Técnicas de la Biotecnología (página 2)

Según esta definición, la
fabricación, entre otros, de pan y cerveza que se
basa en el empleo de
células
de levadura es un proceso
biotecnológico.

La diferencia aportada por la biotecnología moderna es que actualmente
el hombre no
sólo sabe cómo usar las células u organismos
que le ofrece la naturaleza,
sino que ha aprendido a modificarlos y manipularlos en función de
sus necesidades. La biotecnología tal como la conocemos
actualmente empezó en los años 50 con el
descubrimiento por James Watson y Francis Crick de la estructura de
la molécula de ADN*
(ácido desoxirribonucleico) que es donde se almacena la
información genética
(la herencia) en
todos los seres vivos.

En contra de lo que pueda parecer, la
Biotecnología no es un campo nuevo de actividad
empresarial, su desarrollo
puede remontarse a varios miles de años atrás
cuando el hombre
aprendió a producir pan y otros productos como
el queso, la cerveza y el vino.

El hombre lleva varios miles de años
modificando los vegetales que utiliza como alimento. Por ejemplo,
las repollitos de Bruselas, la coliflor y el brócoli son
variedades artificiales de la misma planta (aunque no lo
parezcan). Lo mismo se puede decir de las decenas de variedades
de manzanas, maíz,
papas, trigo, entre otros. Los antecedentes salvajes de muchas de
estas plantas, cuando
existen, son tan poco parecidas que no serían reconocidos
como tales por alguien que no fuera experto.

En cuanto a la "mezcla de especies", el
triticale, un híbrido de trigo y centeno, lleva
décadas prosperando en terrenos de mala calidad
(útiles para centeno, pero no para trigo), pero con
algunas buenas propiedades del trigo, lo que lo hace mucho
más valioso para alimentación
humana.

Sin embargo, la ingeniería
genética permite ahora llevar a cabo, en pocos
años y de forma controlada, lo que antes podía
costar décadas o siglos, o conseguir efectos que
sólo estaban en los sueños de los agricultores,
pero que eran imposibles con las viejas técnicas
de cruce y selección.

La ingeniería genética se
utilizó inicialmente (por su alto coste) para producir
sustancias de usos farmacéutico, como la insulina,
modificando genéticamente microorganismos. Con los
posteriores desarrollos, se obtuvieron también enzimas para uso
industrial, como la quimosina recombinante, utilizada, al igual
que la obtenida de estómagos de terneros jóvenes
(su fuente original, el "cuajo"), para elaborar el queso.
Posteriormente se han obtenido vegetales (y animales)
modificados genéticamente para mejorar sus propiedades.
Los productos de la biotecnología están alrededor
nuestro. El yogurt, la cerveza, el vino y el queso de nuestra
heladera son productos de la biotecnología. Los pickles,
el pan, y el vinagre de nuestra cocina también lo son.
Cientos de años atrás, la gente fue descubriendo,
casi por accidente, cómo hacer uso de los procesos
biológicos que ocurren dentro de las células
vivientes. Sin entender los procesos, podían ver los
resultados. Descubrieron, por ejemplo, que ciertos
microorganismos, como las bacterias y
los hongos
podían producir vinagre, cerveza o vino cuando
crecían en grandes tinas. Estos procesos fueron llamados
fermentación. A través de prueba y
error, aprendieron el control de estos
procesos y a producir grandes cantidades de un amplio rango de
productos.

Los científicos actualmente
comprenden muchos de estos procesos biológicos y
cómo estos ocurren. Esto les ha permitido desarrollar
nuevas técnicas para alterar o copiar algunos de estos
procesos naturales y por lo tanto lograr una amplia variedad de
productos. Algunos, como el queso, son los mismos productos
hechos utilizando la biotecnología tradicional, pero con
los nuevos métodos
son más rápidos, económicos y más
confiables. Otros, como algunos de los nuevos productos
farmacéuticos no pueden ser fabricados con los
métodos antiguos.

Muchas definiciones de biotecnología
han sido discutidas a lo largo de estos años. Algunas de
las que se han mantenido a través de los años
son:"Biotecnología significa la aplicación de
principios
científicos y de ingeniería para el proceso de
materiales a
través de agentes biológicos para obtener bienes y
servicios.
Estos principios cubren una amplia variedad de disciplinas pero
se basa principalmente en microbiología, bioquímica, genética e
ingeniería genética". OECD 1982,
"Biotecnología, Perspectivas y Tendencias
Internacionales"."Biotecnología significa la
aplicación de la ciencia y
de la ingeniería con el uso directo o indirecto de
organismos vivos o partes o productos de organismos vivos en su
forma natural o modificada". Canadian Environmental Protection
Act, 1985.

En este trabajo
tendremos la dura tarea de representar y dar ejemplos de ocho de
las tantas técnicas utilizadas en la biotecnología
en el campo tecnológico y biológico de los cuales
entre otros podemos mencionar: el cultivo de células y
tejidos, el
uso de enzimas y la fermentación microbiana, la tecnología del
hibridoma, la ingeniería de las proteínas
y la genética que es la más conocida por las
personas y la bioinformática; veamos…

Cultivo de
células y tejidos

El cultivo de tejidos fue desarrollado a principios de
siglo XX como un método de
estudio del comportamiento
de las células animales, libres de las variaciones
sistémicas, y mantenidas en condiciones controladas.
Primariamente se limitaba al estudio de las células
capaces de migrar fuera del tejido cultivado. Con el desarrollo
posterior de las técnicas de disgregado celular y de
selección de distintos tipos celulares específicos
fue posible obtener cultivos de células aisladas y
cultivos enriquecidos en determinado tipo celular.

