Cultivo de Células madre embrionarias como una herramienta

Resumen

La biología celular de los procesos iniciales de
embriogénesis en mamíferos, tales como la
formación germ-capa ha sido técnicamente
difíciles de estudiar debido a el tamaño y la
accesibilidad de los embriones de mamíferos. Las
células madres embrionarias que pueden generar las tres
capas germinales in vitro, son usadas para el estudio de
embriogénesis a nivel celular. Así que,
¿cómo puede el estudio de las células madre
embrionarias y su diferenciación proporcionar una
comprensión más profunda de la biología
celular del desarrollo temprano?.

Todos los biólogos del desarrollo son muy
conscientes de que la embriogénesis es la suma integrada
de los cambios que ocurren en las células individuales del
embrión. Estos cambios pueden
ser examinadas a través
del desarrollo de varias tecnologías que
permiten imágenes in vivo y ex vivo de del
comportamiento de las
células embriogénicas
en mamíferos. Sin embargo, hay al menos dos problemas
básicos que son difíciles de tratar usando
imágenes in vivo. Primero, aunque es posible observar el
comportamiento de células in vivo de algunos organismos
modelo, la visualización de las células
individuales durante la embriogénesis de mamífero
ha sido difícil debido al problema de la accesibilidad. A
corto plazo el seguimiento de las células en embriones de
post-implantación se han reportado, pero todavía es
difícil de obtener imágenes en vivo de las
células durante la embriogénesis de
mamíferos en cultivo de embriones conjunto. El segundo
problema es teórico. Varias moléculas que se
localizan en el microambiente embrionario regular destinos
diferentes de células. Por lo tanto, aunque es posible
definir la función de las moléculas individuales,
no es fácil determinar la "suficientes" condiciones para
un proceso determinado del análisis in vivo.

Células embrionarias madre (ES), son derivadas de
la masa de células interna (ICM) del blastocito
 (embriones que son ~3,5 días post
coito) El ICM de blastocitos contiene todas las células
que darán lugar al embrión mismo y el endodermo
primitivo. En el embrión las células ICM proliferan
parcialmente pero todos ellos se diferencian y pierden su
pluripotencialidad en un plazo corto de tiempo. Sin embargo, en
condiciones específicas de cultivo, las células ICM
dar lugar a células madre embrionarias, que se puede
mantener indefinidamente en un estado indiferenciado sin perder
su pluripotencialidad (figura 1). Aunque las células madre
embrionarias no son claramente idénticas a las
células del ICM, mantienen la habilidad de diferenciarse
en todos los linajes celulares, y cuando se inyectan en
blastocitos se comportan de la misma manera que las
células huésped ICM y participar en el desarrollo
embrionario.

"Dado que las células ES mantener la capacidad de
someterse a la diferenciación de todos los linajes de
células, que pueden proporcionar una fuente de
células universal para el estudio de la biología
celular de la embriogénesis."

Figura 1. Después de varias rondas
de las divisiones, el óvulo fertilizado se desarrolla en
el blastocisto. El blastocisto se compone de trophectoderm y la
masa celular interna (MCI), que dan lugar a los tejidos
extraembrionarios como la placenta y las células del
embrión, respectivamente. Cuando las células del
ICM se cultivan en condiciones apropiadas – por ejemplo, en un
medio que contiene el factor de la leucemia citoquina inhibitoria
(LIF; ratón) o en los fibroblastos de embriones de
ratón (tanto humanos y de ratón) – se vuelven
capaces de proliferar continuamente; estas líneas
celulares se señalan como células madre
embrionarias (ES) . En el ratón, Pluripotencia ES se ha
demostrado mediante la inyección de células madre
embrionarias en blastocistos. Estas células pueden ser
integradas en el embrión y dan lugar a todos los linajes
de células en el cuerpo, incluidas las células
germinales (ratón quimérico). Por razones obvias,
este método no ha sido aplicado a las células
embrionarias humanas. En cambio, la pluripotencia de las
células madre embrionarias humanas es por lo general a
prueba por su capacidad de dar lugar a teratomas.

