Análisis del contenido aminoacídico de los alimentos con fines nutricionales (página 2)

4. Reactivos de derivatización.

El problema de la derivatización de
aminoácidos está concentrado en la detección
selectiva y sensible de los mismos. Las cantidades de muestra
disponibles son muy pequeñas, ya sean proteínas
cuya estructura
vaya a ser determinada o muestras de investigaciones
en el campo de la ciencia
alimenticia, de modo que la reacción de
derivatización debería permitir la detección
en el rango del pmol.
La derivatización puede ser llevada a cabo antes de la
separación. Debería ocurrir cuantitativamente para
producir productos
sencillos para cada aminoácido, el reactivo no
debería interferir. Es probable que la
derivatización genere productos que
son más parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la
alta selectividad de separación de los sistemas
cromatográficos implica que raramente haya problemas. La
derivatización precolumna puede ser llevada a cabo
automáticamente inmediatamente antes de la
separación.
La derivatización tras la separación requiere, en
general, una complejidad instrumental mayor. Los instrumentos
comerciales a menudo necesitan ser optimizados para alcanzar
sensibilidad de detección más alta.

Ninhidrina.
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con los
aminoácidos en medio ácido (pH entre 3 y
4) y en caliente produciendo amoniaco, dióxido de carbono y un
complejo de color
púrpura azulado. Todos los aminoácidos primarios
forman el mismo complejo tras su reacción con ninhidrina,
haciendo este agente inapropiado para la precolumna de
derivatización. La mayoría de columnas de HPLC de
intercambio catiónico utilizadas para el análisis de aminoácidos con
postcolumna basada en la ninhidrina todavía emplean
resinas de sulfonato de poliestireno/divinilbenceno.
Los primeros sistemas
automáticos para el análisis de aminoácidos descritos en
1958 basados en la separación de aminoácidos por
cromatografía de intercambio
catiónico y posterior reacción con ninhidrina,
permanecen hoy día como la metodología más fiable para el
análisis de aminoácidos en péptidos y
proteínas. Analizadores comerciales basados
en esa metodología están disponibles en
compañías como Beckman y Pharmacia. A altas
temperaturas (³
100ºC), todos los aminoácidos primarios
reaccionan con dos moléculas de ninhidrina para formar un
cromóforo
(púrpura de Ruthermann) con máxima absorción
a 570 nm.
En la cuantificación de los aminoácidos
individuales puede utilizarse el coeficiente de absorción
molar del compuesto coloreado, aunque su valor
varía de un aminoácido a otro y debe determinarse
para las condiciones particulares del análisis. Sin
embargo, se debe escoger un valor de
referencia para utilizarlo en la cuantificación de los
aminoácidos totales de una mezcla.
La reacción coloreada de la ninhidrina se utiliza en
trabajos analíticos, así como en la
visualización de las bandas de los aminoácidos
después de su separación por electroforesis o por
cromatografía. El reactivo que se utiliza
en estas circunstancias se prepara generalmente disuelto en
etanol; cuando se añade 2,4-6colidina, las diferencias de
color entre cada
mancha ayudan a la identificación de los distintos
aminoácidos.

OFtaldehido (OPA).
El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo
a la ninhidrina en la postcolumna de derivatización y
suministró un significante incremento en la sensibilidad.
Los aminoácidos reaccionan con el OPA en presencia de un
reductor fuerte, en condiciones alcalinas (pH 9-11),
dando un compuesto fluorescente. La separación en fase
reversa seguida de detección fluorescente constituye un
método de
detección rápido, sensible y selectivo para todos
los aminoácidos con grupos amino
primario. Los péptidos son menos reactivos que los
-aminoácidos y las aminas secundarias no
reaccionan.
Aunque el OPA fue originalmente aplicado solamente para
postcolumnas de derivatización ahora está
ampliamente usado como un agente para precolumnas. Mientras que
la separación de aminoácidos siguiente a una
precolumna de derivatización está llevada a cabo
por cromatografía de fase reversa, ambas,
cromatografía de fase reversa y cromatografía de
intercambio catiónico pueden ser utilizadas cuando el OPA
es el agente de derivatización en la
postcolumna.

