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Ruptura celular

Enviado por mireya





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Rompimiento Celular Una gran cantidad de productos de interés son  intracelulares y para obtenerlos se precisa la  desintegración de la célula para liberar su contenido al  medio.

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Métodos DRÁSTICOS: Rompimiento total de la  célula. SUAVES: alteración química de las  cubiertas celulares,  permeabilización que  facilite la salida del  producto.

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Temperatura. La selección de una u otra técnica dependerá las características del producto que se desea purificar, tales como: •Resistencia a: • Medios alcalinos. • Solventes. • Detergentes. • Enzimas. •Temperatura • Esfuerzo de corte. La técnica utilizada determinará el tamaño de los desechos que se producirán.

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Métodos No Mecánicos. Mecánicos.

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No mecánicos: Lisis celular Enzimático Químico (detergentes, disolventes) Físicos (Choque osmótico) Tratamiento Alcalino Termalización Permeabilización

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Métodos Químicos: Choque osmótico. Permeabilización. Disolución lipídica. Tolueno 10 % de la biomasa Digestión enzimática. Enzimas que atacan la pared celular Lisozima: ataca la capa de péptidoglucano de la pared celular. Tratamiento alcalino.

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Mecánicos: - Homogenizador a presión. - Prensa francesa. - Ultrasonido. - Molino de Bolas o Perlas. - Congelación. - Mortero. - Agitación con Abrasivos. - Microfluidizadores.

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Los métodos mecánicos implican someter a las células a una deformación en fase sólida o líquida. Los métodos no mecánicos utilizan reactivos que pueden ser químicos o enzimáticos, cuyo objetivo es romper o lisar la célula.

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a Actualmente los métodos mecánicos son aplicados industrialmente, mientras que los no mecánicos se utilizan principalmente pequeña escala (laboratorio).

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Uno de los métodos no mecánicos más utilizado a nivel de laboratorio es a través del uso de reactivos químicos como disolventes.

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Métodos No-Mecánicos Pueden ser de dos tipos: •Agente químicos •Solventes orgánicos • Detergentes • Alcalis • Agua (shock osmótico) •Enzimáticos se trata de enzimas que permeabilizan en forma selectiva las membranas celulares, tales como lisozima, glucanasas, mananasas, etc. Los métodos no-mecánicos son fáciles de escalar, si uno necesita tratar 10 veces más materia orgánica basta con adicionar 10 veces más reactivo químico o enzimático.

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Métodos No-mecánicos Técnicas Permeabili -zación  Enzimático Principios Permeabilización de  la pared celular, lo  cual produce el  rompimiento de la  Stress Suave Costos Caro Ejemplos Tratamiento de  M.  lysodeikticus célula con lisozima. Shock  Osmótico Solubiliza- ción Disolución  de Lípidos Ruptura  Osmótica de la  membrana Disolución de la  membrana celular  con detergentes Solventes orgánicos  que disuelve la pared  celular y también la  Suave Suave Modera -do Barato Moderada- mente  Caro Barato Ruptura de  Células de  Glóbulos Rojos. Rompimiento  de bacterias   con SDS. Rompimiento  de levaduras  desestabilizan con tolueno. Tratamien -to con  álcalis Solubilización de la  membrana por  saponificación de los  lípidos Fuerte Barato

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de Métodos Mecánicos El rompimiento se lleva a cabo por acción mecánica, pudiendo ser: • Fricción • Efecto de la presión • Colisiones. Estos métodos incluyen las operaciones unitarias ultrasonido, homogenización , molinos de bolas, etc. Estos métodos resultan ser agresivos con las proteínas de interés, debido principalmente a la generación de calor. Adicionalmente, el escalamiento resultan ser un problema significativo.

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animales. Métodos Mecánicos Técnicas Homogeni- zador  de  cuchillos Homogeni -zador   alta  presión Ultrasonifi -cación Molienda Principios Las células son  rotas en un  mezclador  Las células son forzadas a pasar a través de un pequeño orificio lo que produce que se rompan por el esfuerzo de corte Las células son quebradas en una cavidad ultrasónica Las células son Stress Moderado Fuerte Fuerte Moderado Costos Moderado Moderado Caro Barato Ejemplos Rompimiento  de tejidos y  células  Tratamiento a  gran escala de  suspensión de  células. Rompimiento de  suspensiones de  células a lo  menos en  pequeña escala rotas por medio de una molienda con abrasivos Molinos  de bolas Las células son trituradas con bodas de acero Fuerte Barato Rompimiento a  gran escala para  suspensiones de  células y células  o vidrio de plantas

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MÉTODOS DE PERMEABILIZACIÓN Alteran la estructura de la pared y la  membrana celular para facilitar la difusión  de productos hacia el exterior.

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MÉTODOS DE PERMEABILIZACIÓN Ósmosis Tolueno al 5% Detergentes aniónicos Detergentes no aniónicos (SDS y Tritón) Agentes caotrópicos (guanidina y urea) EDTA

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Tratamiento enzimático Teoría Existen enzimas que pueden hidrolizar la membrana celular de microorganismos. Cuando la membrana ha sido suficientemente permeabilizada, algunos compuestos intracelulares pueden ser liberados al medio. Una comparación entre un proceso de rompimiento y otro de permeabilización.

