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Cultivo de Células madre embrionarias como una herramienta




  1. Resumen
  2. Células ES y pluripotencia
  3. Biología celular de la diferenciación de células ES
  4. Áreas prometedoras para los estudios de ES
  5. Glosario
  6. Conclusiones y perspectivas futuras

Resumen

La biología celular de los procesos iniciales de embriogénesis en mamíferos, tales como la formación germ-capa ha sido técnicamente difíciles de estudiar debido a el tamaño y la accesibilidad de los embriones de mamíferos. Las células madres embrionarias que pueden generar las tres capas germinales in vitro, son usadas para el estudio de embriogénesis a nivel celular. Así que, ¿cómo puede el estudio de las células madre embrionarias y su diferenciación proporcionar una comprensión más profunda de la biología celular del desarrollo temprano?.

Todos los biólogos del desarrollo son muy conscientes de que la embriogénesis es la suma integrada de los cambios que ocurren en las células individuales del embrión. Estos cambios pueden ser examinadas a través del desarrollo de varias tecnologías que permiten imágenes in vivo y ex vivo de del comportamiento de las células embriogénicas en mamíferos. Sin embargo, hay al menos dos problemas básicos que son difíciles de tratar usando imágenes in vivo. Primero, aunque es posible observar el comportamiento de células in vivo de algunos organismos modelo, la visualización de las células individuales durante la embriogénesis de mamífero ha sido difícil debido al problema de la accesibilidad. A corto plazo el seguimiento de las células en embriones de post-implantación se han reportado, pero todavía es difícil de obtener imágenes en vivo de las células durante la embriogénesis de mamíferos en cultivo de embriones conjunto. El segundo problema es teórico. Varias moléculas que se localizan en el microambiente embrionario regular destinos diferentes de células. Por lo tanto, aunque es posible definir la función de las moléculas individuales, no es fácil determinar la "suficientes" condiciones para un proceso determinado del análisis in vivo.

Células embrionarias madre (ES), son derivadas de la masa de células interna (ICM) del blastocito  (embriones que son ~3,5 días post coito) El ICM de blastocitos contiene todas las células que darán lugar al embrión mismo y el endodermo primitivo. En el embrión las células ICM proliferan parcialmente pero todos ellos se diferencian y pierden su pluripotencialidad en un plazo corto de tiempo. Sin embargo, en condiciones específicas de cultivo, las células ICM dar lugar a células madre embrionarias, que se puede mantener indefinidamente en un estado indiferenciado sin perder su pluripotencialidad (figura 1). Aunque las células madre embrionarias no son claramente idénticas a las células del ICM, mantienen la habilidad de diferenciarse en todos los linajes celulares, y cuando se inyectan en blastocitos se comportan de la misma manera que las células huésped ICM y participar en el desarrollo embrionario.

"Dado que las células ES mantener la capacidad de someterse a la diferenciación de todos los linajes de células, que pueden proporcionar una fuente de células universal para el estudio de la biología celular de la embriogénesis."

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Figura 1. Después de varias rondas de las divisiones, el óvulo fertilizado se desarrolla en el blastocisto. El blastocisto se compone de trophectoderm y la masa celular interna (MCI), que dan lugar a los tejidos extraembrionarios como la placenta y las células del embrión, respectivamente. Cuando las células del ICM se cultivan en condiciones apropiadas - por ejemplo, en un medio que contiene el factor de la leucemia citoquina inhibitoria (LIF; ratón) o en los fibroblastos de embriones de ratón (tanto humanos y de ratón) - se vuelven capaces de proliferar continuamente; estas líneas celulares se señalan como células madre embrionarias (ES) . En el ratón, Pluripotencia ES se ha demostrado mediante la inyección de células madre embrionarias en blastocistos. Estas células pueden ser integradas en el embrión y dan lugar a todos los linajes de células en el cuerpo, incluidas las células germinales (ratón quimérico). Por razones obvias, este método no ha sido aplicado a las células embrionarias humanas. En cambio, la pluripotencia de las células madre embrionarias humanas es por lo general a prueba por su capacidad de dar lugar a teratomas.

