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Biosensores de última generación

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Biosensores de última generación

Indice
1. Introducción
2. Diversificación de los biosensores
3. Variaciones en los componentes biológicos y bioquímicos
4. Usos y aplicaciones de los biosensores
5. Bibliografía

1. Introducción

Antiguamente se consideraba que un biosensor era cualquier sonda analizadora que introducida en un medio biológico diera una señal cuantificable. Esto incluye a los electrodos ion selectivo y de pH.
Hoy en día se da otra definición que es "Un biosensor es una herramienta o sistema analítico compuesto por un material biológico inmovilizado (tal como una enzima, anticuerpo, célula entera, orgánulo o combinaciones de los mismos), en íntimo contacto con un sistema transductor adecuado que convierta la señal bioquímica en una señal eléctrica cuantificable".
Algunos de los equipos analíticos cada vez más sofisticados, utilizados para bioanálisis desarrollados en los últimos 20 o 30 años, constituyen un biosensor dependiendo de la definición de transductor, por ejemplo espectrofotómetros IR y UV, fluorímetros, equipos RMN, etc. Sin embargo, los biosensores difieren esencialmente de las técnicas existentes desde al menos tres puntos de vista muy útiles y fundamentales:
En el contacto íntimo del material biológico (tanto si consiste en células enteras, orgánulos, anticuerpos o enzimas) con un transductor que convierte la señal biológica en una señal eléctrica cuantificable.
En su tamaño funcional. La porción sensora de un biosensor es generalmente pequeña y eso permite pequeños tamaños de muestra, una interferencia mínima con los procesos existentes después de la implantación y, por último, el análisis de medios peligrosos o poco accesibles, sin interrumpir el flujo del proceso.
El material biológico puede solucionarse para satisfacer las necesidades analíticas operando a varios niveles de especificidad. Puede ser altamente selectivo, específico para un margen estrecho de compuestos o mostrar un amplío espectro de especificidad. Un ejemplo de tal graduación de especificidad sería un biosensor sensible a un solo antibiótico (tal como la gentamicina) o a todos los amino glucósidos, o bien a todos los antibióticos. Esta flexibilidad de elección del material biológico permite al usuario adaptar el biosensor a la necesidad requerida.

Desarrollo De Los Biosensores
Los primeros biosensores consistían en la unión de electrodos de pH u oxígeno con enzimas inmovilizadas, tal como fueron construidos por Clark y Lyons y Updike y Hicks en los años 60.
La evolución de estos biosensores de tipo electroquímico ha sido revisada extensivamente por Carr y Bowers y varios otros autores.
Generalmente estos dispositivos son, bien del tipo potenciométrico, en el que se mide un potencial (con respuesta logarítmica, de acuerdo a la ecuación clásica de Nerst), o bien del tipo amperiométrico, en el que se registran cambios de intensidad de corriente. En general, la mayoría de los biosensores de electrodo enzimático tienen una respuesta lineal en el rango de 10-3 a 10-4 M, mientras que algunos electrodos responden a concentraciones de sustrato tan bajas como 5·10-7 y/o tan altas como 10-1 M. Normalmente la vida útil de tales biosensores es larga, como mínimo 3-4 semanas (a veces varios meses) y la respuesta es rápida (menos de 60 segundos). En la tabla vemos algunos ejemplos de este tipo de biosensor.

2. Diversificación de los biosensores

Biosensores conductímetricos
El sistema conductimetrico emplea dos pares de pequeños electrodos de conductividad en configuración plana. Entre uno de los pares se coloca una membrana con el enzima que ha sido inmovilizado mientras entre el segundo par se pone una membrana blanco, carente de enzima. El aparato mide la conductividad a través de cada par de electrodos por turno, con una frecuencia fija. En presencia del sustrato enzimático se pueden registrar cambios locales de conductividad en la vecindad de la membrana conteniendo el enzima, los cuales dependen de la concentración del sustrato. Midiendo la diferencia de respuesta entre ambos pares de electrodos se puede compensar la conductividad propia de la muestra biológica, usando los electrodos blanco como referencia.

Biosensores redox
El concepto de un biosensor basado en sistemas redox surgió de la investigación básica llevada a cabo en células de combustible biológico. La clave en la construcción de este tipo de biosensores es facilitar la transferencia de los electrones generados por una enzima óxido-reductasa (o un sistema enzimático) a la superficie del electrodo. Se han demostrado que los intermediarios naturales, como los citocromos, promueven, de hecho, el paso de los electrones, pero uno de los más recientes y más prometedores transportadores de electrones es el ferroceno y sus derivados. El principio de este tipo de biosensores y algunos datos representativos de su respuesta usando diferentes intermediarios redox, tal como han sido obtenidos en el laboratorio, usando glucosa como sustrato, como puede verse en la figura. El tiempo de respuesta de estos biosensores puede ser extremadamente rápido, del orden de segundos. Con el desarrollo de semiconductores orgánicos más eficientes (usualmente por técnicas de doping) podemos esperar ver en el futuro una asociación todavía más íntimas entre la enzima empleada y la superficie del electrodo, que permita una miniaturización a gran escala.

