Biosensores de última
generación
Indice
1.
Introducción
2. Diversificación de los
biosensores
3. Variaciones en los componentes
biológicos y bioquímicos
4. Usos y aplicaciones de los
biosensores
5.
Bibliografía
1. Introducción
Antiguamente se consideraba que un biosensor era cualquier
sonda analizadora que introducida en un medio biológico
diera una señal cuantificable. Esto incluye a los
electrodos ion selectivo y de pH.
Hoy en día se da otra definición que es "Un
biosensor es una herramienta o sistema
analítico compuesto por un material biológico
inmovilizado (tal como una enzima, anticuerpo, célula
entera, orgánulo o combinaciones de los mismos), en
íntimo contacto con un sistema
transductor adecuado que convierta la señal bioquímica
en una señal eléctrica cuantificable".
Algunos de los equipos analíticos cada vez más
sofisticados, utilizados para bioanálisis desarrollados en
los últimos 20 o 30 años, constituyen un biosensor
dependiendo de la definición de transductor, por ejemplo
espectrofotómetros IR y UV, fluorímetros, equipos
RMN, etc. Sin embargo, los biosensores difieren esencialmente de
las técnicas
existentes desde al menos tres puntos de vista muy útiles
y fundamentales:
En el contacto íntimo del material biológico (tanto
si consiste en células
enteras, orgánulos, anticuerpos o enzimas) con un
transductor que convierte la señal biológica en una
señal eléctrica cuantificable.
En su tamaño funcional. La porción sensora de un
biosensor es generalmente pequeña y eso permite
pequeños tamaños de muestra, una
interferencia mínima con los procesos
existentes después de la implantación y, por
último, el análisis de medios
peligrosos o poco accesibles, sin interrumpir el flujo del
proceso.
El material biológico puede solucionarse para satisfacer
las necesidades analíticas operando a varios niveles de
especificidad. Puede ser altamente selectivo, específico
para un margen estrecho de compuestos o mostrar un amplío
espectro de especificidad. Un ejemplo de tal graduación de
especificidad sería un biosensor sensible a un solo
antibiótico (tal como la gentamicina) o a todos los amino
glucósidos, o bien a todos los antibióticos. Esta
flexibilidad de elección del material biológico
permite al usuario adaptar el biosensor a la necesidad
requerida.
Desarrollo De Los Biosensores
Los primeros biosensores consistían en la unión de
electrodos de pH u oxígeno
con enzimas
inmovilizadas, tal como fueron construidos por Clark y Lyons y
Updike y Hicks en los años 60.
La evolución de estos biosensores de tipo
electroquímico ha sido revisada extensivamente por Carr y
Bowers y varios otros autores.
Generalmente estos dispositivos son, bien del tipo
potenciométrico, en el que se mide un potencial (con
respuesta logarítmica, de acuerdo a la ecuación
clásica de Nerst), o bien del tipo amperiométrico,
en el que se registran cambios de intensidad de corriente. En
general, la mayoría de los biosensores de electrodo
enzimático tienen una respuesta lineal en el rango de
10-3 a 10-4 M, mientras que algunos
electrodos responden a concentraciones de sustrato tan bajas como
5·10-7 y/o tan altas como 10-1 M.
Normalmente la vida útil de tales biosensores es larga,
como mínimo 3-4 semanas (a veces varios meses) y la
respuesta es rápida (menos de 60 segundos). En la tabla
vemos algunos ejemplos de este tipo de biosensor.
2. Diversificación de
los biosensores
Biosensores conductímetricos
El sistema conductimetrico emplea dos pares de pequeños
electrodos de conductividad en configuración plana. Entre
uno de los pares se coloca una membrana con el enzima que ha sido
inmovilizado mientras entre el segundo par se pone una membrana
blanco, carente de enzima. El aparato mide la conductividad a
través de cada par de electrodos por turno, con una
frecuencia fija. En presencia del sustrato enzimático se
pueden registrar cambios locales de conductividad en la vecindad
de la membrana conteniendo el enzima, los cuales dependen de la
concentración del sustrato. Midiendo la diferencia de
respuesta entre ambos pares de electrodos se puede compensar la
conductividad propia de la muestra
biológica, usando los electrodos blanco como
referencia.