Una desventaja del OPA reside en la relativa
inestabilidad de sus derivados, quizás añadida a
los problemas de
cuantización, aunque ésto no es de gran dificultad
en la técnica de derivatización en postcolumna. Sin
embargo, en precolumna y desde el punto más bajo de pH
7’2 hasta un pH típico de reacción de
9’5, los productos deben ser inmediatamente aplicados a un
sistema
cromatográfico. Bajando estos dos pH se amortigua la
reacción y sirve para estabilizar ligeramente los
productos de reacción. La mayor desventaja del OPA es que
no reacciona con aminas secundarias (prolina e hidroxiprolina)
aunque ésto puede ser solventado con su oxidación
por cloramina-T o hipoclorito. Una estratégica
combinación del uso de OPA con FMOC (9-fluorenilmetil
cloroformato) ha sido recientemente introducida para solucionar
esta deficiencia.

El método con
OPA se utiliza específicamente con precolumna de
derivatización para el análisis de
aminoácidos porque es más sensible y tarda menos
tiempo que
otros métodos
HPLC.

Fluorescamina.
La fluorescamina fue también introducida como una posible
alternativa a la ninhidrina en postcolumnas de
derivatización. Todas las aminas primarias reaccionan con
la fluorescamina en medio básico (pH 9-11) dando un
producto
fluorescente con un incremento en sensibilidad de
detección mayor que la ninhidrina, aunque la fluorescamina
por si misma no tiene fluorescencia. El producto
fluorescente es inestable en disolución acuosa y el
reactivo debe prepararse en acetona. Las aminas secundarias no
reaccionan, a menos que se conviertan previamente en aminas
primarias, lo que puede hacerse con N-clorosuccinimida,
hipoclorito o cloramina-T. Aunque el reactivo tiene interés
por su rápida velocidad de
reacción con los aminoácidos a temperatura
ambiente, la
reacción no es tan sensible como la de la
ninhidrina.

Isotiocianato de fenilo (PITC).
El PITC, también conocido como reactivo de Edman, ha sido
largamente usado para la secuenciación de
polipéptidos y proteínas y fue introducido para el
análisis de aminoácidos al principio de los
años ochenta. Es actualmente, el agente más usado
para precolumnas de derivatización, seguido de
cromatografía en fase reversa, en análisis de
aminoácidos, siendo empleado para mezclas de
aminoácidos de una gran variedad de fuentes.
En lugar de ser analizados como derivados de PTH
(feniltiohidantoin), como ocurre durante la secuenciación
de péptido o proteínas, los aminoácidos son
analizados como derivados de PTC (feniltiocarbamol). Así,
a pH alcalino, los aminoácidos primarios y secundarios
producen derivados de PTC, que pueden ser registrados por
absorbancia UV (240-255 nm) con un límite de
detección en el rango de 5 a 50 pmol. Todos los
aminoácidos forman derivados mono-PTC, excepto lisina y
cisteína, que producen dobles formas PTC. Los productos
son relativamente estables, aunque alguna conversión al
derivado PTH puede ocurrir si el pH no se controla
adecuadamente.
Aunque la metodología PITC puede ser considerada superior
al resto de las técnicas
en un gran número de aspectos, tiene una mayor desventaja
en que algunos derivados PTC de aminoácidos son
fuertemente afectados por la presencia de algunas sales, cationes
divalentes, metales e iones
tampon. Así, mientras el acetato amónico, el
cloruro sódico y el borato sódico se ha encontrado
que no tienen efecto en aminoácidos PTC, otras sales, como
el fosfato de sodio y el bicarbonato de sodio si que lo tienen.
Además la
contaminación por trazas de iones metálicos se
ha encontrado que reduce la formación de
aminoácidos PTC. Incluso añadiendo EDTA se han
conseguido mejores rendimientos para la
derivatización.

