La eficiencia de fagocitosis de trombocitos In Vitro en aves ante bacterias (página 2)

Morfología

Los TBCs son células de forma ovoide o discoide,
algo menores y más redondeados que los eritrocitos (8 x 5
µm). El núcleo es redondo u oval de cromatina
condensada de citoplasma azulado o transparente de aspecto
reticular o vacuolado con gránulos que pueden variar en
coloración se dificulta su reconocimiento al parecerse con
los linfocitos pequeños (figura 1). Al análisis
ultraestructural poseen un complejo de Golgi bien desarrollado,
mitocondrias, granulaciones de glucógeno, lisosomas,
escaso retículo endoplásmico y un sistema de
vesículas conectado con la membrana (Sweeny Carlson,
1968) En la superficie de los TBCs se observan seudópodos,
lobópodos e invaginaciones de la membrana; el contorno del
trombocito muestra la presencia de un cinturón
periférico de micro túbulos que parecen contribuir
ala fagocitosis (Campbell, 1988)

(Fig1) trombocitos aviares células ovoides
redondeadas con citoplasma azulado trasparente algo menores a los
eritrocitos

Ontogenia

No existen megacariocitos en la médula
ósea, por lo que se originan a partir de precursores
mononucleados, aparecen en la sangre a partir del día 2 de
incubación, siendo el segundo componente celular,
después de los eritrocitos (20.000 y 40.000 TBCs x mm3)
(Campbell 1988). El sitio de producción son los
islotes sanguíneos del saco vitelino

Al parecer en la médula ósea comienzan a
aparecer a partir del día 12 de incubación 28. Se
han descripto estadios de tromboblasto y de TBCs inmaduros,.
Aunque no se sabe cuales son sus precursores.
(Campbell 1988).

Función
hemostática

Los TBCs juegan un rol similar a las plaquetas de
mamíferos en los procesos hemostáticos ya que se
adhieren y agregan en el sitio de una injuria vascular formando
un tapón hemostático desencadenado más por
factores extrínsecos que intrínsecos ya que se
agregan en respuesta al agregado de trombina, colágeno y
serotonina pero sin necesidad de ADP ni ATP Una de las sustancias
liberadas es la serotonina, Localizada casi exclusivamente en los
trombocitos estos a su vez expresan un homólogo de la
glicoproteína IIb IIIa que actúa como receptor de
fibrinógeno para producir la hemostasia (Sweeny y Carlson,
1968)

Función
inmunológica

Las propiedades fagocíticas de los TBCs han Sido
reportadas desde hace tiempo. Los TBCs Tanto de pollos como de
embriones Tienen actividad fagocítica hacia colorantes (Al
Awadhiya et al., 1980) y también sobre bacterias y virus.
La fagocitosis en los TBCs no se inhibe con las aflatoxinas, como
sí ocurre con las demás células fagociticas
Se ha reportado que los TBCs pueden fagocitar en la sangre 1,7
más bacterias y hacerlo 3 veces más rápido
que heterófilos y monocitos juntos No está clara la
participación del complemento sigue siendo un factor
desconocido del suero de pollo se cree que puede se liga a ellos
.Los TBCs podrían manifestar quimiotaxis en los procesos
inflamatorios En las aves, el rol fagocítico tiene
significancia por el aparato lisosomal y parecen constituir un
vestigio ancestral del comportamiento de los primitivos
leucocitos muestran que inmediatamente luego de inyectar
Carbón coloidal en pollos se produce agregación
trombocítica y que el porcentaje de TBCs con
partículas de carbón llega hasta un 50% en los
primeros 5 minutos para luego decrecer progresivamente a dife-
rencia de los macrófagos (Al Awadhiya et al., 1980), los
TBCs no presentan receptores Fc para inmunoglobulinas ni poseen
res- puesta oxidativa aparentemente por lo que juegan un papel en
la inmunidad innata. Los TBCs de las aves expresan el complejo
mayor de histocompatibilidad de clase IV (solo en aves ) lo que
permite suponer en los TBCs alguna función en reacciones
de tipo Inmunológico aunque algunos autores niegan su
función en procesos inflamatorios Los trombocitos son
capaces de migrar por tubos capilares, y esta actividad
migratoria puede inhibirse por factores solubles liberados por
linfocitos T y B activados pero los TBC pueden mediar procesos de
cicatrización y actividad fibroblastica (Sweeny ,
Carlson, 1968)

Materiales y
métodos

Se utilizaron 4 pollos de corral cercanos a los 40 dias
de edad libres de signos patológicos aparentes, criadas en
jaulas de angeo en un ambiente adecuado en el municipio de
Ibagué y suministrando dietas adecuadas según su
edad (levante, engorde), se extrajeron muestras de 2-3 ml de
sangre por animal en tubos de ensayo con solución de
heparina sódica 0.2 ml (151.8 mg x 5 mL ) (lo suficiente
para inhibir la agregación plaquetaría y que no
disminuya la actividad celular) las muestras fueron trasladadas
al laboratorio de patología clínica y
microbiología de la universidad del Tolima.