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Metodología El modo de acción es muy simple basta con agregárselo a una suspensión y se produce una reacción muy rápida la cual deteriora la pared celular. La reacción es selectiva y ataca a determinadas estructuras de la pared celular como son las glucanasa, mananasas. Ventajas: Método suave y selectivo escalable Desventajas: escala. Costo de la enzima lo hace difícil de utilizar a gran Microorganismo Bacterias Levaduras Células de plantas Enzima Lisozima Complejo glucanasa- mananasa Celulosas y  peptinasas Efecto Ruptura de los enlaces ß-1,4  entre N-acetil murámico y N- acetil glucosamida Rompe la capa de glucano y  de manano Rompen capa de celulosa y  peptino

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y Shock Osmótico Teoría Resulta ser uno de los métodos más simple: 1. Las células se colocan en una volumen de agua 2 veces mayor que el volumen de células. 2. Bajo estas condiciones las células se hinchan, debido a un simple flujo osmótico que se produce debido a que las células contienen solutos (los causantes del flujo osmótico de agua al interior de la célula). 3. Las células se hinchan y algunas llegan a reventarse. La susceptibilidad de las fuertemente de su tipo. células es relativa depende

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Los glóbulos rojos son fáciles de lisar. Las células vegetales son muchos más difíciles, dado que sus paredes contienen compuestos que son impermeables al flujo osmótico. Se puede calcular la presión necesaria para romper células a partir de la ley van´t Hoof. La cual se deduce desde la condición de equilibrio : DP = - R*T*c1 Donde c1 : Concentración de solutos en el interior de la célula. En el caso de una célula que contiene una concentración de solutos del orden de 0.2 M, calculando la diferencia de presión alcanzara valores del orden de -5 atm (dentro mayor presión que afuera).

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Solubilización Teoría Es uno de los método no-mecánico rompimiento de células. más utilizado para el Los detergentes tienen una zona hidrofílica y otra hidrofóbica, por esta razón pueden interactuar tanto con el agua como con los lípidos. Su habilidad se basa en la solubilización de los lípidos de la pared celular. Los detergentes más utilizados son de tres tipos: •Detergente aniónico •Detergente catiónico •Detergente no-iónico y polidispersante

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Ejemplos Detergentes aniónicos •Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) CH3(CH2)11 SO3- Na+ •Sulfonato de Sodio CH3(CH2)9 -Phenyl-SO3- Na+ •Tauroclorato de Sodio El SDS es uno de los detergentes aniónicos más ampliamente estudiados. Entre los materiales aniónicos se encuentran los jabones (sales de ácidos grasos), estos jabones dependen del grupo de ácido carboxílico que tengan y resultan efectivos a altos pH donde el grupo se encuentra ionizado. A su vez resultan ineficientes en aguas duras que contengan iones calcio que pueden reaccionar con ellos y formar compuestos insolubles. Las desventajas de los detergentes tradicionales se puede superar si se reemplazan los grupos carboxilos por grupos sulfatos. Los sulfatos que contienen grupos fenilos son más efectivos que los compuestos que contienen grupos alquilos, debido principalmente que no son fáciles de degradar microbianamente, como son los detergente utilizados para lavado.

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Ejemplos Detergentes cationicos •Bromuro de Catiltrimetil Amonio (CTAB) Br- CH3(CH2)15 N+ (CH3)3 Son detergentes más suaves (tipo shampoo), por lo cual se produce un rompimiento más suave de las células. Ejemplos •Triton X-100 Detergente no-iónicos C8H17-Phenyl-(OCH2CH2)9.5OH Son generalmente polímeros solubles en agua, se utilizan en los detergente para lavar vajilla. Estos detergente también tienen una parte hidrofóbica y una hidrofílica, pero la parte hidrofílica no es ni un sulfato ni un tetraalquilamonio sino un alcohol. .

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A bajas concentraciones de detergente no se produce degradación de los lípidos, pero a alta concentración se produce una degradación que resulta lineal a la concentración de detergente, junto a esta variable también se altera la tensión superficial de la solución. La relación que se produce entre la solubilización y otros fenómenos es que el detergente forma micelas, en cuyo interior se encapsulan los lípidos digeridos (Cabezas hidrofílicas y colas hidrofóbicas que están en contacto con la sopa de lípidos).

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Procedimiento 1. Se coloca un determinado volumen de detergente concentrado por un volumen de células. Generalmente la mitad de volumen de detergente que de volumen de células. 2. El detergente rompe la membrana celular. 3. La suspensión resultante se centrifuga para remover los fragmentos de células y luego se pasa a través de una columna de adsorción o por etapas de extracción para aislar el producto.

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Tratamiento con solvente (disolución de lípidos) Es una técnica la cual no ha sido muy documentada, sólo se requiere de información experimental. Una buena forma de seleccionar el solvente es analizar la volatilidad (desde manuales), este parámetro puede relacionarse con las interacciones lípido solvente, poniendo atención en el calor de mezcla. Solventes con similar solubilidad atacarán los lípidos de forma similar. Procedimiento 1. El método consiste en adicionar la suspensión de biomasa un volumen de tolueno del orden de un 10% de biomasa. 2. El tolueno es absorbido por las células, las cuales se hinchan y luego explotan. 3. El contenido de las células se libera al medio y luego puede ser separado.

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• • • • • Existen otros solventes que puede ser utilizados como : Benceno ( que es cancerigeno y de una alta volatilidad, el tolueno también es cancerigeno pero de más baja volatilidad). Cumeno Clorobenceno Xileno Octanol (Altos alcoholes)

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