Determinación de Coliformes Totales y Fecales. Método de recuento por dilución en tubo: NMP
PRÁCTICA Nº
05
Introducción
Existen diversos métodos para cuantificar el
número de microorganismos presentes en muestras
líquidas y sólidas. Dentro de las técnicas
más comunes se encuentra el recuento directo por
microscopia de fluorescencia, así como los procedimientos
basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos
en medios de cultivo sintéticos sólidos o
líquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras
de Colonias
(UFC) o la estimación por el método del
Número Más Probable (NMP).
El método del número más probable
fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo
ampliamente utilizado. En un principio este método fue
empleado para estimar el número de microorganismos en
muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que
también puede ser aplicado para la determinación de
microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos
marinos y suelos contaminados, por tanto este método es
aplicable para estimar el número de microorganismos en
muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como
anaerobias.
Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes
totales, capaces de fermentar la lactosa a 44º C en vez de
37 ºC como lo hacen los totales.
Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes
presentes en heces están formados por Escherichia
coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los
Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces
de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan
mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos
últimos se denominan termotolerantes por su capacidad de
soportar temperaturas más elevadas. Esta es la
característica que diferencia a Coliformes Totales y
Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse
fuera del intestino de los animales homeotérmicos es
favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia
orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han
utilizado como indicador ideal de contaminación fecal. Su
presencia se interpreta como una indicación de que los
organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia
indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de
organismos productores de enfermedades.
I. Objetivos:
Familiarizarse con los métodos de recuento,
especialmente con el de NMP.Detectar bacterias coliformes totales y
fecales.Detectar si la muestra traída es apta para el
consumo humano.
Materiales
Muestra: Leche
Medios de cultivo: Caldo Brilla
(presuntivo), agar MacConkey, agar Endo, EMB, CB.Caldo EC
Tubos de dilución
Pipetas
Bombilla de
aspiraciónPlacas de Petri
Mechero Bunsen
Baño María
Estufa
Gradillas
Anzas microbiológicas
calibradas
Procedimiento
a. Método para coliformes
totales:
Preparamos diluciones hasta
10-3.Sembramos dos, tres o cinco tubos por cada
dilución, según sea el caso.
- Los resultados se dan en por gr o mL
En el caso de agua se sigue de la
otra forma:
Cuando se trate de aguas, los resultados se
darán por 100 mL.Luego, incubar a 35 ºC ± 1 por 24
h.Realizar la 1ra lectura (determinar la presencia
de gas). Ésta se observa en las
campanas.Los tubos que no sean positivos se incuban por
otras 24 h más.
b. Métodos para coliformes
fecales:
Para coliformes fecales se utilizan dos
métodos:En el Primer Método se cogen los
tubos positivos del caldo Lauril Sulfato Triptosa y se
lleva una asada al caldo EC utilizando una asa que tenga
3 mm de diámetro.Luego, estos tubos se incuban a 45.5 ºC
± 0.2, en baño María con
agitación constante por 24 h.Si hay gas a las 24 o 48 h. es positivo para
coliformes fecales.El Segundo Método es la llamada
prueba de Mackenzie.En esta se usa el caldo Brila mas agua
Peptonada.Se parte del caldo MacConkey, los tubos
positivos de la prueba de coliformes totales se siembran
en este caldo, si aquí vuelve a salir positivo se
le realizan las dos pruebas sgtes:Sólo se tomará esta prueba
como positiva si los dos tubos (caldo Brilla y caldo
Peptonado) resultan positivos.Al tubo con caldo peptonado se le agrega el
reactivo de Kovacs para hacer la prueba de
Indol.Para ver coliformes termorresistentes, de
los tubos que hayan salido positivos se siembra una
asada en agar MacConkey y se aíslan las
colonias características.De los tubos positivos se los siembra en
otros tubos en caldo EC con campana de
Durham.
