Monografias.com > Biología
Descargar Imprimir Comentar Ver trabajos relacionados

Microscopía




Enviado por gon2002



    Indice
    1.
    Introducción

    2. Tipos de
    microscopios

    3. Microscopia
    electrónica

    1.
    Introducción

    Un microscopio
    simple (de un lente o varios lentes), es un instrumento que
    amplifica una imagen y permite
    la observación de mayores detalles de los
    posibles a simple vista. El microscopio
    más simple es una lente de aumento o un par de
    anteojos.
    El poder de
    resolución del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para
    ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a
    esa distancia.
    El microscopio aumenta la imagen hasta el
    nivel de la retina, para captar la información.
    La resolución depende de la longitud de onda de la fuente
    luminosa, el espesor del espécimen, la calidad de la
    fijación y la
    intensidad de la coloración.
    Teóricamente la máxima resolución que se
    puede alcanzar es de 0,2 um dada por una luz con longitud
    de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible
    por el ojo humano) y con objetos condensadores
    adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero
    no puede aumentar la resolución.
    Existen distintos microscopios ópticos generales y de
    investigación que se diferencian en
    factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la
    alteración física de la luz que incide en
    la muestra y
    procesos
    analíticos que se aplican a la imagen final.

    2. Tipos de
    microscopios

    Microscopio de campo claro – Es descendiente de
    los disponibles a partir de 1800.

    Compuestos por:
    Fuente luminosa que ilumina la muestra
    Condensador que enfoca los rayos de luz sobre la muestra
    Platina sobre la cual se coloca la muestra
    Objetivo que
    recibe la luz que atravesó la muestra
    Ocular que recibe directamente la imagen formada por el
    objetivo
    La muestra a
    observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por la luz.
    Con este tipo de microscopio se deben utilizar métodos de
    tinción porque el campo claro de este no produce un nivel
    útil de contraste.
    Microscopio de contraste de fase – Permite observar
    células
    sin colorear y resulta especialmente útil para células
    vivas.
    Este aprovecha las pequeñas diferencias de los
    índices de refracción en las distintas partes de
    una célula y
    en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por
    regiones de mayor índice de refracción experimenta
    una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz
    principal de ondas de luz que
    pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase
    por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y
    del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de
    fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil
    sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a
    las porciones densas del espécimen; las partes claras de
    la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto
    estos microscopios se utilizan para observar células
    vivas, tejidos vivos y
    cortes semifinos no coloreados.

    Dos modificaciones del microscopio de fase son el
    microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia
    diferencial.
    Microscopio de campo oscuro – El objetivo recibe la luz
    dispersa o refractada por las estructuras
    del espécimen. Para lograrlo, el microscopio de campo
    oscuro está equipado con un condensador especial que
    ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el
    campo visual se observa como un fondo oscuro sobre el cual
    aparecen pequeñas partículas brillantes de la
    muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.
    El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven
    en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una
    habitación oscura. La luz reflejada por las
    partículas de polvo llegan hasta la retina del ojo y las
    hacen visibles.
    La resolución de este microscopio no puede ser mejor que
    la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente
    de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas
    individuales más pequeñas en las imágenes
    de campo oscuro, debido al contraste creado.
    Es útil para observar autorradiografías, cristales
    en la orina y para detectar espiroquetas en particular el
    Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis.
    Microscopio de fluorescencia – Una molécula que
    fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra dentro
    del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de luz
    ultravioleta. Se usa para revelar moléculas fluorescentes
    naturales, como la vitamina A y algunos neurotransmisores. Al ser
    escasas las moléculas autofluorecentes su
    aplicación más difundida es para revelar una
    fluorescencia agregada, como en la detección de
    antígenos o anticuerpos en procedimientos de
    coloración inmunocitoquímica. También se
    puede inyectar moléculas fluorescentes específicas
    en un animal o directamente en células y usarlas como
    marcadores. Estos métodos
    sirvieron para estudiar uniones intercelulares, trayectorias de
    las fibras nerviosas en neurobiología y en
    detección de marcadores del crecimiento fluorescentes en
    tejidos
    mineralizados.

    Se insertan distintos filtros entre la fuente de luz
    ultravioleta y la muestra para producir luz monocromática
    o casi monocromática, o entre el espécimen y el
    objetivo permitiendo que la estrecha banda de longitudes de onda
    de fluorescencia llegue hasta el ojo o incida en una
    emulación fotográfica u otro procedimiento
    analítico.