Se denominaron a partir de ese momento de forma
diferente a los distintos tipos de cultivos. El cultivo
órgano-típico implica que se cultiva un trozo de
órgano manteniendo su conformación espacial
característica y sus diversos tipos celulares. El cultivo
histo-típico por otro lado, se caracteriza por la re
asociación de células de alguna forma para asemejar
a la estructura del tejido original.

El cultivo de células es el nombre que se utiliza
para describir el cultivo de células disociadas y
mantenidas directamente sobre la superficie del recipiente de
cultivo.

Ésta es un una poderosa herramienta para el
estudio de ciertos procesos celulares tales como:
replicación y transcripción del ADN, síntesis
proteica, metabolismo
energético, nutrición,
infecciones virales, transformación maligna, acción
de drogas,
toxicidad, secreción de productos especializados, desarrollo
embrionario, etc. Además debe mencionarse la
posibilidad del cultivo de tejidos con fines de
reintroducción reparativa en diferentes patologías
como por ejemplo el Parkinson.

Como ventajas de esta metodología podrían
citarse:

• Control del medio ambiente celular: permite
  mantener a las células bajo condiciones similares a
  las fisiológicas de forma estable, y modificar a su
  vez únicamente las variables de
  interés.

• Caracterización y homogeneidad de la
  muestra: las muestras de tejidos son invariablemente
  heterogéneas, sin embargo generalmente luego de uno o
  dos pasajes, las líneas celulares asumen una
  constitución uniforme al ser mezcladas al azar y al
  actuar las fuerzas selectivas en favor de los tipos celulares
  que se dividen más rápidamente en esas
  condiciones. Se generan así réplicas casi
  idénticas disponibles para protocolos de
  análisis clínicos o de
  investigación.

• Economía y practicidad: los cultivos
  pueden ser expuestos a una concentración menor y
  conocida de cierta sustancia, existiendo un acceso directo a
  las células. Asimismo, en un solo experimento pueden
  realizarse una gran cantidad de duplicados y tratamientos
  distintos, sin tener que recurrir primariamente a grupos de
  animales.

Como desventajas podrían
citarse:

• Experiencia requerida: las técnicas de
  cultivo deben ser llevadas a cabo en condiciones de asepsia
  estrictas, ya que las células animales crecen mucho
  menos rápido que los contaminantes biológicos.
  Además, las células de los metazoos no son
  capaces de vivir de forma aislada fuera del animal, con lo
  cual se requiere un ambiente de cultivo muy complejo, que
  simule el plasma sanguíneo o el fluido
  intersticial.

• In vitro no es in vivo: muchas de las
  diferencias entre el comportamiento de células en
  cultivo e in vivo se generan debido a la disociación
  de las células de su geometría tisular
  tridimensional, y a su propagación en un sustrato que
  no solo es bidimensional sino que carece de muchos de los
  elementos de la matriz extracelular organizada del animal.
  Las interacciones célula-célula, las
  características del tejido se pierden, cambian las
  proporciones relativas de tipos celulares, y el estadio y
  regulación del ciclo celular. Asimismo, el ambiente
  del cultivo carece también de muchos componentes
  sistémicos, involucrados en la homeostasis y en los
  diversos ciclos del animal.

Es posible encontrar muchas más diferencias in
vivo-in vitro, lo cual ha llevado a ver al cultivo de
células con ojos escépticos, sin embargo resulta
innegable que muchas funciones
especializadas son expresadas in vitro, de tal forma que si se
comprenden las limitaciones del modelo puede
transformarse en una herramienta poderosa.

Biología de la
célula en cultivo

Luego del primer sub-cultivo o pasaje, el cultivo
primario se denomina línea celular, y podrá·
ser propagado y sub-cultivado varias veces. Con cada sub-cultivo
sucesivo, las células con una lenta velocidad de
división o con menor resistencia a las
manipulaciones o tratamientos de disgregado se perderán, y
el cultivo ser· cada vez más homogéneo y
estable.

Las líneas celulares pueden ser propagadas de
forma inalterada por un número limitado de generaciones,
luego de lo cual mueren o dan origen a líneas celulares
continuas. La alteración en cultivo dando origen a una
línea celular continua se denomina comúnmente
transformación in vitro, y puede ocurrir
espontáneamente o en forma inducida con agentes
químicos o virus. Sin
embargo, la inmensa mayoría de las células normales
no dan origen a líneas celulares continuas. Un ejemplo
clásico de historia de vida de un
cultivo lo constituyen los fibroblastos humanos, que se mantienen
euploides durante su vida en cultivo, hasta la denominada
crisis del
cultivo (unas 50 generaciones después), deteniendo sus
divisiones y comenzando un período de senescencia
final.

Metodología
del cultivo: técnica aséptica y cámaras de
flujo laminar

• Técnica aséptica.

A pesar de la utilización de antibióticos
en los medios de
cultivo, la
contaminación por microorganismos continúa
siendo uno de los mayores problemas del
cultivo de células. Las bacterias, los mico plasmas, las
levaduras y las esporas de los hongos, pueden ser introducidas
vía el operador, la atmósfera, la
superficie de trabajo, las soluciones,
etc. Una correcta y rigurosa técnica aséptica por
parte del operador, conjuntamente con la utilización de
soluciones y materiales probadamente estériles son
imprescindibles para el mantenimiento
de los cultivos libres de contaminantes
biológicos.