Dado que las células ES mantener la capacidad de
someterse a la diferenciación de todos los linajes de
células, que pueden proporcionar una fuente de
células universal para el estudio de la biología
celular de la embriogénesis. Esto es particularmente
importante para el estudio del desarrollo humano ya la
disponibilidad de las células normales a partir de
embriones humanos es muy limitada. El potencial para producir un
número ilimitado de células en cultivo es otra de
las ventajas de las células ES. Por último, las
células madre embrionarias pueden ser fácilmente
modificados genéticamente, lo que permite la
creación de líneas que llevan marcadores
específicos y proporcionar un medio de interferencia con
las funciones genéticas. El objetivo de este
artículo es de resaltar las estrategias actuales y futuras
para la explotación de las células ES en
biología celular del desarrollo, y para discutir el
conjunto único de oportunidades y problemas que presentan
en la diferenciación in vitro de células
ES.

Células ES
y pluripotencia

El cultivo de células ES ha demostrado su gran
potencial en los estudios de biología celular de
pluripotencia y auto-renovación los dos rasgos
característicos de las células ES.– los dos rasgos
característicos de las células ES. Es tal vez
sorpréndete que las líneas de células ES se
establecieron a pesar de que la auto-renovación de
células del ICM es limitada en vivo. Sin embargo, nuestra
comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la
elección entre la auto-renovación y
diferenciación han sido un gran avance en los estudios
recientes de las células ES.

Control transcripcional y epigenético de la
pluripotencia

Tres factores de transcripción – OCT3 / 4, NANOG
y SOX2 – surgieron para formar una red central que controla
el mantenimiento de la pluripotencia de las células ES de
ratón, aunque en vías distintas. La evidencia
indica que una de las funciones de estos factores es
contrarrestar las moléculas que participan en el programa
de diferenciación. Un factor, OCT3 / 4 y SOX2 forma un
complejo que se suprime la expresión de Cdx2, que dirige a
la diferenciación del endodermo primitivo. NANOG puede
inhibir la diferenciación de mesodermo y endodermo
primitivo, influyendo en la expresión de GATA6 y
brachyury, respectivamente. Por algunos mecanismos desconocidos,
NANOG también puede inhibir la diferenciación del
linaje neuronal. Por lo tanto, la supresión de los
programas de diferenciación es un requisito esencial para
el mantenimiento de la pluripotencia de las células ES.
Aunque las bases moleculares de la pluripotencia se han estudiado
sobre todo con las células embrionarias de ratón,
parece probable que estos tres factores básicos de la
transcripción también son responsables de la
pluripotencia de las células embrionarias humanas. De
hecho recientes estudios de alto-rendimiento de los genes diana
tanto en ratón y células madre embrionarias humanas
sugieren que muchos de los genes importantes aguas abajo
están regulados por mecanismos comunes en las dos
especies. Los datos recientes también sugieren la
existencia de un estado epigenético ES-específicos
que pueden ser importantes para el mantenimiento de la
pluripotencia. Este estado fue descrito como un estado bivalente
ya que ambos activos (Lys4 metilado de la histona H3) y
supresores (metilado Lys27 de la histona H3) modificaciones de la
cromatina parece que coexisten en los genes que se requieren para
la diferenciación de linaje-específicos. Este
estado bivalente se cree que resolver ya sea a un activo o un
estado de supresión durante la diferenciación. Un
conjunto de moléculas Polycomb también han sido
implicados como silenciadores de genes globales que reprimir el
programa de diferenciación para mantener la
pluripotencia.

Proliferación de células
ES

Expresión sostenida de varios proto-oncogenes se
ha implicado en la proliferación de las células
madre embrionarias. Esto es interesante porque la
formación de teratomas es una propiedad importante de las
células ES. Grupo de Yamanaka ha demostrado que un gen de
la familia Ras, ES-células-expresado Ras (ERas),
está involucrado en auto-renovación y la
formación de teratomas de células ES, probablemente
a través de la activación de la vía
fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K). Cartwright et al.
informó de que el proto-oncogen c-Myc se encuentra aguas
abajo del factor inhibitorio de la leucemia (LIF) transductor de
señales y activador de la vía
transcripción-3 (STAT3), que se requiere para el
mantenimiento de células ES. Por último, b-Myb es
otro oncogén que se ha implicado en la
auto-renovación de las células madre embrionarias.
Cómo la expresión de estos proto-oncogenes se
sustenta en células madre embrionarias, hasta qué
punto están implicados en la auto-renovación de
células madre embrionarias, y cómo las
células madre embrionarias están protegidos de la
senescencia no son todavía plenamente entendida. Las
respuestas a estas preguntas contribuirán a la
comprensión de la derivación de células
madre embrionarias.