    Microscopio de barrido confocal – Se usa para
    estudiar la estructura de
    los materiales
    biológicos. Emplea un sistema de
    iluminación con rayo láser que
    es muy convergente y, en consecuencia produce un punto de barrido
    muy poco profundo. La luz que emerge del punto es dirigida a un
    tubo fotomultiplicador, donde es analizada. Se utiliza un
    sistema de
    espejos para mover el rayo láser a
    través del espécimen, iluminando un solo punto por
    vez. Se registran los datos de cada
    punto de la muestra recorrida con este rayo móvil y se
    guardan en una computadora.
    Luego se puede llevar la imagen a un monitor de
    alta resolución. Este método
    tiene la ventaja de que se pueden tomar imágenes
    de la muestra en cortes muy finos. Las regiones fuera de foco se
    restan de la imagen mediante un programa para dar
    una definición máxima a la imagen.

    Es posible también crear imágenes
    múltiples a diferentes profundidades dentro del
    espécimen y realizar reconstrucciones
    tridimensionales.
    Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el
    microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de
    esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz
    ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto
    puede alcanzar una resolución de 0,1 um. La microscopia
    ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un
    espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en
    fotografías. La muestra no se puede observar directamente
    a través del ocular porque la luz ultravioleta puede
    dañar la retina.
    El método
    sirve para detectar ácidos
    nucleicos, proteínas
    que contienen determinados aminoácidos. Mediante
    longitudes de ondas
    específicas para la iluminación se puede obtener
    mediciones espectrofotométricas para cuntificar el DNA y
    el RNA de cada célula.
    Microscopio de polarización – Este microscopio es
    una simple modificación del microscopio óptico,
    contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la
    fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador,
    denominado analizador entre el objetivo y el observador.
    Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia
    entre sus ángulos de rotación se usa para
    determinar el grado en que una estructura
    afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un
    cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz
    polarizada se denomina birrefringencia.
    Exhiben birrefringencia el músculo estriado o
    esquelético y las inclusiones cristaloides de las
    células intersticiales testiculares.

    3. Microscopia
    electrónica

    Dentro de los microscopios electrónico tenemos el
    de barrido y el de transmisión.
    La ventaja de los microscopios electrónicos frente a los
    ópticos esta en que la longitud de onda del haz de luz es
    aproximadamente 1/200, lo cual aumenta la resolución.
    Microscopio electrónico de transmisión – La
    óptica
    es muy similar al óptico pero se diferencia en que usa un
    haz de electrones en vez de un haz de luz visible.

    Este microscopio se basa en los siguientes principios:
    – Una fuente, un filamento de tungsteno calentado que emite
    electrones (cátodo)

    • Un ánodo, hacia el cual son atraídos
      los electrones
    • Una diferencia de potencial entre el cátodo y
      el ánodo imparte un voltaje de aceleración entre
      20.000 y 200.000 voltios a los electrones, que crea la
      haz
    • El haz pasa por una serie de electroimanes que tienen
      las mismas funciones que
      las lentes de vidrio de un
      microscopio óptico

    El condensador forma el haz y modifica el
    diámetro del haz que incide en el plano del
    espécimen. El haz que atraviesa la muestra se coloca en
    foco y se aumenta por medio de un objetivo y se aumenta aun
    más con una o más lentes proyectoras. La imagen
    final se visualiza sobre una planilla cubierta por
    fósforo. Las porciones de la muestra que han sido
    atravesadas por los electrones aparecen brillantes, las porciones
    que absorvieron o esparcieron los electrones por su densidad
    inherente o debido al agregado de metales pesados
    durante la preparación del espécimen aparecen
    oscuras. Se coloca una placa fotográfica o un detector de
    video por
    encima o por debajo de la pantalla del visor, con la finalidad de
    obtener un registro
    permanente de la imagen sobre la pantalla.
    Las muestras se preparan sobre la misma base que la del
    microscopio óptico pero requieren métodos
    más finos.
    Los preparados la restricción que tienen es que en cada
    paso se trabaja con especimenes de magnitud 3-4 órdenes
    menores o más finos que los utilizados para el microscopio
    óptico. Debido a la gran resolución de estos
    microscopios electrónicos la calidad de la
    fijación, es decir el grado de preservación de la
    estructura subcelular debe ser la mejor posible.
    La preparación de rutina de los especimenes para la
    microscopia electrónica de transmisión comienza
    con la fijación con glutaraldehído, seguida de un
    lavado con un buffer y de una fijación con
    tetróxido de osmio.
    Por lo general, se fijan para el microscopio electrónico
    de transmisión piezas de tejido no mayores de 1
    mm3