• Cámaras de flujo laminar

La cámara de flujo laminar es un dispositivo que
permite al operador trabajar en condiciones asépticas en
un área bajo un flujo laminar de aire
estéril. Existen tres tipos de cámaras de flujo
laminar. Las cámaras tipo I son utilizadas para la
preparación de soluciones y el trabajo con
microorganismos o cultivos de células animales no humanas
o de primates. Las cámaras de flujo horizontales y
algún tipo de verticales son de esta clase.
Claramente la cámara que ofrece menor seguridad al
operador es la de flujo horizontal, si bien es también la
que posee el flujo de aire más estable y la mejor
protección frente a las infecciones de los cultivos. Las
cámaras de flujo laminar tipo II y III son de flujo
vertical, e incorporan diversas protecciones para el operador y
el medio. Las de tipo III son de máxima seguridad, en
estas el operador no posee contacto directo con los materiales de
trabajo (solo a través de guantes sellados
herméticamente contra la pared delantera de la
cámara), todo el aire que sale de la zona de trabajo es re
filtrado, y todo el material utilizado es auto clavado antes de
entrar y de salir de la cámara. Este tipo de
cámaras son utilizadas para el trabajo con agentes
infecciosos humanos.

Ambiente de cultivo:
sustratos, fase gaseosa, medios de cultivo y propiedades
físicas

La influencia del ambiente de
cultivo sobre las células es ejercida por cuatro
vías principales: (i) naturaleza del sustrato o fase sobre
o dentro de la que crecen las células, (ii) constitución fisicoquímica y
fisiológica del medio de cultivo, (iii)
constitución de la fase gaseosa, y (iv) propiedades
físicas como la temperatura de
incubación.

(i) Sustrato.

La mayoría de las células que han sido
crecidas en cultivo, han sido cultivadas en mono capa sobre
sustratos artificiales, y el crecimiento en suspensión
sólo ha sido posible para ciertos tipos celulares como las
células hematopoyéticas y otros pocos tipos. Es
sabido ya que la mayoría de las células necesitan
adherirse y extenderse sobre el sustrato para poder
dividirse, con lo cual una correcta adherencia al sustrato
resulta fundamental. Actualmente, las placas de cultivo de
polietileno descartables proveen al investigador de una
superficie de cultivo simple y reproducible para el cultivo,
combinado con buenas propiedades ópticas.

Otro sustrato muy utilizado, aunque con fines
específicos, son las bolitas de polietileno, sephadex, o
poliacrilamida, para la propagación de células
anclaje-dependientes en suspensión, amplificando
así enormemente la superficie real de cultivo de un
recipiente, como por ejemplo en el caso de los
bio-reactores.

Las superficies son muy a menudo pre tratadas con por
ejemplo medio de cultivo ya utilizado para el cultivo de otras
células, o sembrando células que luego se remueven
dejando sus secreciones adheridas, proveyendo de esta forma
alguna de los constituyentes normales de la matriz
extracelular del animal entero. También se agregan
directamente a las placas, previo al contacto con las
células, diversas macromoléculas de este tipo tales
como laminina, fibronectina, colágeno, etc. En muchos
casos in vitro, el contacto de la célula
con estas macromoléculas es fundamental para un correcto
crecimiento y expresión de sus características
especializadas.

También se utiliza una mono-capa de
células como acondicionadora del ambiente y como sustrato
vivo para el cultivo de otro tipo celular. Este método no
solo mejora o en algunos casos posibilita el crecimiento y
diferenciación de ciertos tipos celulares en cultivo, sino
que también contribuye a emular las condiciones originales
de ciertos tejidos.

Se han diseñado otros muchos sistemas de
cultivo para requerimientos especiales de determinado tipo
celular, o condición experimental, tal es el caso de un
tipo de recipiente que posee micro-capilares permeables, sobre
los cuales se cultivan las células, y por dentro de los
cuales se hace circular medio de cultivo.

(ii) Fase gaseosa.

Los constituyentes más importantes de esta fase
para el cultivo de células son el O2 y el CO2. Los
cultivos varían en sus requerimientos de oxígeno, tal es el caso de los cultivos
celulares y los cultivos órgano-típicos. Mientras
que tensiones de O2 atmosféricas o menores son preferibles
para la mayoría de los cultivos de células, algunos
cultivos órgano-típicos requieren hasta un 95% de
O2 debido a su escasa difusión.

El CO2 tiene un papel complejo, y es difícil
entender cómo ejerce su efecto debido a sus implicancias
sobre la concentración de O2 disuelto, el pH y la
concentración de HCO3- del medio de cultivo. La
tensión atmosférica de CO2 y la temperatura del
ambiente del cultivo regulan directamente la concentración
de CO2 disuelto en el medio de cultivo. Se regulará
así de forma indirecta el pH del medio de cultivo, ya que
al cultivo se le adiciona también cierta cantidad de
HCO3-, con lo cual se establecerá un equilibrio que
sirve como tampón:

H20 + CO2 ( H2CO3 ( H+ + HCO3- + Na+ (
NaCO3 + H+

Se ajustan las concentraciones de HCO3- y CO2 para fijar
el equilibrio a pH 7,4.

(iii) Medios de cultivo y suplementos.

Con el fin de emular las condiciones in vivo se
desarrollaron medios de cultivo basales tales como el de Eagle, y
medios más complejos como el 199. Sin embargo estos medios
requieren de la suplementación con suero según los
tipos celulares. Para condiciones en las cuales es deseable
eliminar el suero, se desarrollaron medios de cultivo definidos
(de composición conocida) que permiten el correcto
crecimiento de un determinado tipo celular in vitro. Cada tipo
celular tendrá sus propios requerimientos lo cual hace
necesario un cuidadoso análisis de las características del
medio de cultivo que se elige para cada tipo celular.

La base de todo medio de cultivo es una solución
salina balanceada, a la cual se le van adicionando diferentes
componentes para generar un tampón, aminoácidos
esenciales, vitaminas,
trazas de minerales, y
otros metabolitos como piruvato, nucleósidos, lípidos,
etc. Como ya hemos comentado, en la mayoría de los casos
se adiciona además distintas proporciones de suero, cuyo
componente mayoritario son las proteínas tales como
transportadores de minerales, hormonas o
lípidos (albúmina, globulinas, transferrina, etc).
Otros de sus componentes importantes son metabolitos diversos,
nutrientes específicos, factores de crecimiento
polipeptídicos (PDGF, FGF, NGF, etc.), y hormonas
(insulina, hidrocortisona, etc.).