Dado que las células ES mantener la capacidad de someterse a la diferenciación de todos los linajes de células, que pueden proporcionar una fuente de células universal para el estudio de la biología celular de la embriogénesis. Esto es particularmente importante para el estudio del desarrollo humano ya la disponibilidad de las células normales a partir de embriones humanos es muy limitada. El potencial para producir un número ilimitado de células en cultivo es otra de las ventajas de las células ES. Por último, las células madre embrionarias pueden ser fácilmente modificados genéticamente, lo que permite la creación de líneas que llevan marcadores específicos y proporcionar un medio de interferencia con las funciones genéticas. El objetivo de este artículo es de resaltar las estrategias actuales y futuras para la explotación de las células ES en biología celular del desarrollo, y para discutir el conjunto único de oportunidades y problemas que presentan en la diferenciación in vitro de células ES.

Células ES y pluripotencia

El cultivo de células ES ha demostrado su gran potencial en los estudios de biología celular de pluripotencia y auto-renovación los dos rasgos característicos de las células ES.-- los dos rasgos característicos de las células ES. Es tal vez sorpréndete que las líneas de células ES se establecieron a pesar de que la auto-renovación de células del ICM es limitada en vivo. Sin embargo, nuestra comprensión de los mecanismos moleculares que controlan la elección entre la auto-renovación y diferenciación han sido un gran avance en los estudios recientes de las células ES.

Control transcripcional y epigenético de la pluripotencia

Tres factores de transcripción - OCT3 / 4, NANOG y SOX2 – surgieron para formar una red central que controla el mantenimiento de la pluripotencia de las células ES de ratón, aunque en vías distintas. La evidencia indica que una de las funciones de estos factores es contrarrestar las moléculas que participan en el programa de diferenciación. Un factor, OCT3 / 4 y SOX2 forma un complejo que se suprime la expresión de Cdx2, que dirige a la diferenciación del endodermo primitivo. NANOG puede inhibir la diferenciación de mesodermo y endodermo primitivo, influyendo en la expresión de GATA6 y brachyury, respectivamente. Por algunos mecanismos desconocidos, NANOG también puede inhibir la diferenciación del linaje neuronal. Por lo tanto, la supresión de los programas de diferenciación es un requisito esencial para el mantenimiento de la pluripotencia de las células ES. Aunque las bases moleculares de la pluripotencia se han estudiado sobre todo con las células embrionarias de ratón, parece probable que estos tres factores básicos de la transcripción también son responsables de la pluripotencia de las células embrionarias humanas. De hecho recientes estudios de alto-rendimiento de los genes diana tanto en ratón y células madre embrionarias humanas sugieren que muchos de los genes importantes aguas abajo están regulados por mecanismos comunes en las dos especies. Los datos recientes también sugieren la existencia de un estado epigenético ES-específicos que pueden ser importantes para el mantenimiento de la pluripotencia. Este estado fue descrito como un estado bivalente ya que ambos activos (Lys4 metilado de la histona H3) y supresores (metilado Lys27 de la histona H3) modificaciones de la cromatina parece que coexisten en los genes que se requieren para la diferenciación de linaje-específicos. Este estado bivalente se cree que resolver ya sea a un activo o un estado de supresión durante la diferenciación. Un conjunto de moléculas Polycomb también han sido implicados como silenciadores de genes globales que reprimir el programa de diferenciación para mantener la pluripotencia.

Proliferación de células ES

Expresión sostenida de varios proto-oncogenes se ha implicado en la proliferación de las células madre embrionarias. Esto es interesante porque la formación de teratomas es una propiedad importante de las células ES. Grupo de Yamanaka ha demostrado que un gen de la familia Ras, ES-células-expresado Ras (ERas), está involucrado en auto-renovación y la formación de teratomas de células ES, probablemente a través de la activación de la vía fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K). Cartwright et al. informó de que el proto-oncogen c-Myc se encuentra aguas abajo del factor inhibitorio de la leucemia (LIF) transductor de señales y activador de la vía transcripción-3 (STAT3), que se requiere para el mantenimiento de células ES. Por último, b-Myb es otro oncogén que se ha implicado en la auto-renovación de las células madre embrionarias. Cómo la expresión de estos proto-oncogenes se sustenta en células madre embrionarias, hasta qué punto están implicados en la auto-renovación de células madre embrionarias, y cómo las células madre embrionarias están protegidos de la senescencia no son todavía plenamente entendida. Las respuestas a estas preguntas contribuirán a la comprensión de la derivación de células madre embrionarias.

