Genética y Fisiología de la Determinación Sexual en Especies de Mamíferos

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Introducción

En mamíferos, el sexo genético viene determinado en el momento de la fertilización. La información contenida en el complemento cromosómico correspondiente regula la determinación y diferenciación del sexo gonadal, el cual, a su vez, modula la expresión del sexo fenotípico.

Los individuos que poseen, además del patrimonio genético autosomal, el par cromosómico sexual XY experimentan un desarrollo testicular a nivel gonadal, mientras que el desarrollo ovárico es observado en individuos, que han heredado el par cromosómico XX.

En el cromosoma Y se localiza un gen, denominado factor determinante del testículo (TDF), cuyo producto funcional induce el desarrollo testicular. Se han postulado dos modelos (el modelo determinístico y el modelo probabilístico) para explicar el mecanismo de acción de este gen. El modelo determinístico

propone que el TDF activaría un programa genético, desencadenando la expresión secuencial de una serie de genes que conducen al desarrollo testicular (McLaren, 1988), En ausencia de este gen, tendría lugar el desarrollo ovárico. Por otra parte, el modelo probabilístico sugiere que los factores que regulan la tasa de desarrollo gonadal (entre ellos el TDF), modulan la probabilidad de una gónada de convertirse en testículo u ovario (Mittwoch, 1989). El TDF incrementaría la cinética del desarrollo gonadal hasta alcanzar el umbral de desarrollo, requerido para la diferenciación del linaje celular de soporte.

Aún cuando no se ha esclarecido el mecanismo de regulación genética de la determinación gonadal, una manera de aproximarse al entendimiento del mismo, es determinar las condiciones bajo las cuales el sexo gonadal puede ser revertido experimentalmente. Una segunda aproximación es identi?car aquellas mutaciones, capaces de revertir el sexo gonadal. Estas mutaciones estarían presentes en individuos XX de sexo gonadal masculino y en individuos XY de sexo gonadal femenino.

La presente revisión aborda en detalle estos aspectos, los cuales se pronuncian a favor de la teoría probabilistica, que pone de mani?esto las bases de la determinación sexual.

Determinación y diferenciación sexual

I.1.- DEFINICIÓN Y GENERALIDADES.

En mamíferos placentados (euterios) el primordio gonadal, que surge como una estrati?cación del epitelio celómico sobre el mesonefros, retiene el potencial somático de convertirse en testículo u ovario dependiendo del complemento cromosómico del embrión en desarrollo (Fig. l). En consecuencia, la cresta genital es bipotencial y la dirección en la cual las células indiferenciadas se comprometen hacia una de las vías altemativas de desarrollo se conoce como determinación sexual. Las etapas ulteriores, requeridas para completar el desarrollo de los elementos somáticos y germinales correspondientes, se designan bajo el término de diferenciación sexual primaria.

Durante el proceso de diferenciación gonadal, se de?nen tres linajes celulares principales: el linaje de células germinales de origen extra-gonadal y dos linajes que surgen de los diferentes tejidos somáticos presentes en la gónada indiferenciada; a saber el epitelio celómico, el tejido mesonéfrico y el

mesénquima. E1 linaje de soporte, precursor de las células de Sertoli en el testículo y de células de la granulosa en el ovario, se diferencia a partir del mesonefros, aunque el epitelio celómico también contribuye a la formación del linaje de soporte femenino (Byskov y Hoyer, 1988; Patek et al., 1991).

Por otra parte, las células de Leydig que se localizan en las regiones intersticiales del testículo se diferencian del mesénquima (Moon y Hardy, 1973) y provienen del linaje de células productoras de esteroides al igual que las células de la teca en el ovario, las cuales pueden derivarse del mesénquima o de los tejidos somáticos indiferenciados que dan origen a las células de la granulosa (Gore-Langton y Armstrong, 1988).

En una etapa aún indiferenciada de la gónada, se puede distinguir lateralmente en el mesonefros la presencia de dos pares de conductos (mesonéfricos y paramesonéfricos). Dependiendo del sexo gonadal, uno de los sistemas de gonoductos se diferenciará, mientras el otro experimentará una regresión, dando lugar a la formación del tracto reproductor y en consecuencia a la expresión del sexo fenotípico (Fig. 2).

Fig. 1.- Diagrama de la sección transversal de un embrión en el cual se muestra la posición de la cresta genital sobre el mesonefros, la ubicación lateral de los gonoductos a nivel del mesonefros y la ruta migratoria de los gonocitos. (Tomado de Huckins, 1988).