Biosensores redox
El concepto de un
biosensor basado en sistemas redox
surgió de la investigación básica llevada a cabo
en células de
combustible biológico. La clave en la construcción de este tipo de biosensores es
facilitar la transferencia de los electrones generados por una
enzima óxido-reductasa (o un sistema enzimático) a
la superficie del electrodo. Se han demostrado que los
intermediarios naturales, como los citocromos, promueven, de
hecho, el paso de los electrones, pero uno de los más
recientes y más prometedores transportadores de electrones
es el ferroceno y sus derivados. El principio de este tipo de
biosensores y algunos datos
representativos de su respuesta usando diferentes intermediarios
redox, tal como han sido obtenidos en el laboratorio,
usando glucosa como sustrato, como puede verse en la figura. El
tiempo de
respuesta de estos biosensores puede ser extremadamente
rápido, del orden de segundos. Con el desarrollo de
semiconductores orgánicos más
eficientes (usualmente por técnicas
de doping) podemos esperar ver en el futuro una asociación
todavía más íntimas entre la enzima empleada
y la superficie del electrodo, que permita una
miniaturización a gran escala.
FET’s
Durante los últimos años se han realizado esfuerzos
para producir un biosensor electroquímico miniaturizado,
usando unos dispositivos electrónicos convencionales
llamados transistores de
efecto de campo (FET’s), ISFETs (dispositivos
ion-selectivos) o CHEMFET (sensores
químicos que miden la energía de reacción
con moléculas simples). Sin embargo, todavía no se
han resuelto los problemas
fundamentales en la construcción de este tipo de biosensores.
Las tecnologías requeridas de inmovilización y
fabricación necesitan un mayor desarrollo. La
estabilidad térmica y química del elemento
sensible tiene que ser investigada. En concreto, la
encapsulación se ha convertido en un problema crucial
mientras que las propiedades de conducción de la
superficie del material sensor, tal como nitruro de silicio, se
han demostrado que son difíciles de superar. Estos "chips"
sensores
(aproximadamente 30 m
m de diámetro) son similares a los usados en los
ordenadores excepto que la puerta metálica que controla la
corriente del transistor es
reemplazada por un material orgánico o biológico.
El material sensible responde a un cambio en el
medio circundante, bien sea gaseoso o líquido. La
respuesta ejerce un efecto de campo sobre la corriente de fuente
a sumidero en el FET. Usualmente esta corriente se mantiene
constante mientras se registra la tensión de fuera
necesaria para lograrlo.
Biosensores tipo termistor
Es una clase interesante de biosensores introducida en los
años 70. Utilizan un dispositivo termistor capaz de
registrar las pequeñas diferencias de temperatura
producidas por las reacciones bioquímicas. A menudo se
obtiene una respuesta lineal la temperatura,
en el rango de 0.01 a 0.001ºC. Los grupos americanos
y suecos fueron pioneros en el análisis térmico enzimático
en forma de sondas o sistemas de
flujo, pero la miniaturización de los dispositivos
todavía es esencial para obtener un biosensor de formato
aceptable.
Biosensores optoelectrónicos
Otro nuevo tipo de biosensores, basados en principios
ópticos, fue desarrollado alrededor de 1980 por Lowe y sus
colaboradores, se le denomino sensor optoelectrónico.
El componente biológico inmovilizado es una enzima ligada
a un cromóforo que a su vez está
ligado a una membrana. Un cambio de pH
generado por la reacción enzimática cambia el
color del
complejocromóforo/membrana. El sistema
transductor consiste en un simple diodo electroluminiscente
(LED), con una longitud de onda correspondiente al pico de
absorción del cromóforo y un fotodiodo acoplado. La
cámara de flujo representada era extremadamente estable y
dio una señal muy aceptable.
