromatografía de papel se pueden aplicar grandes
volúmenes de muestra, lo que permite la elución
posterior de un aminoácido en particular para su posterior
purificación y análisis, factor que tiene gran
importancia en la identificación de un constituyente
desconocido de la muestra.
Antes de la realizar la cromatografía, es necesario
eliminar las sustancias que interfieren, tales como
proteínas, carbohidratos
y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio
iónico. Los aminoácidos retenidos pueden eluirse a
continuación añadiendo a la columna un
pequeño volumen de
amoniaco y lavando después con agua
destilada.
La separación de los aminoácidos se basa en que
éstos se reparten de modo diferencial entre la fase
móvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por
el procedimiento
ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa
cromatográfica en el eluyente que será succionado
por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de
la superficie del la placa.
La identificación de un aminoácido se realiza
comparando los valores de
Rf (factor de retraso: cociente entre la distancia
recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia
recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados
como referencia, debiéndose utilizar al menos tres
sistemas de
disolventes distintos para establecer su identidad con
un cierto grado de seguridad.
La naturaleza de los
aminoácidos es un factor importante a la hora de elegir un
disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una
mejor resolución de los componentes ácidos,
básicos o neutros. En general, aumentando la
proporción de agua en el disolvente se incrementan todos
los valores de
Rf e introduciendo pequeñas cantidades de
amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los
aminoácidos básicos. Algunos disolventes contienen
compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso
rutinario. La composición química del
disolvente puede también limitar el rango de reactivos de
localización que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por
ejemplo, el ácido sulfanílico no puede utilizarse
con disolventes fenólicos.
El poder de
resolución de la cromatografía de capa fina puede
aumentarse empleando técnicas bidimensionales, o sea,
utilizando dos disolventes distintos. Se aplica una cantidad de
muestra mayor que la utilizada generalmente para la
separación cromatográfica de una dimensión
(aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa y se
hace correr en una dimensión. Entonces el cromatograma se
seca completamente al aire, se gira un
ángulo de 90º y se desarrolla con el segundo
solvente. Tras un nuevo secado, se sumerge en el reactivo de
localización elegido. En la cromatografía de dos
dimensiones, la composición de los dos disolventes es la
que determina el orden en que debe utilizarse.
Las separaciones bidimensionales permiten la resolución de
un gran número de aminoácidos presentes en una
muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la
primera dimensión se separan en la segunda. Ésto es
muy útil en la detección de los componentes que
están en muy baja concentración y pueden quedar
enmascarados por otros compuestos que tengan una
concentración alta cuando se utiliza la
cromatografía en una dimensión.
Electroforesis.
La electroforesis es un proceso en el
cual las especies cargadas (iones o partículas coloidales)
se separan en función de
su distinta velocidad de
migración en un campo
eléctrico. Desde los años cincuenta, las
separaciones electroforéticas fueron la piedra angular de
gran parte de la investigación de químicos y
biólogos moleculares relacionada con la separación
y análisis de proteínas, polinucleótidos y
otros biopolímeros. Estas separaciones han sido (y
continúan siendo) muy eficientes y de una extensa
aplicación, pero por desgracia, son unas técnicas
muy lentas y laboriosas que tienen tendencia a ser poco
reproducibles.
A mediados de los ochenta, esta situación cambió
espectacularmente con la aparición de aparatos comerciales
para realizar electroforesis analíticas a microescala en
columnas capilares (electroforesis capilar).
El hecho de que los distintos aminoácidos transporten
diferentes cargas netas a un pH particular, permite separarlos de
una mezcla mediante la electroforesis de alto o bajo voltaje. Los
medios
utilizados más frecuentes como soporte son el papel o las
placas de capa fina (celulosa o gel de sílice),
pudiéndose utilizar para visualizar las manchas, los
reactivos de localización que describiremos más
adelante. Las separaciones se pueden realizar más
fácilmente con alto que con bajo voltaje, siendo una de
las principales ventajas de la primera, el que las sales y otras
sustancias presentes en la muestra afectan en menor
extensión la calidad del
electroforetograma.
A pesar de que se pueden conseguir separaciones
electroforéticas con támpones a distintos pH, en la
práctica los valores de pH escogidos están entre 2
y 5’3. A pH 2 todos los aminoácidos tienen carga
positiva y los de tipo básico que tienen la mayor carga
positiva migran más rápidamente hacia el
cátodo, mientras, que a pH 5 los aminoácidos se
dirigen hacia ambos electrodos, dependiendo de la carga
transportada. Las separaciones a pH 5’3 se utilizan para
determinar la naturaleza ácida o básica de un
aminoácido desconocido.