Fig. 2.- Representación diagramática de la diferenciación de los genitales internos. (Tomado de George y Wilson, 1988).

Los genitales internos masculinos (epidídimo, vasos deferentes y vesículas seminales) se derivan de los conductos mesonéfricos o conductos de Wolff, cuya diferenciación es regulada por la testosterona producida por las células de Leydig, presentes en la gónada fetal masculina. Simultáneamente a la diferenciación de este sistema de gonoductos, se observa una regresión de los conductos

paramesonéfricos (o conductos de Müller) atribuido a la acción de la sustancia inhibidora Mülleriana, producida por las células de Sertoli (Jost, 1973). En ausencia de estos factores humorales, el tracto reproductor femenino (oviductos, útero y parte de la vagina) se desarrolla a partir de los conductos de Müller, cuya diferenciación puede llevarse a cabo incluso en ausencia de los primordios gonadales femeninos (Jost, 1973) y está acompañada de la regresión de los conductos de Wolff.

La porción terminal de los conductos mesonéfricos y paramesonéfricos con?uye en el seno urogenital, a partir del cual se diferenciarán los genitales externos.

I.2.— SEMEJANZAS Y DIFERENCIAS ENTRE EL DESARROLLO

TESTICULAR Y OVARICO.

Los procesos de diferenciación gonadal están precedidos por la colonización de la cresta genital por parte de las células germinales primordiales que migran desde la pared interior del saco vitelino (Everett, 1974).

La aparición de los cordones testiculares a nivel del blastema gonadal constituye el primer cambio morfológico visible en el desarrollo de un testículo (Jirasek, 1976) (Fig. 3). Dichas estructuras, precursoras de los túbulos seminíferos, se originan a consecuencia del alineamiento de las células de Sertoli,

que se organizan concéntricamente y van rodeando a las células germinales, las cuales quedan con?nadas dentro de estas estructuras cordonales, que posteriormente serán delineadas por las células peritubulares. Aquí las células germinales experimentan una activa proliferación mitótica hasta alcanzar la condición de pre-espermatogonia, deteniendo entonces su crecimiento en la fase G1 del ciclo celular, que se prolonga hasta antes de iniciarse la pubertad.

Una vez diferenciado el linaje celular de soporte en el testículo, surgen del mesénquima intersticial las células de Leydig, cuya secreción de hormonas esteroideas (testosterona) juega un papel importante en la diferenciación sexual secundaria (desarrollo de los genitales internos y externos) durante la etapa embrionaria.

Por otra parte, los estadios iniciales de la diferenciación ovarica (la cual se lleva a cabo cronológicamente en una etapa posterior a la diferenciación testicular) se caracteriza por la entrada en meiosis de las células germinales que han poblado el primordio gonadal (Peters, 1970). No obstante, el ciclo de vida de estas células germinales incluye una serie de divisiones mitóticas antes de que se inicie la profase meiotica, momento en el cual los ovocitos son rodeados por las células de la granulosa, creando un compartimiento folicular en cuyo interior se congregan un grupo de células germinales. En algunas especies de mamíferos como en ovinos, porcinos y bovinos, entre otros, se veri?ca un período de retardo en relación a la

entrada en meiosis de las ovogonias (Mauléon, 1967), las cuales son retenidas temporalmente en cordones que se rami?can desde la base del mesonefros hasta el epitelio celómico. Una vez superada esta fase transitoria, los cordones se rompen y liberan a las células germinales que ahora pueden experimentar la entrada en meiosis (Fig. 4). Por su parte, las células de la teca, pertenecientes a la población de células

productoras de esteroides en el ovario, aparecen en los comienzos de la pubertad, coincidiendo con la reanudación cíclica de la maduración folicular.

Se ha descrito que la diferenciación de los elementos somáticos del testículo tiene lugar aún en ausencia de células germinales mientras que las interacciones entre las células germinales y las células somáticas son determinantes en la diferenciación ovárica (Iones et al., 1963).

En ratones, las mutaciones localizadas en el locus W producen efectos pleiotrópicos y una de las alteraciones fenotípicas expresadas por estos mutantes es la esterilidad (Coulombre y Russell, 1954). El gen W codi?ca para una proteína transmembrana, receptora de tirosin quinasa (Yarden et al., 1987). La mayoría de las mutaciones W en condición de homocigosis determina una disminución de la capacidad proliferativa de las células germinales primordiales y un retardo en la migración de las mismas hacia la cresta genital (Mintz y Russell, 1957).