Resultados
De los tubos sembrados en el caldo Brilla
(prueba presuntiva), se obtuvo los sgtes. resultados
(a las 24 horas) para coliformes totales:
Para realizar la prueba confirmativa se
sembró en agar MacConkey, luego de la
incubación por 24 horas, se obtuvo los sgtes.
resultados:
Por lo tanto, se puede decir que el
resultado del número más probable es:
2–2–2.Para este resultado las tabla de NMP con un
límite de confianza de 95% para la prueba de
fermentación utilizando 3 diluciones con dos
repeticiones (2 tubos), nos da un valor de
>1100 bacterias/mL de leche.
Conclusiones
Los valores mínimos permisibles
usados en México, por ejemplo, nos dan los
sgtes. valores de referencia para diversos
alimentos:
Especificaciones
microbiológicas establecidas para diversos
alimentos.*NOM-093-SSA1-1994 ; **
NOM-121-SSA1-1994; *** Límites
microbiológicos de la ICMSF (International
Commission on Microbiological Specifications for
Foods).La muestra traída por nuestro grupo
fue de leche cruda. Al hacer un comparativo de
nuestros resultados vemos, por ejemplo, que "La Norma
Venezolana para Lácteos" da como valores
límites los sgtes. valores:
Vemos que el límite dado para
Coliformes Totales en leche cruda está dada en
UFC/ml, entonces, comparando nuestra muestra
de leche, traída de un puesto lechero del
sector Santa Rosa – Chiclayo con las muestras
dadas en el cuadro, la podemos calificar como una
leche DE TERCERA.
RESULTADOS COLIFORMES
FECALESPara la prueba de coliformes fecales se
utilizó como método la prueba de
Mackenzie, aunque, al no tener todos los medios
necesarios, se hicieron algunas
modificaciones.De los tubos positivos del Caldo Brilla si
inoculó, de cada uno, a tubos con Caldo
E-C.Luego se incubó los tubos a 44
ºC ± 0.1 por 24 h.Pasado el tiempo se leyó los
resultados.De los tubos positivos se pasó a
placas con agar MacConkey, estas se incubaron por 24
h a 37 ºC (se debió pasar a dos tubos uno
con caldo peptona y otro con caldo
Brilla).Pasado el tiempo, se leen las placas y se
realizan las pruebas bioquímicas para las
colonias lactosa positivas (L+).
RESULTADOS:
Como todos los tubos del caldo Brilla
salieron positivos, se sembraron en tubos con caldo
EC (seis tubos).Después de la incubación de
los tubos con caldo EC se obtuvieron los sgtes.
resultados:
De los tubos positivos se sembró en
agar MacConkey, de ellas todas salieron lactosa
positivas:
De las colonias lactosa positivas se
escogió una y se le realizó las sgtes.
pruebas bioquímicas: IMViC +
descarboxilación de la lisina (LIA) + prueba
de fermentación de carbohidratos
(TSI).Se obtuvieron los sgtes.
resultados:
De los resultados obtenidos se puedo
identificar a Klebsiella
azaenae.Entonces, como Klebsiella pertenece
al grupo de las coliformes fecales, podemos decir que
la muestra tratada (leche cruda) tenia presencia de
estas en un número de (resultado NMP
2-2-0):
NMP de coliformes fecales = 210
bacterias/ mL.Algunas sp. del género
Klebsiella junto con otras de los géneros
Citrobacter y Enterobarter se cree que
son las causantes de enfermedades gastrointestinales
agudas y crónicas. Estos microorganismos pueden
ser recolectados de ambientes naturales tales como los
bosques, el agua fresca así como también de
los productos provenientes de la agricultura (vegetales)
donde residen normalmente como microflora.También pueden ser recolectados de las
heces de individuos saludables que no presentan
síntomas de la enfermedad. También pueden
ser recolectadas a partir de los productos
lácteos, los mariscos crudos y los vegetales
frescos y crudos. Estos organismos al contaminar las
aguas pueden estar presentes en el suelo usado para la
producción de cultivos y en las aguas de pesca de
mariscos; como resultado éstos pueden constituir
un peligro para la salud.Preguntas
¿Cuáles son los diferentes
métodos para coliformes totales?
