Brucella abortus: inmunidad, vacunas y estrategias de prevención basadas en ácidos nucleicos (página 2)

1. DISTRIBUCIÓN
GEOGRÁFICA.

La brucelosis tiene una distribución geográfica limitada,
siendo un problema importante en el Mediterráneo, el oeste
de Asia y algunas
zonas de Africa y Latinoamérica, especialmente en
países con bajos recursos
económicos (Corbel 1997, Moreno y Moriyón 2002). En
el centro y norte de Europa y en
Australia la infección por B. abortus ha sido
prácticamente erradicada. En Norteamérica, la
brucelosis es especialmente prevalente en las zonas
agrícolas del norte y centro de México
(Gándara y col 2001), mientras que en Canadá y
Estados Unidos
ha disminuido considerablemente en los últimos
años. B. abortus está presente en todos
los países de América
Central, siendo la prevalencia de un 4 a un 8% (Moreno 2002). En
Sudamérica se encuentra en varios países, donde en
muchos casos es endémica y un problema sanitario
importante (Corbel 1997, Lucero y col 1999, Rodríguez y
col 2001). En Chile, la Décima Región de Los Lagos
es la que comprende la mayor área productora de leche y,
además, tiene la mayor concentración de ganado
infectado (Ramírez y
Sigal 2002, Rivera y col 2002).

2. PATOGENIA.

La mayoría de los animales se
infectan directamente a través de la mucosa oronasal, por
ingestión de alimentos
contaminados o por inhalación de polvo de los establos con
microorganismos que los animales han secretado con la leche o los
exudados vaginales después del aborto
(Rodríguez y col 2001). B. abortus, además
de infectar al ganado bovino, puede infectar a otras especies
como búfalos, bisontes, alces, jabalíes, zorros,
renos, camellos y animales marinos (Mandell 1995, Cloeckaert y
col 2000). Inmediatamente después de la penetración
e independientemente de la vía de entrada, las bacterias son
transportadas, libres o en el interior de células
fagocíticas, hasta los ganglios linfáticos
más próximos al lugar de entrada. Si las bacterias
no son destruidas, pueden sobrevivir largos períodos de
tiempo en el
interior de las células fagocíticas (Ilarmon y col
1988). Los ganglios linfáticos responden a la
agresión por medio de una hiperplasia reticuloendotelial y
linfática, que puede tardar varias semanas en producirse y
persistir durante meses (Rodríguez y col 2001). En los
fagosomas de los macrófagos, Brucella sobrevive y
se multiplica, inhibiendo la fusión del
fagosoma que contiene la bacteria y el lisosoma, mediante la
acidificación rápida del medio (Pizarro-Cerda y col
1998, Celli y col 2003, Ko y Splitter 2003). En células
fagocíticas no profesionales, la internalización de
B. abortus se asocia al dominio
extracelular de la proteína tirosina quinasa y la
activación de una serie de pequeñas GTPasas
(Guzmán- Berri y col 2001), tendiendo a localizarse dentro
del retículo endoplásmico rugoso (Corbel 1997). En
infecciones experimentales, en ratones, se ha observado que la
infección tiene dos fases: durante las primeras dos
semanas la bacteria se multiplica rápidamente; en la
segunda fase, el número de bacterias se estabiliza hacia
la quinta o sexta semana y luego decrece lentamente hasta
desaparecer (Hong y col 2000). La especial afinidad que estas
bacterias tienen por el endometrio grávido y por la
placenta fetal de bovinos hace que estas bacterias también
proliferen extensamente en trofoblastos de la placenta que rodean
al feto (Meador y
Deyoe 1989), lo que condiciona que la principal
manifestación clínica de la infección aguda
en los animales sea el aborto durante
el último tercio de la gestación, o el nacimiento
de animales prematuros poco viables (Ficht 2003). En bovinos
machos provoca alteraciones testiculares y una disminución
de la fertilidad, acompañadas algunas veces por abscesos
en testículos
y epidídimo (Hausler y Koontz 1974).

En humanos la infección se produce a
través del contacto con secreciones de animales infectados
o consumo de
leche cruda o queso contaminado. El consumo de carne no es una
fuente de contaminación (Mandell 1995).
Brucella puede ingresar al organismo a través de
lesiones de la piel, mientras
se manipulan animales infectados o sus desechos (Mandell 1995,
Sauret y Vilissova 2002). En países en que la
infección por Brucella es endémica en la
población animal, la infección por
Brucella en humanos es frecuente (Roop II y col 1994,
Yagupsky 1999), sin embargo, la transmisión persona a persona
es extremadamente inusual (Fiori y col 2000). La enfermedad puede
ser adquirida por exposición
ocupacional de los trabajadores de mataderos, carniceros y
veterinarios, al inhalar aerosoles contaminados o en viajes a
lugares donde la infección es endémica (Yagupsky
1999). Las infecciones asociadas al trabajo de
laboratorio
representan el 2% de los casos y se ha informado que el
período de incubación de la brucelosis adquirida
por accidente en el laboratorio puede variar entre seis semanas a
cinco meses (Fiori y col 2000).