Biología
celular de la diferenciación de células
ES

Como se describió anteriormente, las
células madre embrionarias tienen un potencial enorme para
el estudio de la embriogénesis a nivel celular. La
diferenciación de las células del ES en las tres
capas germinales se logra mediante el uso de las condiciones de
cultivo específicos: la formación embryoidbody
(EB), cultivo de células alimentadoras y cultivo en
matrices. En la actualidad, el protocolo más conocido es
hacer una estructura embriones- like conocida como la EB, en los
que la mayoría de los linajes de células
diferenciar de forma espontánea. La idea básica
detrás del método de EB es imitar el proceso de
desarrollo embrionario. Por el contrario, el cultivo de
células alimentadoras o matrices objetivo de inducir la
diferenciación guiada a un número limitado de tipos
celulares (figura 2).

Cultivo alimentador-celular-dependientes:
Monocapas de células recién aisladas o
líneas celulares son de uso frecuente como células
alimentadoras para apoyar las actividades de las células
ES. Antes del descubrimiento de la LIF, las líneas
celulares, tales como la línea celular STO fueron
utilizados como una herramienta para mantener la
proliferación y la pluripotencia de las células
madre embrionarias en cultivo. El mantenimiento de las
células embrionarias humanas todavía requiere
células alimentadoras, porque estas células no
responden a la LIF. Muchas líneas de células de
alimentación usadas para inducir la diferenciación
específica fueron originalmente líneas de
células del estroma que se establecieron para apoyar
hematopoyesis ex vivo; sin embargo,mas alimentador líneas
celulares soporte diferenciación de las células ES
de linajes múltiples. Por ejemplo, el OP9 estroma
línea celular soporte diferenciación de
células ES la mayoría de los linajes de
células hematopoyéticas incluyendo T y B
linfocitos, sino también a otros linajes mesodermo como
mesodermo paraxial, que puede dar lugar a somites.

Bajo ciertas circunstancias, un microambiente altamente
selectiva es proporcionado por las células de
alimentación. El ejemplo más notable es el de la
línea celular del estroma PA6, que induce la
diferenciación selectiva de células madre
embrionaria al linaje neuronal. El modelo propuesto por Kawasaki
et al. sugiere que la actividad que promueve la
diferenciación al linaje de células neuronales
está presente en la matriz formada por PA6. Este
componente de la matriz (la naturaleza de lo que queda por
dilucidar) puede superar la actividad de varios otros factores
secretados que se expresan por PA6 células que normalmente
se esperaría para inducir la diferenciación del
mesodermo. Esta actividad fue designado como SDIA (estromales
derivadas de la actividad de la inducción) y
también se aplica a células madre embrionarias
derivadas de otras especies, incluidos los primates y los seres
humanos. Recientemente, los astrocitos del cerebro medio
inmortalizado también se han utilizado las células
de alimentación para inducir la diferenciación de
células madre embrionarias a las neuronas
dopaminérgicas. En conclusión, la
diferenciación de líneas celulares de
alimentación vale la pena considerar, ya que a veces
permiten la inducción de diferenciación
selectiva.