Fig. 3.- Representación diagramática de la sección transversal de un primordio gonadal masculino, mostrando el inicio de la formación de un cordón testicular, conjuntamente con el alineamiento de los gonocitos. (Tomado de I-Iuckirxs, 1988).

Fig. 4.- Diagrama indicativo del período de retardo de la entrada en meiosis de las células

germinales femeninas en diferentes especies ( longitud de la barra llena). El comienzo de la

barra llena marca el inicio de la diferenciación testicular en gónadas masculinas de la misma edad gestacional. Se muestra ademas la duración de la preñez (longuitud de la linea continua) y el tiempo requerido para que toda la población ovogonial entre la fase de leptoteno (longitud de la barra diagonal). (Tomado de Bykov, 1986).

Aunque un número reducido de células germinales primordiales logra colonizar el primordio gonadal, los mutantes presentan al nacer gónadas depletadas de células germinales y aún así los individuos masculinos muestran testículos bien desarrollados. En tal sentido, los experimentos de disociación y reconstitución de gónadas fetales llevados a cabo por Hashimoto et al. (1990) con?rman los postulados de Jones y colaboradores en relación a la independencia de la diferenciación somática testicular con respecto a las células germinales.

En dichos ensayos, las células germinales se aislaron del tejido somático gonadal (extraído de ratones a los 12,5 días de gestación) y éste a su vez se disoció en células individuales por tripsinización. Los agregados celulares, obtenidos a partir de las células somáticas individuales después de 24 horas de cultivo giratorio

in vitro, fueron transplantados bajo la bursa ovárica de ratones desnudos, después de haberles extraído los ovarios. El examen histológico de los explantes, recuperados después de un mes de cultivo in vivo, reveló que a partir de agregados provenientes de gónadas masculinas se desarrollaron cordones testiculares bien de?nidos, observándose la presencia de túnica albuginea y células de Leydig (Fig. 5). Estos resultados

revelan que la determinación testicular se circunscribe a los elementos somáticos gonadales. En tal sentido, Burgoyne et al. (1988) sugirieron que el gen determinante del testículo dirige principalmente la diferenciación del linaje celular de soporte para formar las células de Sertoli, las cuales a su vez controlarían el desarrollo subsiguiente del testículo.

Por otra parte, los agregados de células somáticas femeninas, transplantados bajo la bursa ovárica de individuos receptores femeninos formaron escasos cordones testiculares (Fig. 6). En todos los explantes analizados se observó esta organización estructural, constituida por células morfológicamente idénticas a las células de Sertoli, rodeadas por células peritubulares y carente de otros elementos celulares propios del testículo como las células de Leydig. Esto indica que el linaje de soporte femenino tiene el potencial de reorientar la determinación gonadal en ausencia de células germinales y bajo las condiciones experimentales descritas, registrándose una reversión sexual. Sin embargo, los agregados de células somáticas femeninas que no habían sido inicialmente separadas de las células germinales dieron lugar, después del transplante, al desarrollo de una estructura ovárica (Fig. 7); revelando la importancia de las interacciones entre dichos linajes celulares en la determinación ovárica.

Fig. 5-Diferenciación testicular en agregados de células somáticas masculinas de ratón,

transplantadas bajo la bursa ovárica de receptores femeninos. A: formación de cordones

testiculares, donde se señala la ubicación de los núcleos de las células de Sertoli.

B: detalle de la región intersticial, indicando la presencia de células de Leydig. (Tomado

de Hashimoto et al, 1990)

Fig. 6.- Diferenciación testicular en agregados de células somáticas femeninas de ratón,

transplantados bajo la bursa ovárica de receptores femeninos. A: cordones testiculares. B: presencia de células de Sertoli en la estructura testicular. (Tomado de Hashimoto et al, 1990).

En tal sentido se ha argumentando que a consecuencia de la diferenciación de las células germinales, el

linaje celular de soporte se compromete en la formación de células foliculares (Burgoyne, 1989) in?uyendo así en la determinación ovárica.

Por su parte, las preparaciones histológicas de los explantes derivados de agregados celulares mixtos (constituidos por células somáticas masculinas y femeninas) mostraron una organización testicular con todos los elementos somáticos presentes (. 8). Esto revela que bajo las condiciones experimentales

descritas y en el momento señalado el linaje de soporte masculino toma el control de la determinación gonadal al reclutar células somáticas femeninas y experimentar en común un desarrollo testicular.

