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Cultivo de cardiomiocitos humanos en terapia celular para el tratamiento de cardiomiopatía isquémica (página 2)




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Es fundamental desarrollar estudios que nos ayuden a determinar cuál es la fuente ideal de células, si es mejor administrar células inmaduras y estimular su diferenciación in vivo o por el contrario es preferible la administración de células comprometidas a una estirpe celular; cómo se deben administrar; cuántas células son necesarias, etc.

Objetivos

  • Extraer cardiomiocitos de pacientes que hayan padecido cuadros clínicos relacionados con Cardiomiopatías Isquémicas, con el objetivo de producir un cultivo de tejido de células cardiacas que posteriormente pueda ser implantado in vivo en el paciente para regenerar el tejido infartado.

  • Caracterizar los medios de cultivo específicos que se necesitan para que las células cardiacas crezcan en las mejores condiciones posibles para su posterior trasplante.

  • Analizar la viabilidad de los cardiomiocitos cultivados a través de métodos de conteo celular y evaluación de tasa de crecimiento.

  • Determinar la capacidad regenerativa del corazón, a partir de la asimilación tisular, de las células cardiacas cultivadas para el tratamiento de infartos e isquemias cardiacas.

  • Utilizar el formato de ·"consentimiento informado" como herramienta para realizar estudios anatomopatológicos y biotecnológicos directamente en humanos, teniendo en cuenta todo tipo de normas legales y bioéticas.

Ubicación del problema a investigar

Las enfermedades cardiovasculares constituyen hoy la primera causa de muerte, siendo las más representativas la cardiopatía isquémica y el infarto agudo de miocardio (IMA) (Bedoya et al, 2004).

La posibilidad de inducir el desarrollo de cardiomiocitos en el corazón adulto se ha considerado una estrategia prometedora en el tratamiento de enfermedades como la insuficiencia cardíaca, la hipertrofia o la cardiopatía isquémica (Tam et al, 1995). Sin embargo, las características específicas de las células cardíacas, y la idea que se ha mantenido a lo largo de muchos años sobre su incapacidad para entrar en el ciclo celular y dividirse de forma activa, han hecho que este enfoque haya sido descartado.

En los modelos animales, la posibilidad de realizar terapia celular utilizando cardiomiocitos ha sido estudiada desde 1993 con la línea AT1 (Koh et al, 1993). Los cardiomiocitos del corazón adulto se consideraron durante mucho tiempo incapaces de replicarse. Por esta razón, los estudios iníciales utilizaron cardiomiocitos de origen embrionario o fetal (Leor et al, 1996). Varios trabajos realizados en ratas, muestran el éxito de los injertos de cardiomiocitos embrionarios en corazones normales o lesionados (Soonpaa et al, 1994).

Existen distintos estudios experimentales que han valorado la utilización de fuentes celulares distintas como forma de regeneración cardíaca (Kessler and Byrne, 1999) entre las que podemos destacar las células madre embrionarias (Kehat et al., 2001), células madre de adulto obtenidas de médula ósea (Orlic et al., 2001; Toma et al., 2002) , células de músculo cardíaco obtenidas fetos (Yokomuro et al., 2001) o células derivadas de músculo esquelético (Taylor et al., 1998) . Clinicamente tan solo se han desarrollado aplicaciones en humanos de células derivadas de músculo esquelético (Menasche et al., 2001).

Existen pocos estudios relacionados con el cultivo celular de cardiomiocitos humanos sanos en pacientes que padezcan enfermedades coronarias severas, de tal forma que se pueda realizar trasplante celular para regeneración de tejido cardiaco muerto; quizás debido a la creencia de la poca actividad mitótica de las células cardiacas, no obstante las investigaciones en animales, parecen mostrar resultados prometedores.

Hipótesis

  • El cultivo celular de cardiomiocitos, es una metodología viable puesto que estas células se mantendrán en crecimiento por un tiempo determinado adecuado para su utilización en terapia de trasplante de tejido.

  • El trasplante de cardiomiocitos cultivados in vitro a tejido cardiaco isquémico responderá positivamente con la regeneración del tejido afectado, dando como resultado una recuperación del paciente.