Cloruro de dansilo y cloruro de dabsilo.
El cloruro de dansilo (cloruro de
1-dimetilaminonaftaleno-5-sulfonilo) fue inicialmente introducido
para el análisis del nitrógeno terminal de los
aminoácidos en péptidos y proteínas, un
propósito para el cual todavía es empleado.
Reacciona con aminas primarias y secundarias para producir
derivados fluorescentes. Su aplicación adolece de la
presencia de numerosos productos laterales y de la
formación de múltiples derivados de ciertos
aminoácidos. Además de ésto está el
requerimiento de un largo tiempo de
reacción. Así, aunque el cloruro de dansilo es
frecuentemente empleado por lo investigadores para la
derivatización en precolumna seguida de
cromatografía en fase reversa, este método nunca ha
sido ampliamente aceptado para el análisis
automático de aminoácidos.
El cloruro de dabsilo (cloruro de
dimetilaminoazobencenosulfonilo) es un agente muy relacionado con
el cloruro de dansilo. Fue introducido y desarrolla por Chang y
sus colaboradores, para la detección de aminoácidos
en el rango del visible y en el nivel del pmol. Reacciona con
aminoácidos primarios y secundarios para producir
derivados que tienen una gran absorbancia en el rango del
visible. La reacción se realiza a unos 70ºC y un pH
de 8 a 8’5, produciendo derivados altamente estables en 10
o 12 minutos. Se forman mono y bis-derivados de lisina, tirosina
e histidina.

A pesar de las ventajas sobre el cloruro de dansilo como
agente de derivatización, la técnica del cloruro de
dabsilo tiene una tolerancia
limitada a la presencia de sales, y aun no está clara
cómo se vería afectada la detección a altos
niveles de sensibilidad (rango del 10 al 20 pmol) por la
presencia de metales, sales y
otros contaminantes.
Aunque no se usa ampliamente en análisis
automáticos de aminoácidos como la ninhidrina, el
OPA y el PITC, una adaptación comercial del método
del cloruro de dabsilo está disponible en Beckman
Instruments.

Cloruro de 9-Fluoroenilmetil cloroformato (FMOC-Cl).
El FMOC-Cl reacciona con grupos amino para
formar derivados carbamados altamente fluorescentes y estables.
Este agente altamente reactivo, originalmente y todavía
usado como grupo amino
protector en síntesis
de péptidos, fue primeramente aplicado como un agente
derivatizante en precolumna para análisis de
aminoácidos. El FMOC-Cl reacciona con todos los
aminoácidos a pH alcalino y temperatura
ambiente para
producir derivados aminoacídicos altamente estables que
tienen una fluorescencia comparable a los derivados de OPA. Se
pueden formar mono- y bis-derivados con histidina, tirosina y
lisina. Las proporciones relativas de estos derivados
varían en función
del pH y de la proporción de reactivo y
aminoácido.
Durante la reacción con FMOC-Cl, los productos de
hidrólisis del reactivo que se forman tienen fluorescencia
parecida a la de los derivados aminoacídicos. Estos
productos interfieren en la separación por
cromatografía de fase reversa a menos que sean eliminados
por el disolvente orgánico de extracción, antes de
aplicar la muestra a la
columna de cromatografía de fase reversa. Una
versión automatizada de este procedimiento de
derivatización ha sido desarrollada y comercializada.
Betnér y Foldi solucionaron el problema de las
interferencias por la elución de grandes picos de FMOC-Cl
y sus productos de hidrólisis, FMOC-OH, que son
eluídos en la misma región cromatográfica
que muchos de los aminoácidos FMOC, por
derivatización del volumen de exceso
FMOC-Cl con una amina hidrofóbica. El derivado resultante
es eluído más tarde en el cromatograma
después de todos los aminoácidos FMOC.
Una combinación entre OPA/FMOC ha sido descrita, la cual
usa un analizador comercialmente disponible (Hewlett-Packard
Amino Quant). La reacción de aminoácidos primarios
es llevada a cabo inicialmente por OPA, seguida por la
reacción de prolina e hidroxiprolina con FMOC. La
determinación de la fluorescencia para los derivados de
aminoácidos primarios OPA y FMOC-prolina es llevada a cabo
entonces a longitudes de onda apropiadas.