La contribución de las células somáticas femeninas en la organogénesis testicular también ha sido descrita in vivo en ratones quiméricos masculinos XX<=>XY (Patek et a1., 1991; Palmer y Burgoyne, 1991). A partir de estos estudios se determinó que las células somáticas femeninas XX se incorporan en distintas

proporciones, a formar parte de los diferentes tipos celulares del testículo, si bien las células de Sertoli resultaron ser predominantemente XY (Palmer y Burgoyne, 1991).

Es importante señalar que en las gónadas fetales de ratón de 12,5 días de gestación comienzan a aparecer los cordones testiculares en el primordio masculino. En esta etapa de la preñez las ovogonias, presentes en la cresta genital femenina, no han entrado aún en meiosis. Siendo ésta una especie que prácticamente no experimenta un retardo en la meiosis (Fig. 4), se ha determinado que a los 13 días de gestación algunas ovogonias ya muestran cambios preparatorios para la profase meiótica mientras que otras se encuentran todavía en división ovogonial (Bormn, 1961). A los 14 días post-concepción la mayoría de las ovogonias han entrado en meiosis encontrándose en la fase de Leptoteno o Zigoteno. En tal sentido, los experimentos llevados a cabo por Taketo et al. (1984) apoyan la teoría de Burgoyne (1989) y sugieren que la entrada en meiosis del linaje germinal femenino es la señal que dirige la determinación ovárica.

Fig. 7.- Diferenciación ovárica en agregados de células somáticas y germinales femeninas de raton , transplantados bajo la bursa ovárica de receptores femeninos, (Tomado de Hashimoto et al., 1990).

Fig. 8.-Organogénesis testicular en agregados celulares mixtos de ratón (células somáticas femeninas y células somáticas masculinas) transplantados bajo la bursa ovárica de receptores femeninos . (Tomado de Hashimoto et al., 1990).

En estos ensayos, los primordios gonadales femeninos, extraídos de ratones entre los 12 y los 14 días de gestación fueron transplantados bajo la cápsula renal de receptores adultos masculinos y femeninos. El tejido gonadal transplantado fue disectado después de 14 días de cultivo in vivo y analizado histológicamente. Se estudió en conjunto la morfogénesis gonadal de aquellos primordios ováricos que habían sido removidos a los 12 o 13 días de gestación (Tabla l). De las 25 gónadas fetales transplantadas a los 12 o 13 días de gestación en receptores masculinos, se detectaron histológicamente 17 ovotestis (cuyas porciones ováricas contenían ovocitos rodeados de células foliculares), 5 ovarios y 3 testículos.

Todas las gónadas transplantadas durante el período de gestación señalado en receptores femeninos desarrollaron ovarios, al igual que los primordios femeninos de 14 días de gestación, transplantados en receptores masculinos. En base a estos resultados es factible argumentar que la entrada en meiosis de las células germinales podría constituir una señal de estímulo para una ulterior diferenciación del linaje de soporte femenino, iniciándose así la determinación ovárica.

La porción femenina de los ovotestis, desarrollados a partir de los primordios ováricos transplantados a los 12 o 13 días de gestación puede ser atribuida a la existencia de una población ovogonial en fase preparatoria para la meiosis (concretamente a los l3 días), por lo cual las células de soporte circundantes se comprometen en una organización folicular y desde este momento ya no son susceptibles de revertir su determinación (Fig. 9). En tal sentido, se ha descrito la transdiferenciación de células de Sertoli a células foliculares mediante el contacto con ovocitos (McLaren, 1991). Por otra parte, la porción masculina de los ovotestis podría desarrollarse a consecuencia de la respuesta del linaje de soporte femenino a los factores humorales secretados por los testículos del receptor, organizándose en cordones testiculares. Esta capacidad de respuesta se circunscribe a las células somáticas, aún indiferenciadas, que se encuentran en las vecindades de ovogonias que no han experimentado ningún cambio para la entrada en meiosis y las cuales degenerarán debido a la acción de la sustancia inhibidora Mülleriana que ejerce un efecto inhibitorio sobre la proliferación ovogonial.

Tabla 1.- Desarrollo del primordio ovárico de ratón, transplantado bajo la cápsula renal de receptores adultos masculinos y femeninos. (Tomado de Taketo et al., 1984).

Fig. 9.- Desarrollo de ovotestis en gónadas femeninas de ratón, transplantadas, a los 12 o 13 días de gestación, bajo la cápsula renal de receptores masculinos, F: folículo ovárico.