Marco teórico

  •  Cardiomiopatía Isquémica

Las enfermedades del miocardio constituyen el común denominador de un extensísimo y variado grupo de procesos patológicos que envuelven el miocardio causando un amplio espectro de disfunciones cardíacas (Suárez et al, 2001).

La cardiopatía isquémica es un conjunto de enfermedades del corazón o cardiopatías cuyo origen radica en la incapacidad de las arterias coronarias (coronariopatía) para suministrar el oxígeno necesario a un determinado territorio del músculo cardiaco, lo que dificulta el funcionamiento de éste. Por ello, el corazón enferma debido a la mala función de las arterias coronarias.

La causa más frecuente de la alteración de las arterias coronarias es la arteriosclerosis, es decir el endurecimiento y engrosamiento anormal de la pared de las arterias, que tienden a obstruirse o la aterosclerosis, un tipo de arteriosclerosis que se produce por el depósito de sustancias en el interior del vaso sanguíneo en forma de placas de ateromas que reducen la luz de la arteria, por lo que disminuyen el flujo de sangre que la arteria puede transportar al miocardio. Estas dos situaciones dificultan la llegada de la sangre a las células del corazón, que son muy sensibles a la disminución del aporte de sangre. Así, la cantidad de oxígeno que llega al corazón es insuficiente y se manifiesta la enfermedad coronaria o cardiopatía isquémica.

Como ya ha sido señalado anteriormente en relación a la aterosclerosis, la obstrucción paulatina de las arterias va disminuyendo el riego y en el caso de las arterias coronarias la obstrucción puede pasar inadvertida hasta que se compromete la luz arterial aproximadamente en 70 %, momento en el cual comienza a presentarse el desequilibrio entre la oferta y la demanda de oxígeno por parte del miocardio. Usualmente cuando existe una obstrucción de tal magnitud, la cantidad de sangre que pasa durante el reposo es suficiente para suplir las necesidades metabólicas del área irrigada, pero cuando el sujeto realiza un ejercicio aparece el desequilibrio entre oferta y demanda y con ello aparece la isquemia de la zona tributaria del vaso obstruido. En esta forma se relacionan la obstrucción ateromatosa coronaria y la angina de pecho estable.

La posibilidad de utilizar células madre para regenerar o mejorar la función del corazón isquémico, principalmente después de un infarto, es objeto actualmente de numerosos estudios (Menasché, 2002 & Van der Heyden et al, 2003). Se basan en la utilización de diferentes tipos de progenitores, injertados directamente en el miocardio lesionado o inyectados en la circulación. El objetivo general es que las células trasplantadas, alogénicas o autólogas, se diferencien en miocitos y participen en la mejoría funcional de los ventrículos afectados. Lo ideal es que las células injertadas contribuyan a la contracción sincrónica, integrándose anatómicamente a las fibras miocárdicas preexistentes (Lahagarre et al, 2003).

Existen distintos estudios experimentales que han valorado la utilización de fuentes celulares distintas como forma de regeneración cardiaca (Kessler & Byrne, 1999) entre las que podemos destacar las células madre embrionarias (Kehat et al., 2001), células madre de adulto obtenidas de médula ósea (Orlic et al., 2001; Toma et al., 2002) , células de músculo cardíaco obtenidas fetos (Yokomuro et al., 2001) o células derivadas de músculo esquelético (Taylor et al., 1998) . Clínicamente tan solo se han desarrollado aplicaciones en humanos de células derivadas de músculo esquelético (Menasche et al., 2001).

Los Cultivos Celulares

Potencialmente todas las células son cultivables, pero cada una de ellas presenta peculiaridades y requerimientos específicos (Nardote, 1987). Ello hace que existan numerosos modelos diferenciados de cultivo celular.

Según su estructura, se pueden diferenciar tres grandes grupos de cultivo celular: cultivo de órgano, cultivo de tejido y cultivo de células aisladas. En el cultivo de órgano y de tejido, se mantienen la estructura y función intactas del órgano entero o de una parte del mismo, sin disociar sus células (Kondo, et al 1991). Se dispone así de una población heterogéneo de células que se puede mantener sólo durante un período de tiempo limitado (Douglas et al, 1980).