FET’s
Durante los últimos años se han realizado esfuerzos para producir un biosensor electroquímico miniaturizado, usando unos dispositivos electrónicos convencionales llamados transistores de efecto de campo (FET’s), ISFETs (dispositivos ion-selectivos) o CHEMFET (sensores químicos que miden la energía de reacción con moléculas simples). Sin embargo, todavía no se han resuelto los problemas fundamentales en la construcción de este tipo de biosensores. Las tecnologías requeridas de inmovilización y fabricación necesitan un mayor desarrollo. La estabilidad térmica y química del elemento sensible tiene que ser investigada. En concreto, la encapsulación se ha convertido en un problema crucial mientras que las propiedades de conducción de la superficie del material sensor, tal como nitruro de silicio, se han demostrado que son difíciles de superar. Estos "chips" sensores (aproximadamente 30 m m de diámetro) son similares a los usados en los ordenadores excepto que la puerta metálica que controla la corriente del transistor es reemplazada por un material orgánico o biológico. El material sensible responde a un cambio en el medio circundante, bien sea gaseoso o líquido. La respuesta ejerce un efecto de campo sobre la corriente de fuente a sumidero en el FET. Usualmente esta corriente se mantiene constante mientras se registra la tensión de fuera necesaria para lograrlo.

Biosensores tipo termistor
Es una clase interesante de biosensores introducida en los años 70. Utilizan un dispositivo termistor capaz de registrar las pequeñas diferencias de temperatura producidas por las reacciones bioquímicas. A menudo se obtiene una respuesta lineal la temperatura, en el rango de 0.01 a 0.001ºC. Los grupos americanos y suecos fueron pioneros en el análisis térmico enzimático en forma de sondas o sistemas de flujo, pero la miniaturización de los dispositivos todavía es esencial para obtener un biosensor de formato aceptable.

Biosensores optoelectrónicos
Otro nuevo tipo de biosensores, basados en principios ópticos, fue desarrollado alrededor de 1980 por Lowe y sus colaboradores, se le denomino sensor optoelectrónico.
El componente biológico inmovilizado es una enzima ligada a un cromóforo que a su vez está ligado a una membrana. Un cambio de pH generado por la reacción enzimática cambia el color del complejocromóforo/membrana. El sistema transductor consiste en un simple diodo electroluminiscente (LED), con una longitud de onda correspondiente al pico de absorción del cromóforo y un fotodiodo acoplado. La cámara de flujo representada era extremadamente estable y dio una señal muy aceptable.

3. Variaciones en los componentes biológicos y bioquímicos

Principios de bioafinidad
Además de las formas clásicas de biosensores enzimáticos descritas anteriormente ha surgido una nueva forma de biosensor que podríamos llamar sensor por afinidad. Un ejemplo interesante fue presentado por el grupo Aizawa en 1983. Consistía en un sistema biotin-avidina en conjunción con un sistema electrodo. Se podían medir concentraciones de biotina del orden de 10-5 a 10-8 g.mL-1 en un tiempo de un minuto. Otras posibilidades de construcción de biosensores utilizando biosustancias capaces de reconocimiento molecular son:
Lecitinas: compuestos glucídicos;
Receptores hormonales: hormonas;
Receptores de fármacos: fármacos y sus metabolitos activos;
Anticuerpos: antígenos;
Ácidos nucleicos (ADN, ARN): esteroides complementarios (hibridación).

Las ventajas de los sensores por bioafinidad pueden resumirse como sigue:

  1. La medida de la concentración está basada en un equilibrio de unión no en una medida de velocidad. Esto los hace menos sensibles a cambios locales de concentración en el microentorno.
  2. En ocasiones pueden funcionar sin consumir el compuesto medido ni rendir un producto.
  3. Pueden ser miniaturizados para su implantación.
  4. Es posible lograr un alto grado de selectividad usando los receptores adecuados.