7-cloro y 7-fluro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl
y NBD-F).
Reactivos de derivatización basados en la estructura del
nitrobenzofurazan, NBD-Cl y NBD-F, tienen probada utilidad para
aplicaciones específicas en el análisis de todos
los aminoácidos.
El NBD-Cl fue introducido por Ghosh y por Whitehouse como un
agente fluorigénico para aminas, incluyendo
aminoácidos y posteriormente Rot como una útil
herramienta para el análisis de aminoácidos,
particularmente por su realzada reactividad con aminas
secundarias. Desde entonces, este reactivo ha tenido empleo
ocasionalmente para la detección de aminoácidos,
con particular énfasis en la detección de prolina e
hidroxiprolina. NBD-Cl ha sido aplicado a la
derivatización en pre- y post-columna, con un
límite de detección en éstas últimas
de 1 nmol para prolina e hidroxiprolina y un límite de
detección en las primeras algo menor. Aunque NBD-Cl es
estable y permite una detección sensible de
aminoácidos, reacciona algo más despacio con aminas
y no ha tenido un uso extendido como agente analítico
general para aminoácidos.

NBD-F es más reactivo que su análogo de
cloro, permitiendo una derivatización más
rápida, acompañada de una gran fluorescencia para
prolina e hidroxiprolina. De forma similar al NBD-Cl, el NBD-F ha
sido aplicado tanto a derivatizaciones precolumna como
postcolumna. Los límites de
detección para la precolumna están definidos en el
rango de 5-15 fmol para la mayoría de los
aminoácidos. El NBD-F tampoco ha sido utilizado
ampliamente como método analítico para
aminoácidos, aunque algunos investigadores emplean este
reactivo habitualmente.

Otros reactivos derivados del isotiocianato.
El 4’-N,N-dimetilamino-4-azobencenoisotiocianato (DABITC)
ha sido usado satisfactoriamente en la secuenciación
manual y
análisis de nitrógeno terminal de péptidos y
proteínas. La degradación tipo Edman de
péptidos y proteínas efectuada por este agente
produce derivados tiohidantoin coloreados (DABTH), que pueden ser
separados por cromatografía de fase reversa. El
método de degradación generalmente comprende un
doble acoplamiento, primero con DABITC y luego con PITC. La
4-N,N-dimetilnaftilazobenzeno homologa del DABITC (DANABITC) ha
sido también aplicada con éxito,
aunque en menor grado que el DABITC.
Difenilindenonilisotiocianato (DIITC) ha sido estudiada para ser
utilizada cuando la espectrometría de masas por
ionización química es acoplada
con identificaciones previas por cromatografía de fase
reversa. La detección de derivados de tiohidantoin (DITH)
se lleva a cabo por determinación UV (en el rango por
debajo del pmol). La detección electroquímica es un utensilio
alternativo.
Otros reactivos isotiocianatos de derivatización
precolumna son 4-(t-butiloxicarbonilaminometil)fenil
isotiocianato (BAMPITC, detección fluorescente),
trimetilsisil isotiocianato para análisis de secuencia de
carbono
terminal (detección UV) y p-N,N-dimetilaminofenil
isotiocianato (DMAPI) como una instrumento electroquímico
para el análisis de aminoácidos.

Reactivos mixtos.

Otros reactivos están siendo continuamente
desarrollados y utilizados para detecciones de
aminoácidos. Algunos tienen aplicaciones muy
específicas y limitadas, mientras otros son tratados como
posibles competidores para amplios usos en sistemas
automáticos. Tales reactivos incluyen el ácido
2,4,6-trinitrobencensulfónico (TNBS) y su análogo
2,4-dinitrobenceno (DNBS),
N,N-dietil-2,4-dinitro-5-fluoroanilina,
fluoro-2,4-dinitrobenceno, ácido 1,1-difenilbórico
y 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina amida (reactivo de
Marfey). La detección fluorescente es posible cuando se
emplean reactivos tales como pentano-2,4-diona/formaldehido,
9-antrildiazometano, cloruro laril,
2,3-naftaleno-dicarboxialdehido, succinimida
-naftilcarbamato, 3-benzoil-2quinolina-carboxaldehido,
9-hidroximetilantraceno e isotiocianato fluorescente y 1-naftil
isocianato. Un reactivo quimioluminiscente,
4-isocianatoftalhidrazida, también ha sido investigado.
Con excepción del pentano-2,4-diona/formaldehido, donde el
reactivo fue usado en derivatización postcolumna seguida
de intercambio iónico HPLC de aminoácidos, todos
los demás fueron utilizados para la derivatización
previa de cromatografía de fase reversa.
En la siguiente tabla se pueden comparar las diferentes características de los reactivos de
derivatización más importantes para la
determinación de aminoácidos:

Preparación de las muestras. La
reacción con los derivatizantes forma el mismo
cromóforo con las
aminas primarias que con las secundarias, por tanto las muestras
deben estar libres de sales y lípidos
antes de que tengan lugar la hidrólisis y los pasos de
derivatización. La mayor causa de los bajos rendimientos
en las reacciones de derivatización es la presencia de
contaminantes en la muestra, como son las sales
no-volátiles, detergentes y lípidos.
Las sales y los támpones interfieren tanto en la
hidrólisis como en la posterior derivatización,
distorsionan la cromatografía y añaden picos extra
al cromatograma.
Las sales pueden ser eliminadas de las proteínas y de los
péptidos usando támpones volátiles y HPLC de
fase reversa, precipitación, diálisis o columnas de
filtración de gel.

5. Derivatización
pre-columna frente a post-columna

Las opiniones de investigadores sobre los ventajas
relativas de la derivatización antes o después del
HPLC, de aminoácidos serán determinadas por los
requerimientos de la aplicación específica.
Factores como la sensibilidad requerida en la detección,
cantidad de muestra disponible, tipo de muestra, fuente de
muestra, velocidad de
análisis y reproducibilidad e incluso consideraciones
económicas influirán en la elección entre la
derivatización pre- o post-columna de
aminoácidos.
Derivatización post-columna. La derivatización
siguiendo a una cromatografía de intercambio
catiónico de aminoácidos libres tiene distintas
ventajas, con tal de que la instrumentación produzca velocidades y
temperaturas de reacción reproducibles. Además,
para la derivatización no es necesario proceder al
completo, y los problemas de estabilidad del derivado son
insignificantes. Otras ventajas son que la automatización es fácil y que el
tiempo consumido y la pérdida a causa de la
preparación de la muestra son innecesarias. También
pueden ser usados detectores en serie. Una gran cantidad de
experiencias han sido adquiridas del tradicional método de
intercambio catiónico y tinción con ninhidrina, el
cual ha resultado ser fiable, preciso y capaz de una
separación excelente de mezclas
complejas de aminoácidos y sus metabolitos.

Una desventaja con un sistema HPLC
convencional es que son necesarios instrumentos más
complejos que para el método de pre-columna. La
derivatización post-columna requiere la adición de
una o más bombas para los
disolventes y reactivos derivatizantes. También se
requiere la adición de un reactor post-columna, el cual
llevará a un ensanchamiento de banda adicional, y por
esto, un decrecimiento en la sensibilidad de detección. La
columna de elución es continuamente diluida por el
reactivo derivatizante, provocando un descenso en la sensibilidad
de detección. Así, la máxima sensibilidad
alcanzable por derivatización post-columna será
menor que en el caso de la precolumna.

Derivatización pre-columna. Ésta, acoplada
con cromatografía de fase reversa en lugar de con
cromatografía de intercambio catiónico, fue
originalmente introducida como respuesta al incremento en la
demanda de
mayor sensibilidad y mayor velocidad de análisis. Las
ventajas de la metodología de la derivatización
pre-columna incluyen simplicidad, velocidad y alta sensibilidad.
Por ello, si se requiere máxima sensibilidad de
detección, un reactivo fluorescente combinado con la
derivatización pre-columna es el método más
indicado.
Como desventaja está la necesidad de garantizarse la
completa reacción del reactivo derivatizante y la
posibilidad de interferencia con la separación por exceso
de reactivo, el medio de reacción o la producción de diferentes derivados de un
componente. Además, la estabilidad del derivado puede ser
un importante factor durante la derivatización
pre-columna, la demora entre la derivatización y la
inyección llega a ser fundamental para los resultados
obtenidos.

6. Bibliografía.

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Analítica, Longman Group Limited, 1983.
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Oficiales de Análisis, Ministerio de Agricultura,
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Autor:

Óscar Burriel López
Daniel Salavera Muñoz
Víctor M. Gimeno Gil