Cromatografía de gases.
Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y
sensibilidad que ofrece la cromatografía de gases, pero
aunque se han realizado considerables progresos en el desarrollo de
tales métodos, aún no se utiliza de forma rutinaria
para el análisis de aminoácidos en muestras
biológicas. La razón de ésto radica en el
hecho de que los aminoácidos, aunque similares, son
compuestos químicamente heterogéneos y
además no son suficientemente volátiles a menos que
se conviertan en algún derivado apropiado. Aparecen
dificultades no sólo a la hora de elegir el método
de obtención de tales derivados, sino también en la
selección de una fase estacionaria que sea
capaz de resolver los derivados de todos los elementos de un
grupo tan diverso de compuestos. A lo hora de elegir el detector
aparecen también problemas
similares.
Analizador automático de aminoácidos –
HPLC.
Existen dos técnicas para la determinación de
aminoácidos a través de cromatografía
líquida: cromatografía de reparto en fase reversa y
cromatografía de intercambio iónico.
La cromatografía de líquidos de alta
resolución es la técnica de separación
más ampliamente utilizada. Las razones más
importantes son su sensibilidad, su fácil
adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su
idoneidad para la separación de especies no
volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran
aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en
la industria, en
muchos campos de la ciencia y
para la sociedad en
general. Algunos ejemplos de estos materiales
incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos
nucleicos y otros.
Cromatografía de reparto en fase reversa.
La cromatografía en fase reversa consiste en un disolvente
fundamentalmente polar como fase móvil y una cadena
hidrocarbonada ligada como fase estacionaria. Algunas de las
ventajas más sustanciales de esta alternativa son su gran
reproducibilidad, tiempos de retención cortos, velocidad
de muestreo alta,
sistema
cromatográfico simple y amplio campo de aplicación.
Por todo ello, las aplicaciones son cada vez más
numerosas.
La selectividad se basa en las interacciones específicas
entre el soluto y la fase móvil, ya sea de tipo polar, de
formación de puentes de hidrógeno o mediante
equilibrios secundarios provocados al variar la
composición de la fase móvil (ácido-base,
formación de complejos o pares iónicos,
adición de complejos metal-ligando o reactivos quirales
para separar los isómeros ópticos,
etc.).
Cromatografía de intercambio iónico.
La cromatografía iónica está relacionada con
los métodos modernos y eficaces para la
determinación de iones que se basan en el uso de resinas
de intercambio iónico.
Existen métodos automatizados para la separación y
detección de aminoácidos y otras especies
iónicas en mezclas
complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empezó a
finales de los años sesenta, pero su aplicación a
la separación por intercambio iónico se retraso
debido a la inexistencia de un método general y sensible
para la detección de especies como los cationes alcalinos
y alcalinotérreos, y aniones como los haluros, acetato y
nitrato. Esta situación se remedió en 1975 al
desarrollarse por técnicos de Dow Chemical Company la
técnica de supresión del efluente, la cual hace
posible la detección conductimétrica de los iones
eluídos. El analizador de aminoácidos, con el que
se lleva a cabo la cuantización de los aminoácidos
se basa en esta técnica.
Analizador automático de aminoácidos. La
separación de aminoácidos fue el primer proceso
cromatográfico automatizado con derivatización
post-columna. La separación fue llevada a cabo por Moore,
Spackman y Stein (1958), mediante un intercambio iónico,
seguido de su cuantización de cada componente eluido de la
columna por reacción con ninhidrina y posterior
detección en el visible. Este método se ha
realizado durante más de treinta años, en cualquier
laboratorio de
proteínas.
El equipo usado actualmente se basa en el original pero
introduciendo algunas modificaciones para conseguir un mejor
grado de eficacia.
Consiste en bombear tampones de pH o de fuerza
iónica variables, a
través de una columna termostatizada. Entre las novedades
está la fabricación de resinas de alta calidad,
desarrollo del HPLC, sistemas de
automatización sofisticados y un aumento en
la sensibilidad de los métodos de
detección.