(iv) Propiedades físicas.

La mayoría de las líneas celulares crecen
a pH 7,4. Con el fin de fijar el pH del medio de cultivo en este
valor, se
utiliza un tampón bicarbonato como ya se ha descrito. Este
tampón si bien no tiene una alta capacidad, es muy
aconsejable debido a su baja toxicidad y a que es el principal
sistema de
tampón in vivo. Otro factor importante es la osmolaridad,
que si bien en el plasma humano es aproximadamente 290 mOsm/kg,
en la práctica, en cultivo pueden utilizarse osmolaridades
de entre 260 y 320 mOsm/kg para la mayoría de las
líneas celulares. La temperatura de incubación de
los cultivos se ajusta a la temperatura promedio del animal del
cual proviene el cultivo, para mamíferos debe ser de 37ºC, mientras
que para otros cultivos de origen diferente como en el caso de
insectos o anfibios será distinta. Finalmente, la viscosidad es
otra propiedad
importante del medio de cultivo, que se encuentra principalmente
determinada por los constituyentes del suero.

Uso de enzimas y
fermentación microbiana

Uso de Enzimas:

La utilización empírica de
preparaciones enzimáticas en la elaboración de
alimentos es
muy antigua. El cuajo, por ejemplo, se utiliza en la
elaboración de quesos desde la prehistoria,
mientras que las civilizaciones precolombinas ya utilizaban el
zumo de la papaya. Sin embargo, hasta 1897 no quedó
totalmente demostrado que los efectos asociados a ciertos
materiales biológicos, como el cuajo o las levaduras
pudieran individualizarse en una estructura química definida,
llamada enzima, aislable en principio del organismo vivo global.
Desde hace unas décadas se dispone de enzimas
relativamente puros y con una gran variedad de actividades
susceptibles de utilizarse en la elaboración de alimentos.
Los progresos que están realizando actualmente la
ingeniería genética y la biotecnología
permiten augurar un desarrollo cada vez mayor del uso de los
enzimas, al disponer de un suministro continuo de materiales con
la actividad deseada a precios
razonables. Los enzimas son piezas esenciales en el
funcionamiento de todos los organismos vivos, actuando como
catalizadores de las reacciones de síntesis y
degradación que tienen lugar en ellos. La
utilización de enzimas en los alimentos presenta una serie
de ventajas, además de las de índole
económica o tecnológica. La gran especificidad de
acción que tienen los enzimas hace que no se produzcan
reacciones laterales imprevistas. Así mismo se puede
trabajar en condiciones moderadas, especialmente de temperatura,
lo que evita alteraciones de los componentes más
lábiles del alimento. Desde el punto de vista de la
salud, puede
considerarse que las acciones
enzimáticas son, en último extremo, naturales.
Además los enzimas pueden inactivarse fácilmente
cuando se considere que ya han realizado su misión,
quedando entonces asimilados al resto de las proteínas
presentes en el alimento. Para garantizar la seguridad de su uso
deben tenerse en cuenta no obstante algunas consideraciones: en
aquellos enzimas que sean producidos por microorganismos, estos
no deben ser patógenos ni sintetizar a la vez toxinas,
antibióticos, etc. Los microorganismos ideales son
aquellos que tienen ya una larga tradición de uso en los
alimentos (levaduras de la industria
cervecera, fermentos lácticos, etc.). Además, tanto
los materiales de partida como el procesado y conservación
del producto final
deben ser acordes con las prácticas habituales de la
industria alimentaria por lo que respecta a pureza, ausencia de
contaminantes, higiene, etc.Los
enzimas utilizados dependen de la industria y del tipo de
acción que se desee obtener, siendo éste un campo
en franca expansión. A continuación se mencionan
solamente algunos ejemplos.

• Industrias
  lácteas:

Como se ha indicado, el cuajo del estómago de los
rumiantes es un producto clásico en la elaboración
de quesos, y su empleo está ya citado en la
Ilíada y en la Odisea. Sin
embargo, el cuajo se obtuvo como preparación
enzimática relativamente pura solo en 1879. Está
formado por la mezcla de dos enzimas digestivos (quimosina y
pepsina) y se obtiene del cuajar de las terneras jóvenes.
Estos enzimas rompen la caseína de la leche y
producen su coagulación. Desde los años sesenta se
utilizan también otros enzimas con una acción
semejante obtenidos a partir de microorganismos o de vegetales
Actualmente empieza a ser importante también la lactasa,
un enzima que rompe la lactosa, que es el azúcar
de la leche. Muchas personas no pueden digerir este
azúcar, por lo que la leche les causa trastornos
intestinales. Ya se comercializa leche a la que se le ha
añadido el enzima para eliminar la lactosa.

• Panadería:

En panadería se utiliza la
lipoxidasa, simultáneamente como blanqueante de la harina
y para mejorar su comportamiento en el amasado. La forma en la
que se añade es usualmente como harina de soja o de otras
leguminosas, que la contienen en abundancia. Para facilitar la
acción de la levadura, se añade amilasa,
normalmente en forma de harina de malta, aunque en algunos
países se utilizan enzimas procedentes de mohos ya que la
adición de malta altera algo el color del pan. La
utilización de agentes químicos para el blanqueado
de la harina está prohibida en España.A
veces se utilizan también proteasas para romper la
estructura del gluten y mejorar la plasticidad de la masa. Este
tratamiento es importante en la fabricación de
bizcochos.