R: rete ovari. ST: cordones testiculares. *:ovogonia en de degeneración. (Tomado de Taketo et al., 1984).

I.3.- PAPEL DE LA SUSTANCIA INHIBIDORA MÜLLERIANA EN EL DESARROLLO DE LOS ELEMENTOS GERMINALES Y SOMATICOS DURANTE LA DIFERENCIACIÓN SEXUAL.

Durante el desarrollo gonadal, células somáticas en vías de diferenciación rodean a las células germinales proporcionando así una citoarquitectura de soporte y un microambiente, propicios para el crecimiento y maduración de la línea germinal. En este microambiente se llevan a cabo interacciones de tipo

regulatorias mediadas por factores paracrinos, proteínas de regulación y metabolitos entre otros; las cuales han sido bien caracterizadas en el testículo (Skinner, 1991). No obstante, estas interacciones celulares, a nivel local, serán más activas una vez alcanzada la madurez sexual si se considera que el linaje germinal

entra en un período de reposo desde los primeros estadios de la diferenciación gonadal hasta el inicio de la pubertad. En este período el linaje celular de soporte debe ejercer, por algún mecanismo de regulación, un efecto inhibitorio sobre la maduración de la línea germinal.

La sustancia inhibidora Mülleriana (AMH) es uno de los factores paracrinos, producidos por las células de Sertoli en los estadios iniciales de la diferenciación testicular. Se ha descrito que este factor de crecimiento, perteneciente a la familia TGF ( (Rentrop et al., 1986) además de ser responsables de la regresión de los conductos de Müller podría interferir con la eventual entrada en meiosis de las células germinales masculinas (Münsterberg y Lovell-Badge, 1991).

A partir del clonamiento del gen estructural (de procedencia murina) que codi?ca para la AMH los citados autores determinaron, por hibridización in situ, el momento en el cual los transcritos correspondientes eran expresados durante el desarrollo embrionario y en el transcurso del período postnatal en ambos sexos. Dichos transcritos fueron detectados inicialmente a elevadas concentraciones en testículos fetales a partir de los 12,5 días de gestación, coincidiendo con los primeros cambios morfológicos asociados al desarrollo testicular en esa especie. La expresión de estos transcritos se prolongó por el resto de la etapa embrionaria y después del nacimiento hasta la entrada en meiosis de la primera onda de espermatogonias.

Durante el desarrollo ovárico, dichos transcritos no fueron detectados; sin embargo, su expresión fue registrada a concentraciones moderadas, antes de la pubertad en células de la granulosa, coincidiendo con la progresión hacia la culminación de la primera división meiotica (iniciada en la etapa embrionaria) relacionándose, por tanto, con el grado de maduración del folículo (Münsterberg y Lovell-Badge, 1991).

La expresión de la AMH por parte de las células de Sertoli podría prevenir la eventual entrada en meiosis de las células germinales que están siendo rodeadas por el linaje celular de soporte para formar los cordones testiculares. De hecho, se ha demostrado que aquellas células germinales que no logran colonizar la cresta genital durante el proceso migratorio, terminando por ocupar posiciones ectópicas, experimentan la entrada en meiosis en sincronía con las células germinales en el ovario e independientemente del sexo genético del embrión. Estas observaciones fueron realizadas por Upadhyay y Zamboni (1982) quienes llevaban a cabo un estudio sobre la morfogénesis de la glándula adrenal en ratones, advirtiendo la presencia de células germinales ectópicas a nivel de las regiones cortical y medular. Estos elementos germinales eran además susceptibles de experimentar una sustancial diferenciación, expresando, en una etapa post-natal, rasgos morfológicos característicos de los ovocitos jóvenes sin evidencia de un desarrollo ulterior ya que disminuían progresivamente en número hasta degenerar. En base a estas observaciones dichos autores postularon que en mamíferos el potencial de diferenciación de las células germinales es esencialmente femenino y sólo puede ser modi?cado en el testículo.

Por otra parte, las investigaciones adelantadas en relación al efecto de la AMH sobre el desarrollo sexual en cultivos de tejido ovárico y en animales transgénicos, introducen nuevos elementos en la interpretación del patrón de expresión in vivo de la AMH.

A partir de cultivos in vitro de tejido ovárico, extraído de embriones de rata y sometido a la acción de la AMH (de origen bovino) Vigier et al. (1987) determinaron que el efecto de este factor sobre los elementos germinales y somáticos en cultivo es modulado por la concentración de dicho factor, tiempo de exposición y grado de diferenciación gonadal.