Hacia la plena definición de condiciones
Uno de los objetivos de la diferenciación de
células ES es imitar el proceso de especificación
celular bajo condiciones totalmente definida y, en el proceso,
generan un tipo específico de células maduras en
una alta pureza. Aunque algunos progresos se han hecho, sigue
siendo difícil de alcanzar para la mayoría de los
linajes, el obstáculo principal es la detección
laboriosa que se requieren para determinar las condiciones
óptimas para cada linaje. Por otra parte es inherentemente
difícil de controlar las condiciones de cultivo en su
totalidad. Por ejemplo, aunque el cultivo podría ser
iniciado en condiciones completamente definido, los factores no
definidos podrían  introducir cambios posterioresen
las células cultivadas. Factores tales como la
diversificación de la célula, un aumento en la
densidad celular y la formación de nuevas interacciones
celulares son difíciles de controlar. Además, todas
las interacciones celulares – tanto con la matriz subyacente y
con otras células- presentarán una gama de
diferentes fuerzas físicas como las fuerzas de
tensión y corte, que puede tener profundos efectos en la
diferenciación y supervivencia de las células. A
pesar de este difícil problema, continuos
intentos se han hecho para inducir la diferenciación de
células ES bajo suero-libre y químicamente definida
las condiciones en ausencia de la formación de EB. Para la
diferenciación de células ES en cultivos en
monocapa bajo condiciones química definida, sólo
unos pocos éxitos se han reportado. Ying et al. mostraron
que las células madre embrionarias cultivadas en placas
recubiertas de gelatina con un convencional suerum-free medio
diferenciacial selectivo a las células neuronales Sox1 +.
También informó de dos suerum-free condicionados
para endodermo definitivo y endodermo visceral que se basa en
suerum-free SFO3 medio que contiene la insulina, transferrina y
albúmina de suero bovino. En estas condiciones, la pureza
de las células que se generan en cultivo a menudo supera
el 90%, según la evaluación de la expresión
de marcadores moleculares. Por lo tanto, el cultivo en monocapa
en condiciones suerum-free debe ser la dirección final que
deben realizarse para los linajes de células.

Figura 2 | comparación de tres
protocolos para el cultivo de diferenciación de
células ES. Para inducir la diferenciación de
células madre embrionarias (ES) en las tres capas
germinales, tres protocolos están disponibles en la
actualidad. El protocolo usando embryoid body inicia el cultivo
de agregados de ES que se desarrollan a una arquitectura
embryo-like con los linajes endodermo primitivo fuera y otro
dentro (imagen izquierda). El protocolo usado placas feeder cell
layers células ES monocapa de células alimentadoras
(células del estroma OF9; imagen central). El tercer
protocolo es una cultivo simple (imagen derecha), en los que las
células madre embrionarias se colocan en una matriz de
colágeno se define como el IV. Cada método tiene
sus ventajas y sus inconvenientes, algunos de los cuales se
enumeran en la figura.

Áreas
prometedoras para los estudios de ES

Los protocolos actuales para rangos de
diferenciación de células ES de cultivos de EB que
recapitular embriogénesis reales en gran medida, el
cultivo de monocapa en condiciones completamente definidas que
son selectivos para linajes específicos Aunque la cultivo
de EB se considera como un protocolo más
embriología-orientada que al cultivo de monocapa, eventos
morfogenéticos como la formación de ejes no pueden
ser analizados. En esta sección, se presentan las zonas
para el cultivo de diferenciación células ES se
espera que proporcione información útil.

La biología celular de
embriogénesis. Hay por lo menos dos áreas en
las que el análisis de la diferenciación de
células ES puede contribuir a la comprensión de la
biología celular de la embriogénesis. La primera
área es la preparación de tipos específicos
de células embrionarias para el análisis de
biología celular. El método de EB que soporta
fácilmente la diferenciación de varios linajes
celulares podría ser el método más
conveniente para proporcionar muchos tipos de células
diferentes. Aunque los tipos de células no deseados se
generan en EBs, estos se pueden eliminar con
linaje-específicos marcadores para purificar los tipos
celulares deseados. Una serie de marcadores de superficie
están disponibles para la purificación de los
linajes distintos y etapas usando anticuerpos específicos.
Por lo tanto, el método de EB es una cómoda
herramienta para la preparación de varios tipos de
células, que pueden utilizarse para el análisis de
biología celular después de la purificación
de los tipos celulares deseados.

La otra área en la que estudios de
diferenciación de células ES se espera que
contribuya sustancialmente es la biología celular de los
primeros procesos de diferenciación embrionaria; en
particular, la especificación inicial de las capas
germinales, que sigue siendo en gran parte sin investigar debido
a la dificultad en la obtención de un número
suficiente de células. Por ejemplo, un embrión
día 3,5 (E3,5) embrión constituido por Cdx2 +
endodermo primitivo y ICM en la que Gata6 + y Nanog +
células se mesclan en forma de "sal y pimienta".
Cómo esta divergencia temprana está regulada
sería un buen asunto para el cultivo de células ES
debido a la facilidad de control y manipulación de los
procesos intermedios en la cultivo. Aunque el estudio en este
sentido será necesario un esfuerzo enorme para determinar
las condiciones de cultivo, debe ser un área
fructífera de investigación.