• Cervecería:

A principios de este siglo (1911) se
patentó la utilización de la papaína para
fragmentar las proteínas presentes en la cerveza y evitar
que ésta se enturbie durante el almacenamiento o
la refrigeración, y este método
todavía se sigue utilizando. Este enzima se obtiene de la
papaya. Un enzima semejante, la bromelaína, se obtiene de
la piña tropical.Un proceso fundamental de la
fabricación de la cerveza, la rotura del almidón
para formar azúcares sencillos que luego serán
fermentados por las levaduras, lo realizan las amilasas presentes
en la malta, que pueden añadirse procedentes de fuentes
externas, aunque lo usual es lo contrario, que la actividad
propia de la malta permita transformar aun más
almidón del que contiene. Cuando esto es así, las
industrias
cerveceras añaden almidón de patata o de arroz para
aprovechar al máximo la actividad
enzimática.

• Fabricación de zumos:

A veces la pulpa de las frutas hace que los zumos sean
turbios y demasiado viscosos, produciéndose también
ocasionalmente problemas en la extracción y en su eventual
concentración. Esto es debido a la presencia de pectinas,
que pueden destruirse por la acción de enzimas presentes
en el propio zumo o bien por enzimas añadidas obtenidas de
fuentes externas. Esta destrucción requiere la
actuación de varios enzimas distintos, uno de los cuales
produce metanol, que es tóxico, aunque la cantidad
producida no llegue a ser preocupante para la salud.

• Fabricación de glucosa y fructosa a partir
  del maíz:

Una industria en franca expansión es la
obtención de jarabes de glucosa o
fructosa a partir de almidón de maíz. Estos jarabes
se utilizan en la elaboración de bebidas refrescantes,
conservas de frutas, repostería, etc. en lugar del
azúcar de caña o de remolacha. La forma antigua de
obtener estos jarabes, por hidrólisis del almidón
con un ácido, ha sido prácticamente desplazada en
los últimos 15 años por la hidrólisis
enzimática, que permite obtener un jarabe de glucosa de
mucha mayor calidad y a un costo muy
competitivo. De hecho, la CE ha limitado severamente la producción de estos jarabes para evitar el
hundimiento de la industria azucarera clásica. Los enzimas
utilizados son las alfa-amilasas y las amiloglucosidasas. La
glucosa formada puede transformarse luego en fructosa, otro
azúcar más dulce, utilizando el enzima
glucosa-isomerasa, usualmente inmovilizado en un soporte
sólido.

• Otras aplicaciones:

Los enzimas se utilizan en la industria alimentaria de
muchas otras formas, en aplicaciones menos importantes que las
citadas anteriormente. Por ejemplo, en la fabricación de
productos derivados de huevos, las trazas de glucosa presentes,
que podrían oscurecerlos, se eliminan con la acción
combinada de dos enzimas, la glucosa-oxidasa y la catalasa. Por
otra parte, la papaína y bromelaína, enzimas que
rompen las proteínas, se pueden utilizar, fundamentalmente
durante el cocinado doméstico, para ablandar la
carne.Algunas enzimas, como la lactoperoxidasa, podrían
utilizarse en la conservación de productos lácteos.

Fermentación microbiana:

La fermentación microbiana es el uso
de microorganismos para generar un producto de consumo humano
o utilidad veterinaria,
ya sea alterado genéticamente o no. Entre los productos
generados se encuentran: bebidas alcohólicas, enzimas,
comidas y aditivos de comida, vitaminas, vacunas,
antibióticos, etc.Anteriormente las bacterias
habían sido utilizadas para la producción de vino y
antibióticos, cosa que no se ha dejado de hacer. La
utilización de la biotecnología en la
fermentación microbiana empezó en el 1973 con el
gen del African clawed toad que fue insertado en el laboratorio en
la bacteria de Escerichia coli; este fue el primer
experimento de ingeniería genética y con esto
comenzó la era de la tecnología de DNA
recombinante. El primer medicamento generado mediante la
utilización de estas dos técnicas
(fermentación microbiana y DNA recombinante) fue una forma
de insulina.La fermentación microbiana es el método
más aplicado en la biotecnología. La ventaja de la
fermentación microbiana es que al utilizar bacterias y
levaduras estas crecen rápidamente en un medio a bajo
costo, ofrecen una alta expresión de los niveles de la
proteína que deseamos obtener, de las cuales ellos a veces
secretan en el medio y esto hace más fácil la
purificación. También estos microorganismos pueden
resistir fuertes tratamientos comparados con las células
animales. Sin embargo, existen ciertas limitaciones en la
utilización de bacterias y hongos para procesos
industriales ya que no llevan a cabo procesos
post-translacionales como lo es la glicosilación
(bacterias) y muchas veces estos organismos liberan proteasas
junto con la proteína de interés,
también puede haber presencia de endotoxinas en el caso de
las bacterias y muchas veces las bacterias forman cuerpos de
inclusión lo que dificulta la tarea de recolectar el
producto.Entre los principales microorganismos utilizados se
encuentran: E. coli y B. subtilis. E.
coli es el organismo más común como fuente de
producción de proteína recombinante ya que se
conoce su mapa genético. B. subtilis ha sido
utilizado principalmente por su gran tendencia de secretar
proteínas en su ambiente. La fermentación de
bacterias y hongos ofrecen la opción más
económica y algunos criterios la convierten en la
respuesta más obvia.

Aplicaciones:

La fermentación microbiana tiene un sin
número de usos y aplicaciones en la industria hoy
día. Mediante la fermentación microbiana se ha
logrado la elaboración de diferentes productos como lo
son: alimentos, vitaminas, bebidas alcohólicas, productos
farmacéuticos, químicos, combustibles, enzimas,
biomasa, proteínas, entre otros.

Los productos antes mencionados se generan por medio de
diferentes tipos de fermentación. La fermentación
láctica (queso, yogurt), fermentación
alcohólica (vino, cerveza, alcohol,
cigarrillos, chocolate, pan y otros) y la fermentación
acética (vinagre).