El efecto ejercido por la AMH sobre las células germinales se re?eja en la proliferación celular y en la maduración meiótica. La AMH inter?ere con la replicación ovogonial reduciendo, en una proporción dosis-dependiente, la población de células germinales en ovarios recuperados a los 14 días post-concepción. Por su parte, la maduración meiótica experimenta un retardo sólo en presencia de elevadas concentraciones de la AMH, cuyos niveles fueron establecidos en base a un rango de concentración umbral de 0,75-1,125 (g/ml (Fig. 10).

Al prolongarse el periodo de cultivo y en consecuencia el tiempo de exposición a la AMH, las células germinales experimentaron una tendencia más acentuada en relación a las alteraciones antes descritas. Por otra parte, las muestras de tejido ovárico que habían superado el período en el cual se verifica la entrada en meiosis de la línea germinal (17 días post-concepción) no experimentaron ninguna reducción en la población de células germinales y tampoco un retardo en la progresión de la profase meiótica en presencia de la AMH. De hecho, los experimentos realizados en tejidos ováricos, recuperados a

los 20 días de gestación no mostraron diferencias con respecto a los controles (Fig.11).

A concentraciones moderadamente elevadas, la AMH modi?ca el desarrollo del tejido somático gonadal en primordios ováricos procedentes de embriones de 14 días de gestación y mantenidos en cultivo durante cinco días.

Bajo éstas condiciones, los elementos somáticos se organizaron formando estructuras similares a los cordones testiculares (Fig. 12), mientras que no se observaron modi?caciones en cultivos de tejidos ováricos extraídos a los 20 días de gestación. En tal sentido, la reversión sexual del primordio gonadal femenino, antes de la entrada en meiosis de la línea germinal y en presencia de la AMH, está

acompañada por una disminución signi?cativa de la población ovoganial.

Las elevadas concentraciones de AMH, registradas in vivo a nivel de las células de Sertoli desde los inicios del desarrollo testicular, sugieren que dicho factor también actúa sobre la actividad proliferativa de las células germinales.

Fig. 10.-Efecto de las concentraciones crecientes de la AMH sobre la población total de células germinales y la maduración meiótica de los ovocitos en ovarios de rata, extraídos a los 14 días de gestación y mantenidos en cultivo durante 5 días. (Tomado de Vigier et al, 1987).

Fig. 11.- Efecto del tiempo de exposición a la AMH sobre la población germinal y la progresión de la maduración meiótica de los ovocitos en ovarios de rata, extraídos a los 14 y 20 días de gestación. (Tomado de Vigier et al., 1987).

De hecho, las células germinales masculinas experimentan una actividad mitótica sincronizada (Eddy et al, 1981) hasta alcanzar simultáneamente la condición de pre-espermatogonia y detener su crecimiento en la fase G1 del ciclo celular. Esta inhibición proliferativa debe coincidir con la expresión de la AMH que a la vez

previene la posible entrada en meiosis de las pre-espermatogonias.

Es probable que la expresión in vivo de la AMH por parte de las células de la granulosa justo antes de la pubertad y a concentraciones moderadas constituya una señal de estímulo para completar la meiosis.

Por otra parte, se ha determinado que la expresión crónica de la AMH en ratones transgénicos compromete la viabilidad de las células germinales femeninas y la determinación gonadal, una vez depletado el primordio gonadal de los elementos germinales (Behringer et al., 1990). Las hembras al nacer, ya presentan

ovarios con un número reducido de células germinales, las cuales van degenerando progresivamente. A1 cabo de dos semanas ya no son visibles y el tejido somático gonadal se organiza formando cordones testiculares.

Por último, Vigier et al. (1987) y Behringer et al. (1990) postularon que la expresión de la AMH promueve una ulterior diferenciación de las células de Sertoli, una vez que el factor determinante del testículo haya dirigido la diferenciación del linaje celular de soporte. En tal sentido, la AMH estaría actuando no solamente como un factor paracrino sino también autocrino.

Síndrome Freemartin

II.1-DESCRIPCION.

En bovinos, el 92 % de las hembras nacidas de partos gemelares heterosexuales o embarazos múltiples son estériles (Marcum, 1974). Esta condición está asociada a la expresión de diferentes estados de intersexo y es reconocida como entidad clínica bajo la denominación de Síndrome Freemartin.