Evaluación de las señales
extrínsecas. Gradientes de concentración han
sido implicados en la especificación de los tipos de
células en una manera posición-específica.
Sin embargo, la determinación de la concentración
real que especifica un destino celular determinado sólo
puede apreciarse en los sistemas de cultivo simple que evite la
participación de otros factores extrínsecos. En
tales condiciones, sólo linajes específicos
podría ser permitido diferenciar. Hemos demostrado que la
concentración de la activina, una molécula que
induce la diferenciación de mesodermo en diversas
especies, se correlaciona con la proporción de
células Gsc+ células derivadas del mesendodermo a
partir de células madre embrionarias cultivadas en
condiciones serum-free. Obviamente, el nivel de expresión
de un marcador por si sola no es suficiente para predicciones a
futuro del actual destino celular. Por lo tanto, un
análisis detallado el destino de las células
inducidas en una condición dada debe llevarse a cabo en
paralelo con el desarrollo de otros marcadores que se
correlacionan con destinos específicos. Este tipo de
análisis debería facilitar el esclarecimiento de la
información deseada sobre la situación en el
cultivo; Este conocimiento contribuirá al desarrollo de
nuevos métodos para la diferenciación de las
células ES guiada. Hasta ahora, sólo un
número limitado de moléculas como activina, las
proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) y las
señales de Wnt han sido investigados, pero los
análisis preciso de la respuesta a la dosis de estas
moléculas y sus combinaciones en cultivos en monocapa
serum-free son necesarias. Tales estudios son también
esenciales para determinar las condiciones óptimas para
dirigir la diferenciación de células ES a un linaje
particular.

Figura 3 relaciones entre un conjunto de
células ES-derivadas y células embrionarias
derivadas. El diagrama indica distancias entre las
poblaciones de células diferentes durante la
diferenciación de células embrionarias madre (ES),
es calculada a partir de las señales de la sonda de 724
Affymetrix conjuntos seleccionados por su sonda de covarianza par
y la varianza en las diferentes muestras. Cada círculo
indica una muestra individual. Todas las poblaciones de
células, excepto las muestras de 264 a 268 (en la zona
azul) se derivaron de las células ES (muestras 231 y 232,
zona naranja). Las muestras 262 y 263 son clones de
células madre mesenquimales (MSC), propiedades que se
derivan de células madre embrionarias. Estos clones son
más similares a varias poblaciones celulares, que fueron
derivados a partir del día embrionario 14.5 (E14.5)
derivados de la cresta neural que tienen propiedades MSC
(muestras de 264 a 268). Las muestras en el área de color
magenta se obtuvieron mediante el cultivo de células madre
embrionarias en la presencia de activina, con muestras tomadas a
partir del día 1 (muestra de 250) hasta el día 5
después del cultivo (muestras 255 y 259). La muestra
consistió en 259 de las células
E-cadherina-negativos derivados del mismo cultivo, lo que indica
que es equivalente al mesodermo mesendoderm-derivados. Las
muestras en el área de púrpura son mesodermo
ES-derivados y son todos positivos para los receptores del factor
de crecimiento vascular endotelial-2 (VEGFR2, también
conocida como Flk1) y / o el factor de crecimiento derivado de
plaquetas receptores a (PDGFRa). Todas las muestras mesodermo,
excepto de la muestra 259 se obtuvieron por la
diferenciación en la presencia de suero. Tenga en cuenta
que las muestras de 248 y 259 son positivas tanto para VEGFR2 y
PDGFRa, lo que indica una estrecha correlación entre el
fenotipo de superficie y la expresión génica
global, incluso para las muestras que fueron obtenidas por
métodos diferentes Las muestras son 283-285 endotelial
vascular (VE)-cadherina + poblaciones que se derivaron a partir
de precursores VEGFR2 + ES-derivados.