3. Variaciones en los
componentes biológicos y
bioquímicos
Principios de bioafinidad
Además de las formas clásicas de biosensores
enzimáticos descritas anteriormente ha surgido una nueva
forma de biosensor que podríamos llamar sensor por
afinidad. Un ejemplo interesante fue presentado por el grupo Aizawa
en 1983. Consistía en un sistema biotin-avidina en
conjunción con un sistema electrodo. Se podían
medir concentraciones de biotina del orden de 10-5 a 10-8 g.mL-1
en un tiempo de un
minuto. Otras posibilidades de construcción de biosensores
utilizando biosustancias capaces de reconocimiento molecular
son:
Lecitinas: compuestos glucídicos;
Receptores hormonales: hormonas;
Receptores de fármacos: fármacos y sus metabolitos
activos;
Anticuerpos: antígenos;
Ácidos
nucleicos (ADN, ARN):
esteroides complementarios (hibridación).
Las ventajas de los sensores por bioafinidad pueden
resumirse como sigue:
- La medida de la concentración está
basada en un equilibrio
de unión no en una medida de velocidad.
Esto los hace menos sensibles a cambios locales de
concentración en el microentorno. - En ocasiones pueden funcionar sin consumir el
compuesto medido ni rendir un producto. - Pueden ser miniaturizados para su
implantación. - Es posible lograr un alto grado de selectividad
usando los receptores adecuados.
El tipo de biosensor por bioafinidad potencialmente
más importante es aquel que puede ser utilizado en
inmunoensayo.
La intensidad de la señal generada dependerá, en
general, de varios factores, pero será proporcional a la
cantidad de proteína que pueda ligarse a la superficie
para formar una membrana activa de alta densidad; esto es
bastante difícil de lograr en la
práctica
Biosensores de célula
entera
Un campo totalmente diferente en la construcción de
biosensores es aquel que utiliza orgánulos o
células enteras inmovilizadas. Ejemplos de esta clase de
biosensores usados en diferentes aplicaciones comerciales se
muestran en la tabla. Estos biosensores son básicamente
potenciométricos o amperiométricos, pero tienen una
lenta respuesta característica y a menudo responden a un
amplio espectro de sustratos.
Los biosensores de célula entera podrán llegar a
constituirse en una clase en sí mismos cuando se disponga
de células manipuladas genéticamente ex profeso
para suministrar una secuencia enzimática determinada o
regenerar factores complejos. Estas consideraciones pueden
convertirse en un factor de costo a tener en
cuenta frente a otros modelos de
biosensor.
4. Usos y aplicaciones de los
biosensores
Los biosensores pueden ser utilizados ampliamente en el
análisis clínico, terapéutica, veterinaria,
agricultura,
monitorización de procesos
industriales y control de
polución y medio ambiental. Tienen el atractivo de ser de
bajo coste, pequeños, sensibles, y fáciles de
usar.
Química clínica, medicina y
terapéutica
Biosensores de mesa de tipo electroquímico se encuentran,
por supuesto, en servicio
rutinario en los laboratorios de bioquímica
clínica para determinar glucosa, ácido
láctico, etc.
Otra área de la medicina
clínica y terapéutica donde los biosensores
entrarán con fuerza es la
monitorización fuera de las horas de visita. Un ejemplo
donde se requiere una monitorización de bolsillo,
cómoda para el
usuario, es el control de
glucosa sanguínea en los diabéticos. La tasa de
glucosa en sangre de un
diabético insulino-dependiente tiene que determinarse dos
o tres veces al día y es vital para la salud del paciente que tal
control se realice con precisión. Aparatos de este tipo
están siendo desarrollados por varias
compañías.
Tal monitorización mejorará la eficacia de los
cuidados al paciente reemplazando los laboriosos, y a menudo
lentos, sistemas de ensayos
actuales. Ello llevará a una práctica
clínica más próxima al enfermo, facilitando
una rápida toma de
decisiones en clínica. Una gran cantidad de sustancias
requieren ser controladas en estas situaciones, tales como
antígenos, anticuerpos, colesterol, compuestos
neuroquímicos, etc., la lista sería enorme.
