Rompimiento Celular
Una gran cantidad de productos de interés son
intracelulares y para obtenerlos se precisa la
desintegración de la célula para liberar su contenido al
medio.
Métodos DRÁSTICOS:
Rompimiento total de la célula.
SUAVES:
alteración química de las
cubiertas celulares,
permeabilización que
facilite la salida del producto.
Temperatura. La selección de una u otra técnica
dependerá las características del producto que se
desea purificar, tales como: •Resistencia a: • Medios
alcalinos. • Solventes. • Detergentes. • Enzimas.
•Temperatura • Esfuerzo de corte. La técnica
utilizada determinará el tamaño de los desechos que
se producirán.
Métodos No Mecánicos. Mecánicos.
No mecánicos: Lisis celular Enzimático
Químico (detergentes, disolventes)
Físicos (Choque osmótico)
Tratamiento Alcalino Termalización
Permeabilización
Métodos Químicos: Choque osmótico.
Permeabilización. Disolución lipídica.
Tolueno 10 % de la biomasa
Digestión enzimática.
Enzimas que atacan la pared celular
Lisozima: ataca la capa de
péptidoglucano de la pared celular.
Tratamiento alcalino.
Mecánicos: – Homogenizador a presión. –
Prensa francesa. – Ultrasonido. –
Molino de Bolas o Perlas. –
Congelación. – Mortero. –
Agitación con Abrasivos. –
Microfluidizadores.
Los métodos mecánicos implican someter a las
células a una deformación en fase sólida o
líquida. Los métodos no mecánicos utilizan
reactivos que pueden ser químicos o enzimáticos,
cuyo objetivo es romper o lisar la célula.
a Actualmente los métodos mecánicos son aplicados
industrialmente, mientras que los no mecánicos se utilizan
principalmente pequeña escala (laboratorio).
Uno de los métodos no mecánicos más
utilizado a nivel de laboratorio es a través del uso de
reactivos químicos como disolventes.
Métodos No-Mecánicos Pueden ser de dos tipos:
•Agente químicos •Solventes orgánicos
• Detergentes • Alcalis • Agua (shock
osmótico) •Enzimáticos se trata de enzimas que
permeabilizan en forma selectiva las membranas celulares, tales
como lisozima, glucanasas, mananasas, etc. Los métodos
no-mecánicos son fáciles de escalar, si uno
necesita tratar 10 veces más materia orgánica basta
con adicionar 10 veces más reactivo químico o
enzimático.
Métodos No-mecánicos Técnicas
Permeabili -zación Enzimático Principios
Permeabilización de
la pared celular, lo
cual produce el rompimiento de la
Stress Suave Costos Caro Ejemplos Tratamiento de
M. lysodeikticus célula con lisozima.
Shock Osmótico Solubiliza- ción
Disolución de Lípidos Ruptura
Osmótica de la membrana
Disolución de la
membrana celular con detergentes
Solventes orgánicos
que disuelve la pared
celular y también la Suave Suave
Modera -do Barato Moderada- mente Caro Barato
Ruptura de Células de
Glóbulos Rojos. Rompimiento
de bacterias con SDS. Rompimiento
de levaduras desestabilizan con tolueno.
Tratamien -to con álcalis
Solubilización de la
membrana por
saponificación de los lípidos
Fuerte Barato
de Métodos Mecánicos El rompimiento se lleva a cabo
por acción mecánica, pudiendo ser: •
Fricción • Efecto de la presión •
Colisiones. Estos métodos incluyen las operaciones
unitarias ultrasonido, homogenización , molinos de bolas,
etc. Estos métodos resultan ser agresivos con las
proteínas de interés, debido principalmente a la
generación de calor. Adicionalmente, el escalamiento
resultan ser un problema significativo.
animales. Métodos Mecánicos Técnicas
Homogeni- zador de cuchillos Homogeni
-zador alta presión Ultrasonifi
-cación Molienda Principios
Las células son
rotas en un mezclador Las células
son forzadas a pasar a través de un pequeño
orificio lo que produce que se rompan por el esfuerzo de corte
Las células son quebradas en una cavidad
ultrasónica Las células son Stress Moderado Fuerte
Fuerte Moderado Costos Moderado Moderado Caro Barato Ejemplos
Rompimiento de tejidos y
células Tratamiento a
gran escala de suspensión de
células. Rompimiento de
suspensiones de células a lo
menos en pequeña escala rotas por medio de
una molienda con abrasivos Molinos de bolas Las
células son trituradas con bodas de acero Fuerte Barato
Rompimiento a gran escala para
suspensiones de
células y células o vidrio
de plantas
MÉTODOS DE PERMEABILIZACIÓN
Alteran la estructura de la pared y la
membrana celular para facilitar la difusión
de productos hacia el exterior.
MÉTODOS DE PERMEABILIZACIÓN
Ósmosis Tolueno al 5%
Detergentes aniónicos
Detergentes no aniónicos (SDS y Tritón)
Agentes caotrópicos (guanidina y urea)
EDTA
Tratamiento enzimático Teoría Existen enzimas que
pueden hidrolizar la membrana celular de microorganismos. Cuando
la membrana ha sido suficientemente permeabilizada, algunos
compuestos intracelulares pueden ser liberados al medio. Una
comparación entre un proceso de rompimiento y otro de
permeabilización.