La aparición temprana de una circulación placentaria común entre los fetos en desarrollo es un hecho invariablemente relacionado con el surgimiento de esta condición (Keller y Tandler, 1916; Lillie, 1917). Por lo tanto, la presencia de una anastomosis placentaria durante la embriogénesis temprana modi?ca el desarrollo sexual de la hembra y propicia el intercambio recíproco de células somáticas, principalmente hematopoyéticas (Owen, 1945; Stone y Palm, 1951) y posiblemente de células germinales (Ohno et al.,1962; Ohno y Gropp, 1965), originando un quimerismo de poblaciones celulares diploides XX/XY en los tejidos comprometidos.

Los machos, generalmente, no se ven afectados en cuanto a su potencial reproductivo, aunque algunos autores han observado una disminución en la fertilidad (Stafford, 1972; Dunn et al., 1977). El síndrome Freemartin ha sido descrito además en ovinos (Alexander y Williams, 1964; Bruére y MacNab, 1968), porcinos (Hughes, 1929) y caprinos (Ilbery y Williams, 1967; Hamerton et al., 1969).

Los estudios histológicos realizados a nivel gonadal en hembras bovinas freemartin, han revelado la existencia de un rango de expresión fenotípica que oscila desde ovarios modi?cados, donde la región medular está constituida por estroma, pasando por la detección de ovotestis, fenotipo característico de un hermafroditismo verdadero (Goodfellow et al., 1965) hasta observar el desarrollo de tejido testicular con túbulos seminíferos bien de?nidos y espermatogonias presentes, sin evidencia de actividad espermatogénica (Herschler y Fechheimer,

1967) (Fig. 13). Esta progresiva reversión del sexo gonadal está acompañada de una expresión ambigua de los genitales internos, que en casos de extrema virilización es posible advertir la presencia de epidídimo, vasos deferentes y vesículas seminales. A pesar de las malformaciones congénitas detectadas a nivel de los genitales internos, el síndrome Freemartin (salvo escasas excepciones) no está asociado a alteraciones signi?cativas de los genitales externos que conservan un fenotipo femenino.

II.2-ETIOLOGIA.

Se han propuesto dos teorías (i.e. la teoría hormonal y la teoría celular) para explicar la etiología de este síndrome. La teoría hormonal postulada por Lillie (1916) supone la acción de un factor humoral, secretado por el feto masculino, el cual sería responsable de inducir la masculinización del tracto reproductor de la hembra Freemartin. En efecto, entre los 50 y 80 días de gestación se observa una regresión simultánea de los conductos de Müller en gemelos heterosexuales

Fig.- 12.- Efecto de la AMH (3 (g/ml) sobre la estructura histológica de las gónadas de ratas, recuperadas a los 14 días de gestación y mantenidas en cultivo durante 5 días. A: control. Se observan numerosas células germinales, la mayoria en zigoteno (Z). B: en presencia de AMH, Se detecta la formación de cordones testiculares. (Tomado de Vigier el aL, 1987),

Fig. 13.- A: Estructura histológica gonadal de un individuo masculino bovino de 11 meses de edad. B: organización del tejido gonadal en una hembra Freemartin de 11 meses de edad. Se observa un desarrollo incipiente de los túbulos seminíferos y abundante tejido intersticial. (Tomado de Short et al., 1969).

La regresión simultánea de los conductos paramesonéfricos se atribuye a la AMH, secretada por los testículos del feto masculino (Vigier et al., 1984), En consecuencia, este factor actúa a nivel sistémico; confirmado por los niveles séricos similares de AMH, registrados en ambos fetos.

Posteriormente, en 1987 Vigier et al. determinaron que la AMH también es responsable de la reversión del sexo gonadal. La organogénesis testicular en bovinos se inicia a los 39-40 días de gestación mientras que a nivel ovárico las primeras premeioticas son visibles a partir de los 75 días (Jost et al., 1972).

Si durante el intervalo de tiempo que separa estos eventos se verifica la anastomosis vascular, la AMH producida por las células de Sertoli de las gónadas masculinas ejercería un efecto inhibitorio sobre la población ovogonial y el tejido somático de las gónadas Freemartin se organizarían formando cordones testiculares (Vigier et al., 1987).

De acuerdo a las evidencias experimentales descritas en capítulos precedentes el grado de reversión gonadal, registrado en las hembras Freemartin estaría asociado a la proporción de ovogonias que no han experimentado la entrada en meiosis en el momento de producirse la anastomosis vascular. Si la con?uencia coriovascular entre los fetos tiene lugar después de la entrada en meiosis de las ovogonias, presentes en las gónadas femeninas, la determinación ovárica no se altera; sin embargo, el efecto persistente de la AMH podría dar lugar a la expresión fenotípica de ovarios modi?cados, tal como se observa ocasionalmente en algunos individuos afectados por este síndrome.