    El proceso de
    deshidratación es idéntico al empleado en la
    microscopia óptica
    El tejido incluido en material plástico
    se secciona por medio de micrótomos especialmente
    diseñados, que usan cuchillas de diamante.
    Debido al limitado poder de
    penetración de los electrones, el espesor de los cortes
    preparados para el microscopio electrónico de
    transmisión varia entre 50 nm y 150 nm. Estos cortes son
    demasiado finos para poder ser manipulados; se los hace flotar
    desde el filo de la cuchilla en la superficie de una bandeja
    llena de líquido, se recuperan y se colocan en rejillas de
    malla de cobre
    recubiertas por plástico.
    Estas rejillas tienen 50-400 orificios por pulgada o hendiduras
    especiales para observar cortes seriados.
    Por lo general, la coloración de los cortes para
    microscopio electrónico de transmisión se realiza
    por medio del agregado a la muestra de materiales de
    elevada densidad, tales
    como iones de metales pesados.
    Estos iones de metales pesados se unen a los tejidos durante la
    fijación o la deshidratación o al sumergir las
    muestras en soluciones de
    tales iones después del corte. El teróxido de osmio
    que se emplea de rutina en el fijador se une a los componentes
    fosfolipídicos de las membranas, lo cual agraga densidad a
    la membrana.
    A menudo se agrega nitrato de uranilo a las soluciones
    alcohólicas usadas en la deshidratación, con el fin
    de agregar densidad a los componentes de las uniones celulares y
    a otros sitios. La inmersión secuencial en soluciones de
    acetato de uranilo y citrato de plomo se usa rutinariamente para
    teñir los cortes antes de observarlos con microscopio
    electrónico de transmisión.
    La congelación-fractura es un método especial de
    preparación de la muestra para microscopia
    electrónica de transmisión, de gran importancia en
    el estudio de membranas.
    El material a examinar puede estar fijado o no; en el primer caso
    se elimina el fijador del tejido por medio de lavados, antes de
    procesarlo. Se infiltra el tejido con un crioprotector, como el
    glicerol y se congela rápidamente a unos –160 grados
    centígrados.
    Microscopio electrónico de barrido Se
    asemeja más que al microscopio electrónico de
    transmisión a los tubos de televisión
    de donde deriva la microscopia electrónica. Para analizar
    la mayoría de los tejidos se deja la muestra, se
    deshidrata por desecación de punto crítico, se
    cubre con una película evaporada de oro-carbón, se
    monta en un taco de aluminio y se
    coloca en la cámara de muestras del microscopio. En los
    tejidos mineralizados es posible eliminar todos los tejidos
    blandos con una lejía y analizar las características estructurales del
    mineral.
    Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el
    haz de electrones a través de la superficie un tubo de
    televisión. Los electrones reflejados desde
    la superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la
    superficie son captados por uno o más detectores y
    reprocesados para formar una imagen tridimensional en un
    televisión.
    Se pueden tomar fotografías para registrar los datos o la imagen
    en una cinta de video. Se pueden
    usar otros detectores para medir los rayos X emitidos
    desde la superficie, la catodoluminiscencia de las
    moléculas del tejido por debajo de la superficie y los
    electrones de Auger emitidos en la superficie.
    Muchos microscopios combinan las características de un microscopio
    electrónico de transmisión y de barrido, el cual
    permite microanálisis por rayos X con sonda
    electrónica.
    Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos
    X emitidos cuando el haz de bombardea el corte
    histológico, y mediante analizadores apropiados se
    construye un mapa que muestra la distribución en los cortes de los elementos
    que tienen número atómico mayor de 12, en
    concentración suficiente para producir rayos X en cantidad
    tal que se pueda analizar.

     

     

    Autor:

    gon2002

    Nota al lector: es posible que esta página no contenga todos los componentes del trabajo original (pies de página, avanzadas formulas matemáticas, esquemas o tablas complejas, etc.). Recuerde que para ver el trabajo en su versión original completa, puede descargarlo desde el menú superior.

    Todos los documentos disponibles en este sitio expresan los puntos de vista de sus respectivos autores y no de Monografias.com. El objetivo de Monografias.com es poner el conocimiento a disposición de toda su comunidad. Queda bajo la responsabilidad de cada lector el eventual uso que se le de a esta información. Asimismo, es obligatoria la cita del autor del contenido y de Monografias.com como fuentes de información.

    Categorias
    Newsletter