La separación tiene lugar en una columna de
resina de poliestireno sulfonado. Inicialmente el pH de la fase
móvil es bajo, por lo que los aminoácidos cargados
positivamente se verán atraidos por los grupos sulfurosos
( SO3- ). Conforme se va aumentando el pH
del támpon los aminoácidos se eluyen
diferencialmente al disminuir su carga positiva y ser menos
atraidos por el anión. A pH 3.5 los aminoácidos con
un grupo ácido extra, de su cadena tendrán muy poca
afinidad por la resina y serán los primeros en salir de la
columna, mientras que los que tengan un grupo extra ionizable
capaz de transportar una carga positiva (e.g. lisina, histidina)
serán retenidos fuertemente por la resina y se
eluirán sólo cuando el pH haya aumentado
sustancialmente y se haya reducido su carga neta positiva.
Además del pH también hay que considerar la
concentración del tampón eluyente, pues influye en
la elución de tal modo que cuando la concentración
de ion aumenta en mismo, los aminoácidos se eluyen
más rápidamente.
Las interacciones no iónicas entre los
aminoácidos y la resina también influyen en la
secuencia de elución, permitiendo que algunos
aminoácidos que tienen un comportamiento
similar se eluyan de forma separada.
La resolución cuantitativa de mezclas de
aminoácidos se consigue variando la composición del
támpon, bien incrementando del pH y manteniendo constante
la concentración, o viceversa, o incluso variando ambos.
Hay otros factores menos significativos en la calidad de la
separación como son la temperatura,
la velocidad de flujo del tampón o el tipo de
catión utilizado.
Aspectos prácticos del analizador:
Columna: en los analizadores tipo se usan dos columnas, una para
separar los aminoácidos ácidos y neutros y otra
para los básicos. Las de vidrio o acero inoxidable
dan picos estrechos y altos, mejorando la separación de
aminoácido similares.
Solución tampón: suele ser citrato sódico o
de litio, al que se le añade un detergente, un
antioxidante y un conservante. Actualmente se utilizan dos
disoluciones tampón, una ácida y otra
básica. Se mezclan en proporciones variables para
conseguir un aumento de pH. De esta forma se mejora la
separación disminuyendo el tiempo de
análisis y se eliminan las fluctuaciones bruscas de la
linea base debidas a cambios repentinos en el tampón, como
sucedia con anteriores técnicas.
Temperatura:
puede ser constante para evitar cambios en el pH y en la
ionización de los aminoácidos, o bien puede
utilizarse un programa de
temperaturas que implica un cambio de
ésta en diversos momentos del proceso.
Flujo de la columna: se requiere un flujo de tampón
constante para permitir la reproducibilidad. Se consigue por uso
de bombas de
presión
o de desplazamiento constante.
Detección: es necesaria una segunda bomba para el reactivo
derivatizante (generalmente ninhidrina) que se ha de mezclar con
el eluyente de la columna. Cuando la reacción ha tenido
lugar, la corriente se controla en una célula de
flujo de un colorímetro o un fluorímetro. Se
mide la absorbancia continuamente a 570 y 440 nm. para detectar
los amino e iminoácidos respectivamente.
El análisis aminoacídico es un buen ejemplo del
hecho de que raramente hay un único sistema de
separación para problemas
analíticos, sino que de la elección del sistema
apropiado depende el problema analítico. Por ejemplo, de
la matriz en la
cual los aminoácidos van a ser determinados, de la
sensibilidad deseada y en la velocidad requerida para el
análisis.
Los actuales métodos de detección para
aminoácidos dependen de la reacción del grupo amino
primario del aminoácido para formar un derivado coloreado
o fluorescente, esta derivatización tiene lugar tanto
antes como después de que la separación de los
aminoácidos haya sido efectuada. La menor variedad de
tipos de aminoácidos en comparación con las
estructuras de
los péptidos hace que los modos de HPLC disponibles para
el investigador sean la cromatografía de intercambio
catiónico (CEC), y la cromatografía de fase reversa
(RPC). La cromatografía en fase reversa es más
apropiada para la separación de derivados
aminoacídicos que para aminoácidos libres.
La elección de HPLC está limitada por la
elección del agente de derivatización y/o la
decisión de usar tanto pre- como post-columna de
derivatización, de hecho, algunos de los más
interesantes descubrimientos llevados a cabo en la
separación de aminoácidos por HPLC reside en el
desarrollo y optimización de nuevos agentes de
derivatización. Reacciones muy rápidas como la
derivatización con fluorescamina y ortoftaldehido (OPA)
están siendo empleadas en aumento con el clásico
método de la ninhidrina.
Página siguiente  |