Por otra parte, la teoría celular propone que el patrón de quimerismo observado en gemelos heterosexuales no solamente se circunscribe a las células somáticas sino que también compromete a las células germinales (Ohno et al., 1962). De hecho, se ha descrito la presencia de células germinales de cariotipo masculino (XY) en gónadas Freemartin (Kanagawa et al., 1965; Ford y Evans, 1977). En referencia a ello, Brogger y Aagenaes (1965) han sugerido que la colonización del primordio gonadal femenino por parte de las células germinales XY alteraría el proceso de diferenciación, promoviendo el desarrollo testicular. No obstante, Evans et al. (1977) con?rmaron la presencia de células germinales XY en diakinesis, en el tejido ovárico de ratones quiméricos femeninos fértiles XX ( XY. Por otra parte, estos hallazgos coinciden con los estudios realizados por Upadhyay y Zamboni (1982) en relación al potencial de diferenciación femenino que retienen las células germinales XY en posiciones ectópicas. Estos argumentos dejan sin sustento la teoría celular, manteniendo en vigencia la teoría hormonal para explicar la etiología de este síndrome.

Identificación del factor determinante del testículo

La determinación testicular está mediada por un gen que codi?ca para el factor determinante del testículo (TDF) localizado en el cromosoma Y (Sinclair et al.,l990; Gubbay et al., 1990; Koopman et al., 1991) cuyo producto funcional desencadena la expresión secuencial de una serie de genes que conducen a1 desarrollo testicular. Desde hace varios años numerosos investigadores se han dedicado a la búsqueda de este gen.

Durante algún tiempo se mantuvo la hipótesis de que los antígenos menores de histocompatibilidad H-Y eran los responsables de la determinación testicular (Wachtel et al., 1975). No obstante, dejó de tener vigencia al comprobarse el desarrollo testicular en ratones, carentes del gen que codi?ca para dicho antígeno de super?cie (McLaren et al., 1984).

Más tarde, en 1987 Page y colaboradores lograron clonar una secuencia nucleo?dica de 230 Kb, localizada en el extremo distal del brazo corto del cromosoma Y humano, adyacente a la región pseudoautosomal. Dentro de esta secuencia identi?caron un marco de lectura que codi?ca para una proteína, dotada de dominios de unión al ADN (ZFY); siendo por tanto un potencial factor de transcripción y un posible candidato como TDF (Fig. 14). Esta secuencia nucleotídica no fué detectada en el genoma de un propósito femenino de complemento cromosómico 46, X t (Y; 22) pero pudo ser advertida en un propósito masculino de constitución genética XX, concluyendo que podía tratarse del TDF. Por otra parte, Koopman et al. (1989) al estudiar el patrón de expresión in vivo de este gen en ratones, con?rmaron la presencia de dos loci homólogos (Zfy-1 y Zfy-2); uno de los cuales se expresa durante la etapa embrionaria (Zfy-1).

Sin embargo, este transcrito no fué detectado en los testículos fetales de mutantes, homócigos para la forma más severa de la mutación W (We/We), excluyendo la eventual identi?cación de Zfy como TDF.

En 1990 Sinclair y colaboradores identi?caron, a través de un mapeo de restricción, una secuencia sobre el cromosoma Y humano, comprendida dentro de la región de 35 Kb adyacente al límite pseudoautosomal, donde residiría el TDF que denominaron SRY (Fig. 15). Dicha secuencia nucleotidica contiene un marco de lectura abierto con un motivo de 80 aminoácidos, el cual comparte una alta homología con secuencias Y-especí?cas presentes en un amplio rango de mamíferos euterios (Fig. 16).

Fig- 14.- Mapa del extremo distal del brazo corto del cromosoma Y. Se muestra el límite pseudoautosomal y la localización del gen ZFY. (Tomado de Palmar et al, 1989),

Fig. 15.- Mapa del extremo distal del brazo corto del cromosoma Y humano. Se muestra la región pseudomnosomal, los sub-clones construidos a lo largo del recorrido del genoma (pNB, (53, (4 y (51 y las sondas que reconocen secuencias Y-especí?cas, una de las cuales (pY53,3) hibridiza con el genoma de otras especies (bovino y murino). (Tomado de Sinclair et al, 1990).