El tipo de biosensor por bioafinidad potencialmente más importante es aquel que puede ser utilizado en inmunoensayo.
La intensidad de la señal generada dependerá, en general, de varios factores, pero será proporcional a la cantidad de proteína que pueda ligarse a la superficie para formar una membrana activa de alta densidad; esto es bastante difícil de lograr en la práctica

Biosensores de célula entera
Un campo totalmente diferente en la construcción de biosensores es aquel que utiliza orgánulos o células enteras inmovilizadas. Ejemplos de esta clase de biosensores usados en diferentes aplicaciones comerciales se muestran en la tabla. Estos biosensores son básicamente potenciométricos o amperiométricos, pero tienen una lenta respuesta característica y a menudo responden a un amplio espectro de sustratos.
Los biosensores de célula entera podrán llegar a constituirse en una clase en sí mismos cuando se disponga de células manipuladas genéticamente ex profeso para suministrar una secuencia enzimática determinada o regenerar factores complejos. Estas consideraciones pueden convertirse en un factor de costo a tener en cuenta frente a otros modelos de biosensor.

4. Usos y aplicaciones de los biosensores

Los biosensores pueden ser utilizados ampliamente en el análisis clínico, terapéutica, veterinaria, agricultura, monitorización de procesos industriales y control de polución y medio ambiental. Tienen el atractivo de ser de bajo coste, pequeños, sensibles, y fáciles de usar.

Química clínica, medicina y terapéutica
Biosensores de mesa de tipo electroquímico se encuentran, por supuesto, en servicio rutinario en los laboratorios de bioquímica clínica para determinar glucosa, ácido láctico, etc.
Otra área de la medicina clínica y terapéutica donde los biosensores entrarán con fuerza es la monitorización fuera de las horas de visita. Un ejemplo donde se requiere una monitorización de bolsillo, cómoda para el usuario, es el control de glucosa sanguínea en los diabéticos. La tasa de glucosa en sangre de un diabético insulino-dependiente tiene que determinarse dos o tres veces al día y es vital para la salud del paciente que tal control se realice con precisión. Aparatos de este tipo están siendo desarrollados por varias compañías.
Tal monitorización mejorará la eficacia de los cuidados al paciente reemplazando los laboriosos, y a menudo lentos, sistemas de ensayos actuales. Ello llevará a una práctica clínica más próxima al enfermo, facilitando una rápida toma de decisiones en clínica. Una gran cantidad de sustancias requieren ser controladas en estas situaciones, tales como antígenos, anticuerpos, colesterol, compuestos neuroquímicos, etc., la lista sería enorme.
La aparición de biosensores baratos y fáciles de usar revolucionará la práctica del seguimiento de la terapéutica, permitiendo estudios en mayor profundidad con una base metabólica, seguramente mejorando los tests presentes, principalmente físicos, por ejemplo el caso del diagnostico y monitorización del cáncer.

Veterinaria, agricultura y alimentación
En este campo hay muchas áreas donde ni siquiera se dispone de sistemas de análisis convencionales. La introducción de biosensores adecuados repercutirá con éxito en las siguientes áreas:
Cuidado de animales: Control de la fertilidad y de enfermedades infecciosas.
Industrias lácticas: Leche (proteínas, grasa, anticuerpos, hormonas, vitaminas)
Frutas y verduras: Diagnosis viral y de hongos.
Alimentos: Contaminación y toxinas (Salmonella).
Fermentaciones: Mejora la producción y control de calidad.
Industrias de fermentación, producción farmacéutica
Además de la fermentación alcohólica hay un número considerable y cada vez mayor de sustancias que se están produciendo a escala a partir de cultivos de células eucariotas y procariotas. La monitorización de estos delicados y caros procesos es esencial para reducir y mantener bajos costes de producción. Además, pueden diseñarse biosensores específicos para medir la generación de un producto de fermentación.

El uso de biosensores en los procesos industriales beneficia al fabricante de varias formas:
Un biosensor pude hacerse compatible tanto con el análisis en línea como con el muestreo discretizado.

  1. Proporciona la posibilidad de respuesta rápida y, por lo tanto, un control feedback mejorado.
  2. No interfiere el flujo del proceso.
  3. Un biosensor tiene una vida útil potencial de días, a veces semanas, lo que permite dedicar al personal técnico a otras tareas.
  4. Facilita el muestreo rápido y el rechazo de materias primas por debajo del estandar durante la misma entrega.
  5. Proporciona un método de monitorización de bajo coste para materias primas y productos almacenados.
  6. Proporciona un acceso a medios remotos
  7. Los biosensores pueden hacerse relativamente baratos.