Glosario

Genes de los sistemas: La capacidad de obtener un
gran número de células por cultivo de
diferenciación de células ES fácil es
importante para introducir tecnologías de alto rendimiento
para el perfil de expresión genética (por ejemplo,
DNA nicroarray). Este tipo de análisis permite el
descubrimiento de los genes que intervienen en procesos
específicos de embriones, y permite un mapa de patrones de
expresión génica durante el proceso de desarrollo
que se elaborará. De hecho, es posible convertir los datos
de microarrays en un mapa que muestra la relación entre
los diferentes intermediarios en cultivos de
diferenciación de células ES (así como de
embriones) en términos de perfiles de expresión de
muchos genes (figura 3, por la diferenciación neuronal).
Aunque los análisis no han sido capaces de demostrar que
la diferenciación de células ES es equivalente a la
diferenciación embrionaria (en gran parte debido a la
falta de datos embrionarios), nuestros datos (Figura 3) y un
informe reciente sugiere que las comparaciones significativas se
pueden hacer entre diferentes. ES derivados y que sus caminos de
derivación son consistentes con nuestra comprensión
del proceso.

Además, hemos encontrado que existe una buena
correlación entre el fenotipo de superficie, la
función y el perfil global de expresión
génica (Figura 3). Sin embargo, cabe destacar que esta no
constituye una prueba de dicha equivalencia, sino simplemente que
los análisis de alto rendimiento están en
línea con este ser el caso. Análisis de Microarray
También se espera que sea útil para la
identificación de nuevos genes implicados en la fase
más temprana de la formación de capas germinales,
ya que suele ser difícil preparar un número
suficiente de células de embriones tempranos. A pesar de
esta ventaja se ha aprovechado plenamente en la
investigación de la pluripotencia, su uso para procesos de
diferenciación temprana ha sido limitado. Una de las
ventajas a menudo se pasa por alto los datos de microarrays es
que el análisis se basa en materiales altamente
estandarizados y métodos. Métodos estandarizados,
en acción combinando con la gran cantidad de datos que
cualquier hibridación solo ofrece, hacen que sea
fácil de comparar las mediciones directamente desde un
gran número de diferentes muestras. Actualmente estamos
utilizando esta característica de los datos de microarrays
para establecer una base de datos de productos intermedios
distintos purificada a partir de la cultura la
diferenciación de células ES-o directamente de
embriones de ratón. Esperamos que esta base de datos tenga
el potencial para satisfacer la necesidad del análisis de
expresión génica de las células embrionarias
en repetidas ocasiones sin el costo asociado a la
realización de los análisis de tejidos
embrionarios.

Conclusiones y
perspectivas futuras

En este artículo, hemos revisado cómo las
células ES se utilizan en la biología celular de la
embriogénesis. A pesar de muchos problemas pendientes,
hacemos hincapié en la necesidad de desarrollar
condiciones de cultivo empleadas para la diferenciación de
células ES sin el uso de EB o de células del
estroma co-cultivo. Aunque el establecimiento define las
condiciones de cultivo de distintos tipos de células
requiere una cantidad enorme de trabajo, esperamos que los
recientes avances en tecnologías de alto rendimiento que
facilitará este proceso. De hecho, un screen de alto
rendimiento se ha aplicado para identificar pequeñas
moléculas que pueden apoyar el mantenimiento de la
pluripotencia y la auto-renovación de células madre
embrionarias. Cabe destacar que las recientes tecnologías
de alto rendimiento sólo son compatibles con simples
protocolos de cultivo en monocapa, debido a su exigencia de un
sistema de análisis automatizado que requiere de la
proyección de imagen in vitro de la respuesta celular. De
hecho, varias líneas de células ES ya están
disponibles en la cual el estado de la señal de la celula
se refleja en los marcadores fluorescentes. Una vez que las
condiciones de cultivo óptimo son determinadas por tales
screens, otras tecnologías sean aplicables a la cultivo de
la diferenciación de células ES. Estas
tecnologías incluyen matrices de transferencia de genes,
las matrices de RNAi de la transferencia y matrices
extracelulares Cuando se combinan, estas tecnologías
también nos permiten dibujar un panorama detallado de
cómo los cambios del transcriptoma de células
durante el proceso de especificación. Estas
tecnologías que actúen de concierto puede permitir
la generación de la diversidad para ser visualizado a
principios de diferenciación de las células ES en
condiciones definidas. Este progreso, a su vez, nos permite
preparar y manipular células humanas normales de los
linajes que desee y etapas. Como tal, la lista de las
posibilidades futuras es interminable, pero los futuros
análisis de los procesos normales se incluyen muchas que
se basan en la cultura es-y la diferenciación
celular.

Autor:

Luz Geidy Yanes Chavez

Shin-Ichi Nishikawa, Lars Martin Jakt
and Takumi Era