La aparición de biosensores baratos y fáciles de
usar revolucionará la práctica del seguimiento de
la terapéutica, permitiendo estudios en mayor profundidad
con una base metabólica, seguramente mejorando los tests
presentes, principalmente físicos, por ejemplo el caso del
diagnostico y monitorización del cáncer.
Veterinaria, agricultura y
alimentación
En este campo hay muchas áreas donde ni siquiera se
dispone de sistemas de análisis convencionales. La
introducción de biosensores adecuados
repercutirá con éxito
en las siguientes áreas:
Cuidado de animales: Control
de la fertilidad y de enfermedades
infecciosas.
Industrias
lácticas: Leche
(proteínas, grasa, anticuerpos, hormonas,
vitaminas)
Frutas y verduras: Diagnosis viral y de hongos.
Alimentos:
Contaminación y toxinas (Salmonella).
Fermentaciones: Mejora la producción y control de
calidad.
Industrias de
fermentación, producción farmacéutica
Además de la fermentación alcohólica hay un
número considerable y cada vez mayor de sustancias que se
están produciendo a escala a partir
de cultivos de células eucariotas y procariotas. La
monitorización de estos delicados y caros procesos es
esencial para reducir y mantener bajos costes de
producción. Además, pueden diseñarse
biosensores específicos para medir la generación de
un producto de
fermentación.
El uso de biosensores en los procesos industriales
beneficia al fabricante de varias formas:
Un biosensor pude hacerse compatible tanto con el análisis
en línea como con el muestreo
discretizado.
- Proporciona la posibilidad de respuesta rápida
y, por lo tanto, un control feedback mejorado. - No interfiere el flujo del proceso.
- Un biosensor tiene una vida útil potencial de
días, a veces semanas, lo que permite dedicar al
personal
técnico a otras tareas. - Facilita el muestreo
rápido y el rechazo de materias primas por debajo del
estandar durante la misma entrega. - Proporciona un método
de monitorización de bajo coste para materias primas y
productos
almacenados. - Proporciona un acceso a medios
remotos - Los biosensores pueden hacerse relativamente
baratos.
Control de poluciones y medio ambiental
Debido a que pueden ser miniaturizados y automatizados, los
biosensores pueden desempeñar muchos papeles en estos
campos.
Un área donde los biosensores de célula entera
pueden llegar a ser importantes es el control de aguas, para
combatir el creciente número de polucionantes encontrados
en las aguas superficiales y, por tanto, en las aguas de bebida.
Actualmente aparecen tantos materiales no
deseados en las aguas superficiales que el análisis de una
única sustancia es insuficiente, se requiere un biosensor
de amplio espectro. Este tipo de biosensor, para la
determinación de la DBO, ya está en el mercado.
Esta área del desarrollo de biosensores está
aumentando progresivamente su interes militar. Por ejemplo, una
compañía ha producido un biosensor
enzimático para detectar gas nervioso. Con
las recientes tendencias hacia el desarrollo de arsenales
biológico sofisticados esta área de la investigación en biosensores debe recibir
una atención prioritaria.
Una Nueva Generación De Biosensores
Los MIPs ( Polímeros que contienen una memoria molecular
impresa) tienen una propiedades únicas que los hacen
especialmente sensibles a la tecnología de
sensores. Exhiben buenas especificaciones de varios componentes
para el interes medico, medioambiental y de industria; y
tienen una excelente estabilidad operacional. Sus propiedades
reconocidas no son afectadas por ácidos,
bases, calor o
tratamiento en fase orgánica, haciéndolos altamente
aceptables como elementos de reconocimiento en sensores
químicos. Durante algunos primeros ensayos los
MIPs se usaban en sensores que tenían un papel en
medidas ópticas sobre finas capas de vitamina K1 donde
estaban impresos polímeros. Otro biosensor incluía
la medida de cambios en el potencial eléctrico sobre una
columna de HPLC con un polímero específico de
fenilalanina, que era tan bueno como los estudios de
permeabilidad de membranas de MIP. De todos modos esto no se
consideraba como sensores biomemorizados en el estricto
sentido.