Un ejemplo de esta tecnología es la
producción industrial de eritromicina, antibiótico
producido por el actinomiceto gran positivo Saccharopolyspora
erythraea bajo fermentación aeróbica
utilizando aceite de soya
como fuente principal de carbono y
acido propionico como precursor. La producción de
eritromicina es actualmente llevada a cabo en la planta de Abbott
en P.R.

La fermentación microbiana también es un
medio de producción de vitaminas. Entre el grupo de
vitaminas generadas por este medio podemos encontrar las
siguientes: acido ascórbico, riboflavinas, beta-caroteno,
vitamina B12, acido fólico y la pro vitamina A. Las de
mayor importancia a nivel industrial son: riboflavina,
beta-caroteno y vitamina B12.

En sus comienzos la vitamina B12 fue obtenida como un
subproducto de los estreptomicetos en la producción de
estreptomicina. En la actualidad la producción de esta
vitamina es llevada a cabo por varias bacterias entre estas:
Propionibacterium fredenreichii, Propionibacterium
shermani y Pseudomonas denitrificans

La fermentación de riboflavina puede llevarse a
cabo mediante bacterias, hongos o levaduras. Entre los organismos
utilizados: Emerothecium ashbyii y Ashbya
gossypii.

Los rendimientos más altos en la
producción del Beta-caroteno se han obtenido mediante la
fermentación del hongo Blakeslea trispora donde
se emplean ambas formas sexuales (+ y -). Estas dos formas
sexuales no tienen que estar en igual concentración ya que
la encargada verdaderamente de la formación de
beta-caroteno es la cepa negativa.

Con respecto a las bebidas alcohólicas en la
elaboración de vinos también hace uso de esta
técnica. El proceso mediante el cual es producido vino es
el siguiente:

• La elaboración del vino puede
  tener como materia prima cualquier fruta o vegetal con alto
  contenido de azúcares pero se asocia a los vinos de
  calidad con uvas.•La fermentación de estas uvas
  es llevada a cabo por levaduras silvestres (presentes de
  forma natural en las uvas) o por lo general Saccharomyces
  cerevisiae.•Luego de fermentado estas levaduras son
  separadas del vino por sedimentación.•El vino se
  añeja.

Como han podido apreciar la técnica
de fermentación microbiana es una de gran utilidad en la
elaboración de muchos de los productos de nuestro diario
vivir.

Tecnología del
hibridoma

Los hibridomas son células híbridas
resultantes de la fusión
de células extraídas del bazo de un animal
(linfocitos) con células cancerosas inmortales y de
reproducción rápida (mielomas). Esta
técnica es utilizada para la producción de
anticuerpos mono nucleados.

La respuesta normal en lo que concierne a anticuerpos a
cualquier molécula que se ha introducido natural o
artificialmente es compleja (policlonal) y da como resultado la
formación de una mezcla de diferentes anticuerpos contra
cualquiera de los sitios antígenos (pueden formarse anticuerpos
contra azúcares, proteínas o lípidos o
combinaciones de ellos). La principal ventaja de la
producción de anticuerpos monoclonales es que la respuesta
policlonal compleja descrita puede separarse en sus componentes
individuales. Sin embargo dado que las células que los
albergan sólo viven unos pocos días requiere que
las células manipuladas se tornen en
inmortales.

La primera fase en la producción de anticuerpos
monoclonales (o mononucleados) consiste en preparar el
antígeno (seleccionando especificidades individuales
mediante fusión celular), éstos son purificados
parcialmente, vgr por disgregación sub-celular, lavado con
un disolvente apropiado (elución) de bandas
proteínicas a partir de geles de acrilamida o
enriquecimiento cromotográfico.

Posteriormente, se inocula al animal en cuestión
con los antígenos seleccionados, de suerte que cada
linfocito produzca un anticuerpo específico; cada uno de
ellos (normalmente mortal) es posteriormente, inmortalizado por
la fusión con un mieloma (célula
cancerosa, de reproducción indefinida y rápida). La
célula resultante con una nueva carga genómica,
guarda su especificidad en la producción de anticuerpos
homogéneos (y únicos, de allí su
denominación de anticuerpos monoclonales) al originar un
clon de nuevas células, con la rapidez del
mieloma.

El hibridoma productor del anticuerpo monoclonal para
poder ser analizado para su utilización dependiendo 
de la unión directa del anticuerpo con su antígeno,
la cual no es fácil de detectar, por lo que se le adiciona
un segundo anticuerpo marcado ya sea con una molécula
fluorescente, un isótopo radiactivo, o con una enzima que
posee un producto de reacción coloreada; de esta manera
puede detectarse la unión de un anticuerpo monoclonal con
su antígeno, una vez que la cavidad que contiene el
anticuerpo deseado es identificada, las células tienen que
clonarse para tener la certeza de que todas proceden de un
sólo producto de fusión (lo que se logra
reduciendo, por dilución, a una las células de cada
cavidad para que cuando vuelvan a crecer los sobrenadantes de
esos clones correspondan a un único origen), asegurado lo
cual el producto se congela en nitrógeno líquido
para su almacenamiento.

Aunque existen numerosas variantes para la
obtención de hibridomas y Ac Mc específicos, el
protocolo general
tiene las siguientes etapas:

• Clon de células
  específicas (Inmortalidad) 1. Como célula
  de mieloma parenteral se selecciona una mutante
  enzimo-dependiente de una línea celular de
  plasmocitoma. Habitualmente se usan células
  deficientes en hipoxantin-guanin-fosforribosil-transferasa
  (HGFRT-). Se cultivan en un medio que contiene dicha
  enzima.