Control de poluciones y medio ambiental
Debido a que pueden ser miniaturizados y automatizados, los biosensores pueden desempeñar muchos papeles en estos
campos.
Un área donde los biosensores de célula entera pueden llegar a ser importantes es el control de aguas, para combatir el creciente número de polucionantes encontrados en las aguas superficiales y, por tanto, en las aguas de bebida. Actualmente aparecen tantos materiales no deseados en las aguas superficiales que el análisis de una única sustancia es insuficiente, se requiere un biosensor de amplio espectro. Este tipo de biosensor, para la determinación de la DBO, ya está en el mercado.
Esta área del desarrollo de biosensores está aumentando progresivamente su interes militar. Por ejemplo, una compañía ha producido un biosensor enzimático para detectar gas nervioso. Con las recientes tendencias hacia el desarrollo de arsenales biológico sofisticados esta área de la investigación en biosensores debe recibir una atención prioritaria.

Una Nueva Generación De Biosensores
Los MIPs ( Polímeros que contienen una memoria molecular impresa) tienen una propiedades únicas que los hacen especialmente sensibles a la tecnología de sensores. Exhiben buenas especificaciones de varios componentes para el interes medico, medioambiental y de industria; y tienen una excelente estabilidad operacional. Sus propiedades reconocidas no son afectadas por ácidos, bases, calor o tratamiento en fase orgánica, haciéndolos altamente aceptables como elementos de reconocimiento en sensores químicos. Durante algunos primeros ensayos los MIPs se usaban en sensores que tenían un papel en medidas ópticas sobre finas capas de vitamina K1 donde estaban impresos polímeros. Otro biosensor incluía la medida de cambios en el potencial eléctrico sobre una columna de HPLC con un polímero específico de fenilalanina, que era tan bueno como los estudios de permeabilidad de membranas de MIP. De todos modos esto no se consideraba como sensores biomemorizados en el estricto sentido.
Se propuso un biosensor real basado en un MIP en 1991. Este fue seguido por el primer ensayo para hacer un sensor biomemorizado basado en la capacidad de medida sobre un transistor de campo-efecto cubierto con un polímero impreso de fenilalanina. Los resultados fueron cualitativos. Una subsecuencia descrita por un sensor de morfina amperométrico mostró resultados cuantitativos, se pudo detectar una concentración de morfina en un rango de 0.1-10m g/mL. También mostró una larga estabilidad térmica, resistencia al duro medioambiente químico.
Otra aproximación basadas en medidas conductimétricas, una señal directa es obtenida de manera obligatoria( debido al aumento de la concentración local) de las especies cargadas positivamente a las cargadas negativamente que están cargadas en el conductímetro. La diferencia en señal entre el sensor y un sensor de referencia correlativo es la concentración del analito. Este tipo de sensor arreglado es útil sólo en matrices bien definidas en las cuales las interferencias causadas por la conductividad de la solución pueden ser controladas. También pueden ser presentadas las medidas de membranas permeables por MIP.
La demostración más convincente de la utilidad de un sensor biomemorizado real basado en la impresión molecular es una fibra óptica en la cual un aminoácido fluorescente derivado (dansyl-l-phenylalanine) liado a las partículas de polímero, resultan en fluorescencia señales que varían en función de los derivados. La selectividad se mostró usando el correspondiente D-enantiomero como control.
Los rápidos desarrollos en electrónica han conducido a microprocesadores que son capaces de usarse en sensores químicos. Tales microprocesadores ofrecen capacidad de procesar señales, y integrar el control con el transductor de manera que se podría minimizar el ruido y resultar una buena actuación como sensor.

Un problema cuando hacían medidas con sensores biomemorizados basados en MIP era el largo tiempo de respuesta ( 15-60 min.). Esta tardanza podría ser minimizada por la optimación de la cinética y la selectividad de los polímeros. Es posible que el uso de grandes polímeros rígidos favorezca la selectividad ( porque el gran barrido de energía de dentro a fuera cambian el analito) y aumenten el tiempo de respuesta. Similarmente, la porosidad de los polímeros aumenta la capacidad de unión de polímeros y el tiempo de respuesta. Usando partículas más pequeñas de polímero o finas láminas de polímero

Podrían aumentar los valores de difusión y la aparente unión cinética dando mayores tiempos de respuesta. Alternativamente, la unión inicial podría ser usada para determinados analitos.

Los biosensores basados en enzimas, en algunos casos, son mostrados para ser superiores en selectividad para la afinidad de los biosensores. Esta tendencia se explica por la conversión del analito, la cual ocurre después del paso de unión inicial en conjunción con el movimiento de la amplificación y hace posible obtener gran sensibilidad en transductores amperométricos que también son menos sensibles a las interferencias no específicas de las uniones. Los sensores biomemorizados contienen polímeros activos catalíticamente debiendo exhibir carazterísticas de sensor, a pesar de todo sólo una actividad catalítica modesta puede ser mostrada. La impresión molecular de sustancias que parece reacciones de transición de estados ha conducido a exhibir polímeros con alguna actividad estereolítica; otros ejemplos de reacciones catalíticas incluyen la b -eliminación de HF de 4-fluoro-4-(p-nitrofenil)-2-butanona.