El cultivo de células aisladas es un sistema biológico que logra la supervivencia fuera del organismo de células independientes, pero capaces de dividirse y mantener sus funciones in vitro. Esta última modalidad se denomina también cultivo en monocapa o suspensión y es la más utilizada habitualmente (Michikawa et al, 1991). Existe también la posibilidad de realizar un cultivo limitado en el tiempo de organelas subcelulares como las mitocondrias, retículo sarcoplasmático y ribosomas.

No todas las células presentan las mismas características dinámicas y de mantenimiento en cultivo (Ham, 1981). Así, existen células sin capacidad de reproducción o división celular que se pueden mantener en medios de cultivo de forma limitada y a las que se denominan células terminales. Tal es el caso de las neuronas o de las células miocárdicas.

Según la fuente de obtención de células, un cultivo se denomina primario si procede directamente del organismo vivo, y secundario cuando se obtiene de la resiembra de otro cultivo. A partir de este punto se puede hablar de líneas celulares, ya que se trata de células que mantienen sus características de una forma constante y homogénea a lo largo del tiempo. Un cultivo puro es el que contiene células de un solo tipo, pero existen también cultivos celulares mixtos, en los que coexisten células de diversos tipos celulares, por ejemplo músculo estriado y nervio (Michikawa et al, 1991).

Si las células proceden de un tejido compacto, deben primero someterse a técnicas de disociación mecánica y/o enzimática que las independicen y faciliten así su contacto entre sí y con la superficie de cultivo. Para la disociación mecánica, se emplean técnicas de microcorte, separación por vibración, centrifugación diferencial o electroforesis (Kaighn et al, 1984). Para la disociación enzimática, se utilizan enzimas proteolíticas (tripsina, colagenasa, pronasa, dispasa) encargadas de romper la matriz intersticial sin causar lesión celular, aunque este último término no siempre se consigue plenamente.

Las células deben mantenerse en unas condiciones ambientales y nutritivas correctas para su subsistencia (Iturralde et al, 1987), para ello se incluyen en un medio de cultivo apropiado. Aun cuando la mayoría de medios de cultivo presentan una composición similar, cada tipo celular tiene unos requerimientos diferenciales (Taúb et al 1990). Por ello, se han desarrollado numerosos medios de cultivo específicos para un determinado tipo celular.

A los medios de cultivo es frecuente añadirles suero con el objeto de mejorar sus características citodinámicas (Sato et al 1975); Además del medio de cultivo, existen diversos aditivos como son los extractos embrionarios, hormonas (corticoides, insulina) y los factores de crecimiento que pueden ayudar a modificar las características de la dinámica de reproducción y diferenciación de las células en cultivo.

Todo el sistema de cultivo debe mantenerse a su vez en condiciones óptimas de temperatura y oxigenación, preservándolo de una posible contaminación. Para ello se utilizan las estufas de cultivo que mantienen unas condiciones ambientales de temperatura, humedad y oxigenación constantes. Para garantizar la estabilidad en el pH celular, se adicionan a los medios de cultivo tampones biológicos (CO3H-, PO4H-, HEPES), junto con un indicador (rojo fenol) que nos marcará cualquier cambio del mismo.

Por sus características biológicas, los cultivos celulares pueden ser contaminados fácilmente por numerosos gérmenes (Cour, 1979). De ellos, la contaminación bacteriana es potencialmente controlable mediante la adición de pequeñas cantidades de antibióticos (penicilina, gentamicina) al medio de cultivo, y la contaminación fúngica mediante la adición de anfotericina B. Sin embargo, muchos autores propugnan la no utilización de antibióticos en el medio ya que pueden interferir en los procesos metabólicos celulares y alterar las condiciones del cultivo (Nardone et al 1987).