• Anticuerpos específicos (cel.
  bazo) 2. Las células parentales productoras de
  anticuerpos se obtienen del bazo (o de la población
  linfocitaria de sangre periférica) de un animal
  inmunizado con el antígeno frente a cuyos epitopes se
  desea obtener anticuerpos monoclonales.3. Ambos tipos de
  células parentales se mezclan en polietilenglicol
  durante 1 minuto. Se produce la fusión celular y se
  originan los hibridomas.4. Tras un lavado y unas horas de
  incubación, se procede a la dilución y clonado
  de la suspensión celular, sub cultivando durante
  varias semanas en un medio desprovisto de HGFRT. Las
  células no fusionadas mueren en este medio y cada uno
  de los hibridomas da lugar a un clon.5. Los sobrenadantes de
  cada clon celular son examinados periódicamente para
  determinar la presencia de anticuerpos frente al
  antígeno utilizado. Los clones identificados como
  productores de anticuerpos son clonados de nuevo, se
  comprueba su capacidad de producción, se establece la
  línea celular correspondiente y se determinan las
  características del Ac Mc obtenido.

La producción del Ac Mc se realiza
por cultivo en masa de la línea celular o por inducción de un mieloma en un animal
singénico, en cuyo líquido ascítico la
concentración del Ac Mc puede ser muy elevada.Cuando se ha
establecido un clon de células fusionadas, todo el Ac que
secretan deriva por definición de una célula, pero
no se trata necesariamente de un Ac Mc en el sentido
inmunológico, porque cada célula del clon tiene
cromosomas de la
célula mielomatosa y de la del bazo, y expresa ambas
dotaciones cromosómicas. Dado que los híbridos
tienden a perder cromosomas, pueden seleccionarse las variantes
que sólo secretan el Ac específico. Cuando la
línea mielomatosa parental, además de ser HGFRT-,
es una mutante que sólo secreta cadenas ligeras o que no
secreta Ac en absoluto, se facilita la obtención del clon
que sólo secreta Ac Mc según la información
proporcionada por la célula de bazo parental. En la
actualidad se dispone de una amplia gama de líneas
mielomatosas murinas para fusión de estas
características (líneas NS1, SP2, 653, etc.).Se ha
consagrado un gran esfuerzo a la consecución de adecuadas
líneas de mieloma humano y, en general, a la
producción de hibridomas con células humanas que
sinteticen anticuerpos que puedan ser utilizados
experimentalmente en el hombre. Aunque se consigue la
fusión entre células mielomatosas de ratón y
células humanas que expresen los caracteres de estas
últimas, en general son poco estables. En 1980 se
obtuvieron los primeros hibridomas con ambas células de
origen humano.Bajo los mismos principios se han desarrollado
hibridomas de células T mediante la fusión de
células de un linfoma de células T con
células linfoides de un animal inmunizado. En este caso se
consigue la inmortalización de los caracteres de la
célula T parental. Estos hibridomas encuentran, entre
otras, importantes aplicaciones en la
investigación de las funciones, marcadores de
superficie y productos de las subpoblaciones linfocitarias T.
También resultan inestimables en la producción de
mediadores de las células linfoides.

MONOCLONALES VERSUS POLICLONALES Los
Ac Mc producidos por hibridomas presentan considerables ventajas
frente a los antisueros convencionales preparados en animales
inmunizados. Son inmunoglobulinas de una sola especie molecular
con una afinidad medible por el Ag, lo que los convierte en
productos de grado analítico, utilizables para una
cuantificación precisa de las reacciones
serológicas, y en reactivos estándar de calidad
constante. Por otra parte, pueden seleccionarse los anticuerpos
específicos frente a los diferentes determinantes de un
antígeno complejo, sin la difícil y a veces
imposible purificación del inmunógeno
(antígenos de las membranas celulares, tumorales,
microbianas, etc.): de hecho, la tecnología de los
hibridomas permite una completa disección de la respuesta
inmunitaria.Por último, la inmortalidad de las
líneas celulares productoras garantiza el suministro
continuo de anticuerpos de calidad constante con costos
reducidos.Por todo ello, no es exagerado afirmar que los
hibridomas y sus productos han introducido una verdadera revolución
tecnológica con enorme impacto en la inmunología, microbiología,
hematología, genética y muchas otras áreas,
y múltiples aplicaciones en investigación, diagnóstico y terapéutica (algunas
ya consolidadas y otras aún en el terreno
experimental).

REACTIVOS: Las aplicaciones de los Ac Mc, se
incrementa día a día. Se utilizan para
identificación de antígenos celulares y, en
consecuencia, individualización de subpoblaciones
celulares normales (células linfoides, células del
sistema
nervioso) o patológicas (leucemias, células
tumorales); como reactivos de laboratorio para su uso en
inmuno-química, microbiología, hematología,
endocrinología, etc., por técnicas como radio-inmuno-ensayo,
inmuno-fluorescencia o ELISA, y para caracterización de
enzimas, neurotransmisores, receptores celulares, etc. En otro
orden, puesto que los Ac Mc son capaces de reconocer un
componente determinado de una mezcla de antígenos,
constituyen inmuno-absorbentes excelentes que encuentran gran
aplicación en la purificación de
antígenos.

TRATAMIENTOS: Los Ac Mc han abierto perspectivas
extraordinarias en la terapéutica. Por una parte, los
hibridomas podrán ser, muy probablemente, la fuente de
anticuerpos utilizables en inmunidad pasiva con grandes ventajas
sobre los actuales sueros preventivos y terapéuticos. Por
otra parte, los Ac Mc dirigidos contra epitopes de células
tumorales, de sub-poblaciones linfoides, etc. se están
ensayando en el tratamiento antitumoral, en la prevención
del rechazo de trasplantes alogénicos, etc. en
experiencias altamente prometedoras.Inmunotoxinas
Finalmente, la posibilidad de copular Ac Mc con toxinas de
acción muy específica (de origen bacteriano o
vegetal), con antimitóticos o incluso con isótopos
radiactivos ha introducido el concepto de
anticuerpos armados o inmunotoxinas, que podrían actuar
con refinada selectividad destruyendo determinadas células
nocivas.