Biología celular de la diferenciación de células ES

Como se describió anteriormente, las células madre embrionarias tienen un potencial enorme para el estudio de la embriogénesis a nivel celular. La diferenciación de las células del ES en las tres capas germinales se logra mediante el uso de las condiciones de cultivo específicos: la formación embryoidbody (EB), cultivo de células alimentadoras y cultivo en matrices. En la actualidad, el protocolo más conocido es hacer una estructura embriones- like conocida como la EB, en los que la mayoría de los linajes de células diferenciar de forma espontánea. La idea básica detrás del método de EB es imitar el proceso de desarrollo embrionario. Por el contrario, el cultivo de células alimentadoras o matrices objetivo de inducir la diferenciación guiada a un número limitado de tipos celulares (figura 2).

Cultivo alimentador-celular-dependientes: Monocapas de células recién aisladas o líneas celulares son de uso frecuente como células alimentadoras para apoyar las actividades de las células ES. Antes del descubrimiento de la LIF, las líneas celulares, tales como la línea celular STO fueron utilizados como una herramienta para mantener la proliferación y la pluripotencia de las células madre embrionarias en cultivo. El mantenimiento de las células embrionarias humanas todavía requiere células alimentadoras, porque estas células no responden a la LIF. Muchas líneas de células de alimentación usadas para inducir la diferenciación específica fueron originalmente líneas de células del estroma que se establecieron para apoyar hematopoyesis ex vivo; sin embargo,mas alimentador líneas celulares soporte diferenciación de las células ES de linajes múltiples. Por ejemplo, el OP9 estroma línea celular soporte diferenciación de células ES la mayoría de los linajes de células hematopoyéticas incluyendo T y B linfocitos, sino también a otros linajes mesodermo como mesodermo paraxial, que puede dar lugar a somites.

Bajo ciertas circunstancias, un microambiente altamente selectiva es proporcionado por las células de alimentación. El ejemplo más notable es el de la línea celular del estroma PA6, que induce la diferenciación selectiva de células madre embrionaria al linaje neuronal. El modelo propuesto por Kawasaki et al. sugiere que la actividad que promueve la diferenciación al linaje de células neuronales está presente en la matriz formada por PA6. Este componente de la matriz (la naturaleza de lo que queda por dilucidar) puede superar la actividad de varios otros factores secretados que se expresan por PA6 células que normalmente se esperaría para inducir la diferenciación del mesodermo. Esta actividad fue designado como SDIA (estromales derivadas de la actividad de la inducción) y también se aplica a células madre embrionarias derivadas de otras especies, incluidos los primates y los seres humanos. Recientemente, los astrocitos del cerebro medio inmortalizado también se han utilizado las células de alimentación para inducir la diferenciación de células madre embrionarias a las neuronas dopaminérgicas. En conclusión, la diferenciación de líneas celulares de alimentación vale la pena considerar, ya que a veces permiten la inducción de diferenciación selectiva.

Hacia la plena definición de condiciones Uno de los objetivos de la diferenciación de células ES es imitar el proceso de especificación celular bajo condiciones totalmente definida y, en el proceso, generan un tipo específico de células maduras en una alta pureza. Aunque algunos progresos se han hecho, sigue siendo difícil de alcanzar para la mayoría de los linajes, el obstáculo principal es la detección laboriosa que se requieren para determinar las condiciones óptimas para cada linaje. Por otra parte es inherentemente difícil de controlar las condiciones de cultivo en su totalidad. Por ejemplo, aunque el cultivo podría ser iniciado en condiciones completamente definido, los factores no definidos podrían  introducir cambios posterioresen las células cultivadas. Factores tales como la diversificación de la célula, un aumento en la densidad celular y la formación de nuevas interacciones celulares son difíciles de controlar. Además, todas las interacciones celulares - tanto con la matriz subyacente y con otras células- presentarán una gama de diferentes fuerzas físicas como las fuerzas de tensión y corte, que puede tener profundos efectos en la diferenciación y supervivencia de las células. A pesar de este difícil problema, continuos intentos se han hecho para inducir la diferenciación de células ES bajo suero-libre y químicamente definida las condiciones en ausencia de la formación de EB. Para la diferenciación de células ES en cultivos en monocapa bajo condiciones química definida, sólo unos pocos éxitos se han reportado. Ying et al. mostraron que las células madre embrionarias cultivadas en placas recubiertas de gelatina con un convencional suerum-free medio diferenciacial selectivo a las células neuronales Sox1 +. También informó de dos suerum-free condicionados para endodermo definitivo y endodermo visceral que se basa en suerum-free SFO3 medio que contiene la insulina, transferrina y albúmina de suero bovino. En estas condiciones, la pureza de las células que se generan en cultivo a menudo supera el 90%, según la evaluación de la expresión de marcadores moleculares. Por lo tanto, el cultivo en monocapa en condiciones suerum-free debe ser la dirección final que deben realizarse para los linajes de células.