Se propuso un biosensor real basado en un MIP en 1991. Este fue
seguido por el primer ensayo para
hacer un sensor biomemorizado basado en la capacidad de medida
sobre un transistor de
campo-efecto cubierto con un polímero impreso de
fenilalanina. Los resultados fueron cualitativos. Una
subsecuencia descrita por un sensor de morfina
amperométrico mostró resultados cuantitativos, se
pudo detectar una concentración de morfina en un rango de
0.1-10m g/mL.
También mostró una larga estabilidad
térmica, resistencia al
duro medioambiente químico.
Otra aproximación basadas en medidas
conductimétricas, una señal directa es obtenida de
manera obligatoria( debido al aumento de la concentración
local) de las especies cargadas positivamente a las cargadas
negativamente que están cargadas en el
conductímetro. La diferencia en señal entre el
sensor y un sensor de referencia correlativo es la
concentración del analito. Este tipo de sensor arreglado
es útil sólo en matrices bien
definidas en las cuales las interferencias causadas por la
conductividad de la solución pueden ser controladas.
También pueden ser presentadas las medidas de membranas
permeables por MIP.
La demostración más convincente de la utilidad de un
sensor biomemorizado real basado en la impresión molecular
es una fibra
óptica en la cual un aminoácido fluorescente
derivado (dansyl-l-phenylalanine) liado a las partículas
de polímero, resultan en fluorescencia señales que
varían en función de
los derivados. La selectividad se mostró usando el
correspondiente D-enantiomero como control.
Los rápidos desarrollos en electrónica han conducido a microprocesadores
que son capaces de usarse en sensores químicos. Tales
microprocesadores ofrecen capacidad de procesar
señales, y integrar el control con el transductor de
manera que se podría minimizar el ruido y
resultar una buena actuación como sensor.
Un problema cuando hacían medidas con sensores
biomemorizados basados en MIP era el largo tiempo de respuesta (
15-60 min.). Esta tardanza podría ser minimizada por la
optimación de la cinética y la selectividad de los
polímeros. Es posible que el uso de grandes
polímeros rígidos favorezca la selectividad (
porque el gran barrido de energía de dentro a fuera
cambian el analito) y aumenten el tiempo de respuesta.
Similarmente, la porosidad de los polímeros aumenta la
capacidad de unión de polímeros y el tiempo de
respuesta. Usando partículas más pequeñas de
polímero o finas láminas de
polímero
Podrían aumentar los valores de
difusión y la aparente unión cinética dando
mayores tiempos de respuesta. Alternativamente, la unión
inicial podría ser usada para determinados
analitos.
Los biosensores basados en enzimas, en algunos casos,
son mostrados para ser superiores en selectividad para la
afinidad de los biosensores. Esta tendencia se explica por la
conversión del analito, la cual ocurre después del
paso de unión inicial en conjunción con el movimiento de
la amplificación y hace posible obtener gran sensibilidad
en transductores amperométricos que también son
menos sensibles a las interferencias no específicas de las
uniones. Los sensores biomemorizados contienen polímeros
activos
catalíticamente debiendo exhibir carazterísticas de
sensor, a pesar de todo sólo una actividad
catalítica modesta puede ser mostrada. La impresión
molecular de sustancias que parece reacciones de
transición de estados ha conducido a exhibir
polímeros con alguna actividad estereolítica; otros
ejemplos de reacciones catalíticas incluyen la
b -eliminación
de HF de 4-fluoro-4-(p-nitrofenil)-2-butanona.
Los polímeros conductores han sido usados como
una selectividad rudimentaria en la partición de fases
sobre electrodos y han sido mostrados como retención de
memoria
aniónica que se usa para el doping. Este efecto ha sido
usado amperiométricamente y potenciométricamente y
pueden ser correlacionados con los radios iónicos y la
carga de los aniones testados. Los materiales
exhibidos predeterminadamente para el reconocimiento molecular
selectivo en combinación con la conductividad
eléctrica se pueden usar en sensores
electroquímicos y proveer las bases para una nueva
línea de desarrollo de sensores introduciendo una nueva
fusión
de materiales constituidos e integrados para el reconocimiento de
elementos y transductores.