Se utilizaron tres tipos de soluciones para realizar el
experimento; entre ellas una solución de PBS para mantener
el pH adecuado simulando los niveles de neutralidad de la sangre
lo cual facilita el desarrollo de los procesos de fagocitosis, se
utilizo un total de 0.3 ml de sangre por ave para el desarrollo
del experimento. En una placa multipozos de terminación en
u se adicionaron 0.1 ml de solución PBS con 0.1 ml de
sangre seguidamente del inocuo con bacterias del genero
Staphylococcus a la misma cantidad (0.1ml) con ayuda de una
micropipeta, las bacterias fueron facilitadas por el laboratorio
de microbiología en tubos de ensayo con agua destilada
para usarlo como inocuo.

Por cada muestra se hicieron tres replicas a las cuales
se les aplico el mismo procedimiento. Hubo 4 muestras distintas
cada una con 3 repeticiones para un total de 12 pozos utilizados
correspondientes a las 4 aves, seguidamente se procedió a
mezclar la solución de PBS + sangre + staphylococcos,
durante 30 minutos para así estimular la fagocitosis en
los trombocitos aviares.

Se utilizaron 0.03 ml de la mezcla de (PBS + sangre +
staphylococcos) para realizar los frotis sanguíneos, (se
uso tal cantidad solo por que se requería muestras
homogéneas (eritrocitos, heterofilos, linfocitos y
trombocitos) con el fin de posibilitar y facilitar la
identificación de los trombocitos que habían
fagocitado las bacterias y las que no lo habían hecho
durante tal periodo.

Seguidamente se dejaron secar por 10 minutos a
temperatura ambiente para la fijación para luego agregar
tinsion Wright dejando teñir por 7 minutos y ser lavadas
en agua, al estar completamente secas las placas se
procedió a realizar el conteo de los trombocitos que
habían fagocitado bacterias como los que no lo
habían hecho en un microscopio óptico a 100 x con
aceite de inmersión.

Para la identificación de los trombocitos se
recorrió la placa en forma de eles (Figura 2) y así
obtener valores más cercanos a la realidad, con el fin de
realizar las pruebas estadísticas y determinar el
índice fagocítico de los trombocitos
aviares.

Figura 2: recorrido que muestra como
se observo la placa al microscopio (100X) para determinar el
índice fagocítico de los
trombocitos

Para las pruebas estadísticas se uso el
análisis de varianza con un nivel de significancia del
95%, se tabulo la tabla anova para discutir los resultados y
comparar si había diferencias significativas entre las
muestras.

Resultados

Los valores de los indicadores del sistema de defensa
inespecífica las muestra con staphilococos dan por echo la
actividad fagocítica de los trombocitos aviares ante
bacterias del genero Staphylococcus

Se observa claramente (tabla 1) que el porcentaje de
fagocitosis varia según la muestra y la repetición
estudiada, fue un poco menos variable el porcentaje cuando se
hallo el promedio de fagocitosis de las muestras estudiadas
(tabla 2), el promedio total de fagocitosis en trombocitos
aviares fue igual al 32,81% de las plaquetas vistas al
microscopio, lo que refuerza el planteamiento de que los
trombocitos aviares son células activas de la inmunidad
innata, ayudando a otros fagocitos en la eliminación de
agentes patógenos.

Los análisis estadísticos demuestran que
no hay diferencias significativas entre los tratamientos lo cual
nos hace pensar la estabilidad del experimento
arrojándonos un valor de 4.45 en la tabla de Fisher (alfa
de 0.5) en relación al 0.38 en la F de los análisis
de varianza

Discusión

Quizás parezca muy poca la incidencia de estas
células en la fagocitosis de microorganismos y sustancias
nocivas para las aves si tenemos en cuenta que los
Macrófagos tienen promedios de mas del 60% pero si
comparamos las cantidades de estas células en sangre con
respecto a otros fagocitos heterofilos 30-75%, eosinofilos 0-4% y
basofilos 0-5%) notaremos que son muy importante en respuestas
inmunes en las aves, su desarrollado aparato lisosomal les da
capacidad para destruir los agentes invasores también han
sido relacionados con reacciones inflamatorias ya que se sospecha
que liberan sustancias que favorecen la migración
linfocitaria.

En conclusión los trombocitos en las aves son muy
importantes en procesos de inmunidad innata y son una primera
línea de defensa contra los agentes patógenos
debido a la cantidad que circulan en sangre 20.000-40.000 por
mm3

Las propiedades fagocíticas de los TBCs en la
sangre pueden ser mas rápida que los heterofilos juntos
aunque no se realizaron pruebas para argumentar esto algunos
estudios lo demuestran permite suponer en los TBCs alguna
función en reacciones de tipo Inmunológico aunque
algunos autores niegan su función en procesos
inflamatorios

Tabla 1: porcentaje de fagocitosis
según la muestra y la repetición
estudiada

Tabla 2: porcentaje promedio de
muestras con relación al porcentaje total de las
muestras

Tabla anova en el que demuestra que no existen
diferencias significativas entre los tratamientos

Agradecimientos

Cordiales agradecimientos al docente Iang Rondon
Barragan (mvz), laboratorio de diagnostico clínico, al
profesor Marco Ávila licenciado en biología y
química, Msc por sus accesorias, a Liliana Francis Turner
por sus conocimientos, a mi familia y a Dios por permitirnos
progresar en la investigacion

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Autor:

Adriana Isabel
Velásquez,

Albert Ávila,

Jamir Quiroga,

Ruby Esperanza Avila,

Sammer Yate,

Estudiantes de Biología y Medicina
Veterinaria y Zootecnia, Universidad Del Tolima