Los polímeros conductores han sido usados como una selectividad rudimentaria en la partición de fases sobre electrodos y han sido mostrados como retención de memoria aniónica que se usa para el doping. Este efecto ha sido usado amperiométricamente y potenciométricamente y pueden ser correlacionados con los radios iónicos y la carga de los aniones testados. Los materiales exhibidos predeterminadamente para el reconocimiento molecular selectivo en combinación con la conductividad eléctrica se pueden usar en sensores electroquímicos y proveer las bases para una nueva línea de desarrollo de sensores introduciendo una nueva fusión de materiales constituidos e integrados para el reconocimiento de elementos y transductores.

Ha sido presentada la preparación y caracterización de una composición de partículas conteniendo un polímero conductor eléctrico y un MIP para morfina. Las propiedades de reconocimiento molecular específico de morfina no fue alterado significativamente por el proceso de manufacturación, el cual envuelve un rudo tratamiento. Tales partículas fueron inmovilizadas por una simultanea electropolimerización de pyrrole sobre sustratos de sílice recubiertos con oro y los sustratos estudiados por una fuerza atómica microscópica. Estas demostraciones de la composición de partículas pueden ser eléctricamente conectadas al electrodo, obteniendo la integración entre el transductor y los lugares de reconocimiento sin el polímero.
Esta nueva generación de MIP sensores biomemorizados es entre 100 y 1000 veces menos sensible que otros tipos de biosensores. A pesar de todo esto los MIPs tienen cada vez aplicaciones más útiles y probablemente encuentren su lugar en el futuro.

Determinación Enzimática En Inyección En Flujo De Urea En Suero Sanguíneo Usando Un Sensor Potenciométrico De Gas Con Un Ise De Nonactina
La urea es el producto final del metabolismo de las proteínas y aminoácidos humanos y por tanto la medida de su nivel en sangre es un indicador importante del funcionamiento renal.
Niveles elevados aparecen por falta de excreción debida a fallos renales o de aumento de la producción de urea por una mayor ingesta de proteínas en la dieta o un incremento en la degradación de proteínas corporales.

Niveles bajos se pueden encontrar en caso de hígados enfermos.
La urea se puede cuantificar comúnmente con una conversión enzimática de urea a amoniaco en presencia de ureasa y una
posterior medida del amoniaco formado.
El electrodo de membrana sensible a amoniaco basado en el transportador neutro nonactina se usó para el diseño del biosensor de urea y fue aplicado a la determinación de urea en inyección de flujo.
El inconveniente más importante de la determinación de urea en suero sanguíneo era la poca selectividad frente a los iones metálicos básicos. Para la eliminación se usó un sistema de tres electrodos, que permitió diluir hasta obtener un nivel de interferencia constante.
En las medidas en flujo la desventaja se resolvió de distintas maneras. Una de ellas se basa en cubrir el sensor de amoniaco basado en nonactina con una membrana exterior hidrófoba permeable al gas.
Así aparece un límite de detección mejorado en este sensor respecto a un electrodo de vidrio de pH interno.
El concepto de sensor de amoniaco para ensayos biológicos se llegó a emplear hasta para el diseño de un biosensor de urea desechable con ureasa inmovilizada en una membrana polímera externa para la determinación de urea en suero sin estar en flujo.

Resumiendo el procedimiento empleado podemos decir que:
El suero sanguíneo se inyecta diluido en el flujo portador de H2O y solución tampón, llega al reactor donde la ureasa produce la reacción enzimática. Ahora se le añade una corriente de NaOH ( para que el amoniaco no se transforme en ión amonio).
Al llegar al detector el NH3 atraviesa la membrana exterior permeable a gases. Una vez en el interior el NH3 atraviesa la membrana del ISE de triacetato de celulosa (CTA) con nonactina, pudiendo medir ahora el NH3 formado por una simple variación de pH.

5. Bibliografía

L.M. Walker y E.B. Gingold , Biología molecular y brotecnología
Tadeusz Krawczynski vel Krawczyk y Narek Trojanowicz, Talanta
www.pubs.arg.org
www.chemcenter.org
www.chemedia.com

 

 

Autor:


Víctor M. Gimeno Gil

Olga Huera


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