Ha sido presentada la preparación y
caracterización de una composición de
partículas conteniendo un polímero conductor
eléctrico y un MIP para morfina. Las propiedades de
reconocimiento molecular específico de morfina no fue
alterado significativamente por el proceso de
manufacturación, el cual envuelve un rudo tratamiento.
Tales partículas fueron inmovilizadas por una simultanea
electropolimerización de pyrrole sobre sustratos de
sílice recubiertos con oro y los sustratos estudiados por
una fuerza
atómica microscópica. Estas demostraciones de la
composición de partículas pueden ser
eléctricamente conectadas al electrodo, obteniendo la
integración entre el transductor y los
lugares de reconocimiento sin el polímero.
Esta nueva generación de MIP sensores biomemorizados es
entre 100 y 1000 veces menos sensible que otros tipos de
biosensores. A pesar de todo esto los MIPs tienen cada vez
aplicaciones más útiles y probablemente encuentren
su lugar en el futuro.
Determinación Enzimática En
Inyección En Flujo De Urea En Suero Sanguíneo
Usando Un Sensor Potenciométrico De Gas Con Un Ise De
Nonactina
La urea es el producto final del metabolismo de
las proteínas
y aminoácidos humanos y por tanto la medida de su nivel en
sangre es un
indicador importante del funcionamiento renal.
Niveles elevados aparecen por falta de excreción debida a
fallos renales o de aumento de la producción de urea por
una mayor ingesta de proteínas en la dieta o un incremento
en la degradación de proteínas
corporales.
Niveles bajos se pueden encontrar en caso de
hígados enfermos.
La urea se puede cuantificar comúnmente con una
conversión enzimática de urea a amoniaco en
presencia de ureasa y una
posterior medida del amoniaco formado.
El electrodo de membrana sensible a amoniaco basado en el
transportador neutro nonactina se usó para el diseño
del biosensor de urea y fue aplicado a la determinación de
urea en inyección de flujo.
El inconveniente más importante de la determinación
de urea en suero sanguíneo era la poca selectividad frente
a los iones metálicos básicos. Para la
eliminación se usó un sistema de tres electrodos,
que permitió diluir hasta obtener un nivel de
interferencia constante.
En las medidas en flujo la desventaja se resolvió de
distintas maneras. Una de ellas se basa en cubrir el sensor de
amoniaco basado en nonactina con una membrana exterior
hidrófoba permeable al gas.
Así aparece un límite de detección mejorado
en este sensor respecto a un electrodo de vidrio de pH
interno.
El concepto de
sensor de amoniaco para ensayos biológicos se llegó
a emplear hasta para el diseño
de un biosensor de urea desechable con ureasa inmovilizada en una
membrana polímera externa para la determinación de
urea en suero sin estar en flujo.
Resumiendo el procedimiento
empleado podemos decir que:
El suero sanguíneo se inyecta diluido en el flujo portador
de H2O y solución tampón, llega al
reactor donde la ureasa produce la reacción
enzimática. Ahora se le añade una corriente de NaOH
( para que el amoniaco no se transforme en ión
amonio).
Al llegar al detector el NH3 atraviesa la membrana
exterior permeable a gases. Una vez
en el interior el NH3 atraviesa la membrana del ISE de
triacetato de celulosa (CTA) con nonactina, pudiendo medir ahora
el NH3 formado por una simple variación de
pH.
L.M. Walker y E.B. Gingold , Biología molecular y
brotecnología
Tadeusz Krawczynski vel Krawczyk y Narek Trojanowicz, Talanta
www.pubs.arg.org
www.chemcenter.org
www.chemedia.com
Autor:
Víctor M. Gimeno Gil
Olga Huera