Metodología El modo de acción es muy simple basta
con agregárselo a una suspensión y se produce una
reacción muy rápida la cual deteriora la pared
celular. La reacción es selectiva y ataca a determinadas
estructuras de la pared celular como son las glucanasa,
mananasas. Ventajas: Método suave y selectivo escalable
Desventajas: escala. Costo de la enzima lo hace difícil de
utilizar a gran Microorganismo Bacterias Levaduras
Células de plantas Enzima Lisozima
Complejo glucanasa- mananasa Celulosas y
peptinasas Efecto
Ruptura de los enlaces ß-1,4
entre N-acetil murámico y N-
acetil glucosamida
Rompe la capa de glucano y
de manano
Rompen capa de celulosa y peptino
y Shock Osmótico Teoría Resulta ser uno de los
métodos más simple: 1. Las células se
colocan en una volumen de agua 2 veces mayor que el volumen de
células. 2. Bajo estas condiciones las células se
hinchan, debido a un simple flujo osmótico que se produce
debido a que las células contienen solutos (los causantes
del flujo osmótico de agua al interior de la
célula). 3. Las células se hinchan y algunas llegan
a reventarse. La susceptibilidad de las fuertemente de su tipo.
células es relativa depende
Los glóbulos rojos son fáciles de lisar. Las
células vegetales son muchos más difíciles,
dado que sus paredes contienen compuestos que son impermeables al
flujo osmótico. Se puede calcular la presión
necesaria para romper células a partir de la ley
van´t Hoof. La cual se deduce desde la condición de
equilibrio : DP = – R*T*c1 Donde c1 : Concentración de
solutos en el interior de la célula. En el caso de una
célula que contiene una concentración de solutos
del orden de 0.2 M, calculando la diferencia de presión
alcanzara valores del orden de -5 atm (dentro mayor
presión que afuera).
Solubilización Teoría Es uno de los método
no-mecánico rompimiento de células. más
utilizado para el Los detergentes tienen una zona
hidrofílica y otra hidrofóbica, por esta
razón pueden interactuar tanto con el agua como con los
lípidos. Su habilidad se basa en la solubilización
de los lípidos de la pared celular. Los detergentes
más utilizados son de tres tipos: •Detergente
aniónico •Detergente catiónico
•Detergente no-iónico y polidispersante
Ejemplos Detergentes aniónicos •Dodecil Sulfato de
Sodio (SDS) CH3(CH2)11 SO3- Na+ •Sulfonato de Sodio
CH3(CH2)9 -Phenyl-SO3- Na+ •Tauroclorato de Sodio El SDS es
uno de los detergentes aniónicos más ampliamente
estudiados. Entre los materiales aniónicos se encuentran
los jabones (sales de ácidos grasos), estos jabones
dependen del grupo de ácido carboxílico que tengan
y resultan efectivos a altos pH donde el grupo se encuentra
ionizado. A su vez resultan ineficientes en aguas duras que
contengan iones calcio que pueden reaccionar con ellos y formar
compuestos insolubles. Las desventajas de los detergentes
tradicionales se puede superar si se reemplazan los grupos
carboxilos por grupos sulfatos. Los sulfatos que contienen grupos
fenilos son más efectivos que los compuestos que contienen
grupos alquilos, debido principalmente que no son fáciles
de degradar microbianamente, como son los detergente utilizados
para lavado.
Ejemplos Detergentes cationicos •Bromuro de Catiltrimetil
Amonio (CTAB) Br- CH3(CH2)15 N+ (CH3)3 Son detergentes más
suaves (tipo shampoo), por lo cual se produce un rompimiento
más suave de las células. Ejemplos •Triton
X-100 Detergente no-iónicos C8H17-Phenyl-(OCH2CH2)9.5OH
Son generalmente polímeros solubles en agua, se utilizan
en los detergente para lavar vajilla. Estos detergente
también tienen una parte hidrofóbica y una
hidrofílica, pero la parte hidrofílica no es ni un
sulfato ni un tetraalquilamonio sino un alcohol. .
A bajas concentraciones de detergente no se produce
degradación de los lípidos, pero a alta
concentración se produce una degradación que
resulta lineal a la concentración de detergente, junto a
esta variable también se altera la tensión
superficial de la solución. La relación que se
produce entre la solubilización y otros fenómenos
es que el detergente forma micelas, en cuyo interior se
encapsulan los lípidos digeridos (Cabezas
hidrofílicas y colas hidrofóbicas que están
en contacto con la sopa de lípidos).
Procedimiento 1. Se coloca un determinado volumen de detergente
concentrado por un volumen de células. Generalmente la
mitad de volumen de detergente que de volumen de células.
2. El detergente rompe la membrana celular. 3. La
suspensión resultante se centrifuga para remover los
fragmentos de células y luego se pasa a través de
una columna de adsorción o por etapas de extracción
para aislar el producto.
Tratamiento con solvente (disolución de lípidos) Es
una técnica la cual no ha sido muy documentada,
sólo se requiere de información experimental. Una
buena forma de seleccionar el solvente es analizar la volatilidad
(desde manuales), este parámetro puede relacionarse con
las interacciones lípido solvente, poniendo
atención en el calor de mezcla. Solventes con similar
solubilidad atacarán los lípidos de forma similar.
Procedimiento 1. El método consiste en adicionar la
suspensión de biomasa un volumen de tolueno del orden de
un 10% de biomasa. 2. El tolueno es absorbido por las
células, las cuales se hinchan y luego explotan. 3. El
contenido de las células se libera al medio y luego puede
ser separado.
• • • • • Existen otros solventes que
puede ser utilizados como : Benceno ( que es cancerigeno y de una
alta volatilidad, el tolueno también es cancerigeno pero
de más baja volatilidad). Cumeno Clorobenceno Xileno
Octanol (Altos alcoholes)
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