Para el conteo de coliformes totales se
tienen tres métodos principalmente.El primero se basa en la
técnica del número más probable
(NMP), utilizando caldo Lauril Sulfato Triptosa
seguido de la confirmación de los tubos
positivos de formación de gas en caldo Lactosa
Bilis Verde Brillante. La incubación es a 35
ºC.El segundo método emplea
únicamente el caldo McConkey. La
incubación es a 37 ºC.El tercer método usa el caldo Lactosa
Bilis Verde Brillante a 35 – 37 ºC,
seguido de confirmación en agar Bilis
Rojo-Violeta o en agar Endo.
¿Qué características
tienen las colonias de coliformes en agar Endo y en
agar Eosina Azul de Metileno?
El medio Eosina Azul de Metileno (EMB) es un
medio de plaqueo diferencial que puede usarse en
lugar del agar MacConkey en el aislamiento y
detección de Enterobacteriaceae o de
bacilos coliformes de muestras con bacterias mixtas.
Los colorantes anilínicos (eosina y azul de
metileno) inhiben a las bacterias Gram positivas y a
las Gram negativas exigentes. Se combinan para formar
un precipitado a pH ácido y, de este modo,
sirven también como indicadores de la
producción de ácido. Las colonias
lactosa (+) dan colonias de color violeta, las de
E. coli presentan un característico
brillo verde metálico, las de
Enterobacter presentan un color violeta sin
brillo metálico (ojo de buey). Las colonias de
Klebsiella son siempre mucosas, grande y
ligeramente rosadas.El medio Endo es un medio selectivo para
demostración de E. coli fecal y
coliformes en los más diversos materiales. El
sodio sulfito y la fucsina inhiben a las bacterias
Gram (+). E. coli y coliformes utilizan
lactosa con formación de aldehído y
ácido. Por otra parte, el aldehído
libera fucsina a partir de la combinación:
fucsina sulfito, lo que da lugar a la
coloración roja de las colonias. En este medio
las colonias lactosa (+) presentan una
coloración roja, p.ej. E. coli es de
color rojo con brillo metálico estable.
Enterobacter aerogenes y otros presentan
colonias rojas hasta rojizas, semiesféricas y
mucosas.
Referencias
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AGUA (2005) Obtenido el 07 de febrero de 2008 en
http://www.ubu.es/investig/aulavirtual/trabajos_05/Analisis_microbiologico_del_agua.pdfANALISIS MICROBIOLOGICOS (2004)
Obtenido el 07 de febrero de 2008 en
http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdfFACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
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Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3º
Edic. Lima.FUENTES, A. F. y otros (2005).
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Público de la Ciudad de Sonora, México.
Revista Salud Pública y Nutrición. Vol.
6 Nº 3. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www.respyn.uanl.mx/index.htmlL. ORTIZ, M. (2003) Material
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Alimentos: Recuento de enterobacterias. Obtenido el
01 de febrero de 2008 en
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htmMICROBIOLOGIA APLICADA: Manual
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agua de consumo humano. Obtenido el 07 de febrero de
2008 en
http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdfTHATCHER, F. S. y D. S., CLARK
(1993) Análisis Microbiológico de los
Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza.VARGAS, T. (2005) Calidad de la
Leche: Visión de la Industria Láctea.
Obtenido el 01 de febrero de 2008 en
http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/xcongreso/P297_CalidadLeche.pdf
TABLA NÚMERO MÁS
PROBABLE PARA COMBINACIONES DE 2 TUBOSNúmero de tubos
positivos con el inóculo
indicadoÍndice
NMP0
0
0
<3,0
0
0
1
7
0
1
0
11
0
1
1
14
0
2
0
16
1
0
0
9
1
0
1
14
1
0
2
20
1
1
0
21
1
1
1
35
1
2
0
29
1
2
1
36
2
0
0
23
2
0
1
38
2
0
2
75
2
1
0
43
2
1
1
150
2
1
2
240
2
2
0
210
2
2
1
470
2
2
2
>1100
Adaptado de Ortiz, 2003 y
Fuentes, 2005.Autor:
Rómulo Aycachi
IngaASIGNATURA : Microbiología
de los Alimentos IDOCENTE :Dra. Graciela Albino
CornejoCICLO :2007 – II
Enviado por:
Mireya
ESCUELA PROFESIONAL DE
BIOLOGÍALambayeque, 14 de febrero de
2008.