Ingeniería de
proteínas

La Ingeniería de Proteínas es una rama
emergente de la ingeniería. Aplica conocimientos de
matemática, economía y biología molecular al
diseño
de proteínas. Existen dos métodos para el
diseño de proteínas: el diseño racional
(rational design) y la evolución dirigida.

En el diseño racional se presupone un conocimiento
detallado de la estructura y función de la
proteína, en la que se introducen los cambios deseados. Es
un método sencillo y barato, aunque el
conocimiento necesario para aplicarlo no siempre está
disponible.

En la evolución dirigida se introducen mutaciones
aleatorias en la proteína bajo estudio y se seleccionan
sólo aquellas variantes que presentan las propiedades
deseadas. Varias rondas de mutación y selección dan
lugar a una colección de proteínas modificadas que
presentan las características deseadas. En este momento se
aplica la técnica de barajar ADN (DNA shuffling)
consistente en mezclar partes de las proteínas más
exitosas en busca de una proteína aún mejor. Estas
técnicas están inspiradas en la evolución
natural y la reproducción sexual
respectivamente.

Es frecuente que los investigadores apliquen ambas
técnicas en el diseño de una proteína dada.
Primero se aplica el diseño racional y se somete al
producto a evolución dirigida.

Hay varios factores que influyen en la síntesis
de las proteínas transgénicas. Uno de los
más importantes es la frecuencia de uso de codones. La
concentración intracelular de cada ARN de transferencia
varía significativamente de un organismo a otro. La
presencia en un gen eucariota de un triplete poco usado en
bacterias, o viceversa, disminuye drásticamente la
síntesis de la proteína, factor que debe ser tenido
en cuenta para elegir el huésped más conveniente.
Además, muchas proteínas sintetizadas en sistemas
transgénicos no son capaces de plegarse correctamente y
adquirir una conformación funcional, sino que precipitan
en conglomerados insolubles. No se conocen los factores que
determinan el plegamiento de un péptido cuando es
sintetizado en una célula extraña, aunque se
presume que son los mismos que en el resto de los seres
vivos.

El punto crucial, sin embargo, no está
relacionado con las técnicas y consideraciones de orden
práctico, descriptas en los párrafos precedentes y
necesarios para encarar experiencias de muta génesis
sitio-dirigida, sino con las modificaciones a introducir en una
proteína para obtener la funcionalidad biológica
buscada. En los últimos años se ha acuñado
el término ingeniería de proteínas para
definir el conjunto de procedimientos
moleculares aplicables al diseño y construcción de proteínas con
funciones o propiedades predefinidas.

La ingeniería molecular de proteínas se
apoya en las leyes por las
cuales una secuencia lineal de aminoácidos adquiere su
estructura tridimensional, la que, a su turno, determina la
función biológica de la proteína. Junto con
la cristalografía de rayos X, la muta
génesis sitio-dirigida es una de las herramientas
más poderosas para diseñar proteínas
más estables, más activas, más
específicas, etc., y sirve tanto para la
investigación básica como para la
aplicada.

La muta génesis opera de manera óptima si
se trabaja con proteínas cuya estructura tridimensional
sea conocida de modo preciso, pues se tendrá
información detallada acerca de la posición
relativa de un aminoácido con respecto a otro, y
podrán hacerse inferencias sobre la fijación de
ligados, el plegamiento de la proteína, su actividad
biológica, etc. Pero aun sin contar con evidencias
mayores sobre esas posiciones relativas de los
aminoácidos, es posible substituirlos para:

(i) Confirmar experimentalmente la funcionalidad
inferida a partir de los datos
estructurales y(ii) mejorar o alterar esa funcionalidad. La mayor
parte de los actuales estudios de muta génesis encuadran
en el segundo propósito

Sí no se tienen datos estructurales,
todavía es posible construir un modelo, basado en
conformaciones conocidas de proteínas homólogas; la
exactitud del modelo, no obstante, depende de la similitud de las
secuencias en cuestión. En los últimos años
se ha trabajado exitosamente en la muta génesis de
aminoácidos -que no variaron mucho a lo largo de la
evolución- relacionados con el sitio activo de diferentes
enzimas y con los sitios de fijación de
ligando.

Cuando se desconocen tanto la estructura tridimensional
de una proteína como la de sus eventuales
homólogas, aún se puede obtener cierta
información sobre la funcionalidad de determinados
aminoácidos mediante experimentos de
modificación química. Consisten en alterar las
cadenas laterales de los aminoácidos utilizando reactivos
específicos, y luego establecer la ubicación del
residuo afectado en la secuencia primaria de la proteína.
La funcionalidad del aminoácido puede evaluarse estudiando
los efectos de la modificación sobre parámetros
como la afinidad por sustratos e inhibidores, las velocidades
absolutas y mecanismos de reacción (para enzimas), la
estabilidad de la proteína, su protección por
ligandos, etc. Para que los datos sean de utilidad, es
indispensable que la modificación sea específica.
Por lo general, los modificadores químicos son
moléculas voluminosas que se unen covalentemente a la
cadena lateral del aminoácido con el cual reaccionan;
alteran la función biológica de la proteína
por efectos estéricos, electrostáticos, etc.
Así, se han documentado numerosos casos de
aminoácidos, supuestamente esenciales según los
datos de las modificaciones químicas, cuya muta
génesis no tiene efecto alguno sobre la funcionalidad de
la proteína. De todos modos, los modificadores
químicos constituyen una ayuda inapreciable en aquellas
ocasiones en que no es posible contar con información
estructural, y seguirán empleándose para estudiar
proteínas cuya conformación tridimensional sea
desconocida.