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Figura 2 | comparación de tres protocolos para el cultivo de diferenciación de células ES. Para inducir la diferenciación de células madre embrionarias (ES) en las tres capas germinales, tres protocolos están disponibles en la actualidad. El protocolo usando embryoid body inicia el cultivo de agregados de ES que se desarrollan a una arquitectura embryo-like con los linajes endodermo primitivo fuera y otro dentro (imagen izquierda). El protocolo usado placas feeder cell layers células ES monocapa de células alimentadoras (células del estroma OF9; imagen central). El tercer protocolo es una cultivo simple (imagen derecha), en los que las células madre embrionarias se colocan en una matriz de colágeno se define como el IV. Cada método tiene sus ventajas y sus inconvenientes, algunos de los cuales se enumeran en la figura.

Áreas prometedoras para los estudios de ES

Los protocolos actuales para rangos de diferenciación de células ES de cultivos de EB que recapitular embriogénesis reales en gran medida, el cultivo de monocapa en condiciones completamente definidas que son selectivos para linajes específicos Aunque la cultivo de EB se considera como un protocolo más embriología-orientada que al cultivo de monocapa, eventos morfogenéticos como la formación de ejes no pueden ser analizados. En esta sección, se presentan las zonas para el cultivo de diferenciación células ES se espera que proporcione información útil.

La biología celular de embriogénesis. Hay por lo menos dos áreas en las que el análisis de la diferenciación de células ES puede contribuir a la comprensión de la biología celular de la embriogénesis. La primera área es la preparación de tipos específicos de células embrionarias para el análisis de biología celular. El método de EB que soporta fácilmente la diferenciación de varios linajes celulares podría ser el método más conveniente para proporcionar muchos tipos de células diferentes. Aunque los tipos de células no deseados se generan en EBs, estos se pueden eliminar con linaje-específicos marcadores para purificar los tipos celulares deseados. Una serie de marcadores de superficie están disponibles para la purificación de los linajes distintos y etapas usando anticuerpos específicos. Por lo tanto, el método de EB es una cómoda herramienta para la preparación de varios tipos de células, que pueden utilizarse para el análisis de biología celular después de la purificación de los tipos celulares deseados.

La otra área en la que estudios de diferenciación de células ES se espera que contribuya sustancialmente es la biología celular de los primeros procesos de diferenciación embrionaria; en particular, la especificación inicial de las capas germinales, que sigue siendo en gran parte sin investigar debido a la dificultad en la obtención de un número suficiente de células. Por ejemplo, un embrión día 3,5 (E3,5) embrión constituido por Cdx2 + endodermo primitivo y ICM en la que Gata6 + y Nanog + células se mesclan en forma de "sal y pimienta". Cómo esta divergencia temprana está regulada sería un buen asunto para el cultivo de células ES debido a la facilidad de control y manipulación de los procesos intermedios en la cultivo. Aunque el estudio en este sentido será necesario un esfuerzo enorme para determinar las condiciones de cultivo, debe ser un área fructífera de investigación.