El mantenimiento de un ambiente aséptico no se limita a los medios y frascos de cultivo sino que debe extenderse a la habitación donde se realizan los mismos y a todos los pasos intermedios referidos (Freshney et al 1987). La habitación o dependencia donde se realizan los cultivos debe estar aislada del exterior, evitando corrientes de aire y el acceso de partículas de polvo mediante la instalación de aireación controlada y filtrada, con un flujo vertical descendente. La disección del tejido, disociación y cambios de medio deben realizarse siempre en una campana de flujo aéreo laminar vertical que evita la introducción de partículas desde el medio al cultivo. El operador debe equiparse de guantes estériles, mascarilla y además utensilios habituales de una estricta técnica aséptica.

Cultivo Celular de Células Cardiacas

En los modelos animales, la posibilidad de realizar terapia celular utilizando cardiomiocitos ha sido estudiada desde 1993 con la línea AT1 (Koh et al, 1993). Los cardiomiocitos del corazón adulto se consideraron durante mucho tiempo incapaces de replicarse. Por esta razón, los estudios iníciales utilizaron cardiomiocitos de origen embrionario o fetal (Leor et al, 1996). Varios trabajos realizados en ratas, muestran el éxito de los injertos de cardiomiocitos embrionarios en corazones normales o lesionados (Soonpaa et al, 1994).

Varios trabajos estudian la utilización de cardiomiocitos aislados en el período neonatal. Estos cardiomiocitos del recién nacido parecen formar uniones celulares con el miocardio del receptor, pero sufren una muerte celular importante poco tiempo después de injertarse, encontrándose después aislados en un tejido cicatricial (Reinecke et al, 1993). Este fenómeno está relacionado probablemente con los fenómenos inflamatorios y necróticos que ocurren después del infarto. Así, para algunos autores, el trasplante de cardiomiocitos podría ser más eficaz en las miocardiopatías dilatadas (Yoo et al, 200). En cualquier caso, la utilización de cardiomiocitos no adultos plantea problemas éticos mayores y una vía de investigación diferente se desarrolla con la utilización de los cardiomiocitos maduros.

El músculo cardíaco esta compuesto principalmente por células musculares especiales, estroma producido por fibroblastos y vasos. Aunque la utilización de músculo esquelético para regenerar el tejido cardíaco dañado ha demostrado su eficacia, la posibilidad de utilizar células con capacidad de diferenciarse hacia músculo cardíaco tiene teóricamente mayor interés.

Los cardiomiocitos en mitosis representan aproximadamente 14 células/millón en el corazón normal, multiplicándose por 10 en el caso de un infarto agudo de miocardio. Ha sido calculado que en el ventrículo izquierdo de un hombre de 45 años hay aproximadamente 5 x 109 focos de miocitos con un índice mitótico de 14 focos/106 células, lo que significa que 81.000 focos están en mitosis en un momento dado. Las mitosis duran aproximadamente una hora y un número importante de nuevos miocitos son producidos anual mente (Grounds et al, 2002). Como existe también una pérdida progresiva de miocitos, estimada en 6,4 x 106 cardiomiocitos cada año, un turn-over lento de cardiomiocitos se produce probablemente a lo largo de toda la vida.

Aunque el estudio de los corazones post-mortem muestra que la multiplicación de los cardiomiocitos aumenta significativamente después del infarto (18), desde un punto de vista clínico esta proliferación parece incapaz de restaurar el músculo dañado (Rosenthal et al, 2001). Sin embargo, la identificación de una población de cardiomiocitos que proliferan en el corazón adulto, abre la posibilidad de estimularlos in vivo o aislarlos y multiplicarlos ex vivo para trasplantarlos en las regiones infartadas (Reinlib et al, 2000 & Li RK et al, 2000). Varios estudios están en fase de realización para determinar con precisión los mecanismos celulares y secretores que regulan la multiplicación de los cardiomiocitos desde el nacimiento.

Bibliografía

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  • -Kessler, P. D., and Byrne, B. J. (1999). Myoblast cell grafting into heart muscle: cellular biology and potential applications. Annu Rev Physiol 61, 219-42.

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  • Soonpaa MH, Koh GY, Klug MG, Field LJ. Formation of nascent intercalated disks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium. Science 1994; 264: 98-101.

 

 

 

 

AUTORES

Andrea de la cadena

Andrés Montes Rojas

Jorge Luis Turriago


Partes: 1, 2


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