Evaluación de las señales extrínsecas. Gradientes de concentración han sido implicados en la especificación de los tipos de células en una manera posición-específica. Sin embargo, la determinación de la concentración real que especifica un destino celular determinado sólo puede apreciarse en los sistemas de cultivo simple que evite la participación de otros factores extrínsecos. En tales condiciones, sólo linajes específicos podría ser permitido diferenciar. Hemos demostrado que la concentración de la activina, una molécula que induce la diferenciación de mesodermo en diversas especies, se correlaciona con la proporción de células Gsc+ células derivadas del mesendodermo a partir de células madre embrionarias cultivadas en condiciones serum-free. Obviamente, el nivel de expresión de un marcador por si sola no es suficiente para predicciones a futuro del actual destino celular. Por lo tanto, un análisis detallado el destino de las células inducidas en una condición dada debe llevarse a cabo en paralelo con el desarrollo de otros marcadores que se correlacionan con destinos específicos. Este tipo de análisis debería facilitar el esclarecimiento de la información deseada sobre la situación en el cultivo; Este conocimiento contribuirá al desarrollo de nuevos métodos para la diferenciación de las células ES guiada. Hasta ahora, sólo un número limitado de moléculas como activina, las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) y las señales de Wnt han sido investigados, pero los análisis preciso de la respuesta a la dosis de estas moléculas y sus combinaciones en cultivos en monocapa serum-free son necesarias. Tales estudios son también esenciales para determinar las condiciones óptimas para dirigir la diferenciación de células ES a un linaje particular.

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Figura 3 relaciones entre un conjunto de células ES-derivadas y células embrionarias derivadas. El diagrama indica distancias entre las poblaciones de células diferentes durante la diferenciación de células embrionarias madre (ES), es calculada a partir de las señales de la sonda de 724 Affymetrix conjuntos seleccionados por su sonda de covarianza par y la varianza en las diferentes muestras. Cada círculo indica una muestra individual. Todas las poblaciones de células, excepto las muestras de 264 a 268 (en la zona azul) se derivaron de las células ES (muestras 231 y 232, zona naranja). Las muestras 262 y 263 son clones de células madre mesenquimales (MSC), propiedades que se derivan de células madre embrionarias. Estos clones son más similares a varias poblaciones celulares, que fueron derivados a partir del día embrionario 14.5 (E14.5) derivados de la cresta neural que tienen propiedades MSC (muestras de 264 a 268). Las muestras en el área de color magenta se obtuvieron mediante el cultivo de células madre embrionarias en la presencia de activina, con muestras tomadas a partir del día 1 (muestra de 250) hasta el día 5 después del cultivo (muestras 255 y 259). La muestra consistió en 259 de las células E-cadherina-negativos derivados del mismo cultivo, lo que indica que es equivalente al mesodermo mesendoderm-derivados. Las muestras en el área de púrpura son mesodermo ES-derivados y son todos positivos para los receptores del factor de crecimiento vascular endotelial-2 (VEGFR2, también conocida como Flk1) y / o el factor de crecimiento derivado de plaquetas receptores a (PDGFRa). Todas las muestras mesodermo, excepto de la muestra 259 se obtuvieron por la diferenciación en la presencia de suero. Tenga en cuenta que las muestras de 248 y 259 son positivas tanto para VEGFR2 y PDGFRa, lo que indica una estrecha correlación entre el fenotipo de superficie y la expresión génica global, incluso para las muestras que fueron obtenidas por métodos diferentes Las muestras son 283-285 endotelial vascular (VE)-cadherina + poblaciones que se derivaron a partir de precursores VEGFR2 + ES-derivados.

Glosario

Glosario

Carcinoma embrionario

Un tipo de cáncer de testículo, que mantiene el potencial para dar lugar a tejidos maduros.

Mesodermo

La capa germinal media del embrión en desarrollo, que ocupa una posición intermedia entre el ectodermo y el endodermo. Da lugar al esqueleto, los músculos y tejido conectivo.

Pluripotentes

Las células madre embrionarias que son capaces de formar todos los linajes de células del cuerpo, incluidas las células germinales, así como algunos o incluso todos los tipos de células extra-embrionarias.

Polycomb

Una clase de proteínas - originalmente descrito en Drosophila melanogaster - que mantiene la represión estable y hereditaria de varios genes.

Endodermo primitivo

El tejido extra-embrionario que da lugar al endodermo visceral y parietal, que se aparta directamente de la masa celular interna para formar la capa externa del embrión.

Teratoma

Los tumores que contienen diferentes células diferenciadas a partir de las tres capas germinales primarias.

Trophectoderm

La capa externa del blastocisto.

Genes de los sistemas: La capacidad de obtener un gran número de células por cultivo de diferenciación de células ES fácil es importante para introducir tecnologías de alto rendimiento para el perfil de expresión genética (por ejemplo, DNA nicroarray). Este tipo de análisis permite el descubrimiento de los genes que intervienen en procesos específicos de embriones, y permite un mapa de patrones de expresión génica durante el proceso de desarrollo que se elaborará. De hecho, es posible convertir los datos de microarrays en un mapa que muestra la relación entre los diferentes intermediarios en cultivos de diferenciación de células ES (así como de embriones) en términos de perfiles de expresión de muchos genes (figura 3, por la diferenciación neuronal). Aunque los análisis no han sido capaces de demostrar que la diferenciación de células ES es equivalente a la diferenciación embrionaria (en gran parte debido a la falta de datos embrionarios), nuestros datos (Figura 3) y un informe reciente sugiere que las comparaciones significativas se pueden hacer entre diferentes. ES derivados y que sus caminos de derivación son consistentes con nuestra comprensión del proceso.

Además, hemos encontrado que existe una buena correlación entre el fenotipo de superficie, la función y el perfil global de expresión génica (Figura 3). Sin embargo, cabe destacar que esta no constituye una prueba de dicha equivalencia, sino simplemente que los análisis de alto rendimiento están en línea con este ser el caso. Análisis de Microarray También se espera que sea útil para la identificación de nuevos genes implicados en la fase más temprana de la formación de capas germinales, ya que suele ser difícil preparar un número suficiente de células de embriones tempranos. A pesar de esta ventaja se ha aprovechado plenamente en la investigación de la pluripotencia, su uso para procesos de diferenciación temprana ha sido limitado. Una de las ventajas a menudo se pasa por alto los datos de microarrays es que el análisis se basa en materiales altamente estandarizados y métodos. Métodos estandarizados, en acción combinando con la gran cantidad de datos que cualquier hibridación solo ofrece, hacen que sea fácil de comparar las mediciones directamente desde un gran número de diferentes muestras. Actualmente estamos utilizando esta característica de los datos de microarrays para establecer una base de datos de productos intermedios distintos purificada a partir de la cultura la diferenciación de células ES-o directamente de embriones de ratón. Esperamos que esta base de datos tenga el potencial para satisfacer la necesidad del análisis de expresión génica de las células embrionarias en repetidas ocasiones sin el costo asociado a la realización de los análisis de tejidos embrionarios.

Conclusiones y perspectivas futuras

En este artículo, hemos revisado cómo las células ES se utilizan en la biología celular de la embriogénesis. A pesar de muchos problemas pendientes, hacemos hincapié en la necesidad de desarrollar condiciones de cultivo empleadas para la diferenciación de células ES sin el uso de EB o de células del estroma co-cultivo. Aunque el establecimiento define las condiciones de cultivo de distintos tipos de células requiere una cantidad enorme de trabajo, esperamos que los recientes avances en tecnologías de alto rendimiento que facilitará este proceso. De hecho, un screen de alto rendimiento se ha aplicado para identificar pequeñas moléculas que pueden apoyar el mantenimiento de la pluripotencia y la auto-renovación de células madre embrionarias. Cabe destacar que las recientes tecnologías de alto rendimiento sólo son compatibles con simples protocolos de cultivo en monocapa, debido a su exigencia de un sistema de análisis automatizado que requiere de la proyección de imagen in vitro de la respuesta celular. De hecho, varias líneas de células ES ya están disponibles en la cual el estado de la señal de la celula se refleja en los marcadores fluorescentes. Una vez que las condiciones de cultivo óptimo son determinadas por tales screens, otras tecnologías sean aplicables a la cultivo de la diferenciación de células ES. Estas tecnologías incluyen matrices de transferencia de genes, las matrices de RNAi de la transferencia y matrices extracelulares Cuando se combinan, estas tecnologías también nos permiten dibujar un panorama detallado de cómo los cambios del transcriptoma de células durante el proceso de especificación. Estas tecnologías que actúen de concierto puede permitir la generación de la diversidad para ser visualizado a principios de diferenciación de las células ES en condiciones definidas. Este progreso, a su vez, nos permite preparar y manipular células humanas normales de los linajes que desee y etapas. Como tal, la lista de las posibilidades futuras es interminable, pero los futuros análisis de los procesos normales se incluyen muchas que se basan en la cultura es-y la diferenciación celular.

 

 

Autor:

Luz Geidy Yanes Chavez

Shin-Ichi Nishikawa, Lars Martin Jakt and Takumi Era


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