3. GENETICA DE
BRUCELLA.

El ADN de
Brucella contiene un 58-59% de G + C (guanina y
citosina) y el tamaño total del genoma se ha estimado en
aproximadamente 2,5 x 106 pares de bases
(Allardent-Servent y col 1988); este tamaño es menor al de
Escherichia coli (4,7 x 106 pares de bases).
Dos características genéticas de Brucella
llaman especialmente la atención, en primer lugar, la existencia de
dos cromosomas
circulares en la mayoría de las especies y biotipos, y en
segundo lugar, la ausencia de plásmidos. Esta
última característica refleja probablemente la
adaptación a un nicho ecológico (el ambiente
intracelular) estable y sin competencia
microbiana, en el que no es necesaria la plasticidad genética
que se deriva de los plásmidos y que es propia de
ambientes con gran cantidad de microbios (intestino, tierra, etc.).
El género
Brucella tiene seis especies reconocidas, las que
exhiben distintas preferencias por su huésped (Mayer 1964)
y muestran más de 94% de homología en su genoma
(Halling y col 2005), lo que apoya la proposición de que
las especies clásicas de Brucella son cepas de
Brucella melitensis (Verger y col 1995). Sin embargo, se
ha encontrado polimorfismo en determinadas secuencias
genómicas que coinciden con las especies clásicas e
incluso con las biovariedades. Se estima, además, que el
8% del genoma de Brucella se destina a funciones
necesarias para la sobrevivencia y la virulencia, en
comparación al estimado para Salmonella que es sólo
el 3-4% (Hong y col 2000).

4. INMUNIDAD FRENTE A
BRUCELLA

4.1. Inmunidad natural. En estados tempranos de
la infección por Brucella, el rol de la respuesta
innata es reducir el número inicial de bacterias
promoviendo una respuesta Th1 en el huésped (Ko y Splitter
2003). Los macrófagos, los neutrófilos, las
células Natural Killer (NK) y el complemento juegan un rol
clave en esta fase temprana de la respuesta a la invasión
frente a este microorganismo
(Golding y col 2001).

4.1.1. Macrófagos. Los macrófagos
juegan un rol central en la respuesta inmune frente a
Brucella, ya que actúan como células
fagocíticas profesionales y como células
presentadoras de antígenos. Procesan antígenos en sus
compartimentos intracelulares y los presentan en el contexto del
Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) a linfocitos T,
promoviendo de esta manera la respuesta inmune adaptativa
(Forestier y col 2000). En este sentido, se ha encontrado que el
LPS de Brucella interfiere con la vía de
presentación de antígenos por MHC clase II
(Murphy y col 2002). Las funciones bactericidas de los
macrófagos frente a Brucella se encuentran
centradas en la actividad de las especies reactivas de oxígeno
(Oliveira y col 2002) y las especies reactivas de
nitrógeno, las cuales son inducidas por
IFN-γ y
el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α )
(Ko y Splitter 2003).

Los receptores Toll-like (TLR) juegan un rol importante
en el inicio de la respuesta inmune innata. Estos receptores
presentes en células fagocíticas profesionales
reconocen productos
microbianos uniéndose directamente a ellos e inducen
señales
intracelulares que activan factores de transcripción (como
NF-kB) que modulan la producción de citoquinas. Estos receptores
pueden ser activados por diversos productos microbianos; el
receptor Toll-like 4 (TLR4) es activado por LPS, el TLR9 por ADN
bacteriano, el TLR2 por productos de la pared celular de
bacterias Gram positivas y TLR5 por flagelina (Vasselon y Detmers
2002).

4.1.2. Neutrófilos. Los
neutrófilos están implicados en el desarrollo de
una defensa temprana frente a una infección por
Brucella mediante la fagocitosis y posterior
destrucción del microorganismo. En primer lugar, los
neutrófilos son atraídos al sitio de la
infección por estímulos químicos originados
o derivados del microorganismo (Wilkinson 1980, Birmingham y col
1982), para posteriormente fagocitar la bacteria, preferentemente
opsonizada (Young y col 1985). Una vez que el patógeno es
fagocitado, se desarrolla una serie de mecanismosdestructivos en
el neutrófilo, con el fin de eliminar la bacteria,
mediante el aumento del consumo de oxígeno que lleva a la
aparición de radical superóxido, peróxido de
hidrógeno y otros radicales derivados del
oxígeno, junto con la activación de la enzima
mieloperoxidasa y la fusión del lisosoma con los fagosomas
que contienen la bacteria, liberándose hidrolasa
ácida, glicosidasa, proteasa y lipasa. Sin embargo, la
bacteria ingerida puede sobrevivir al mecanismo destructivo de
los fagocitos (Smith y Fritzgeorge 1964), gracias a
moléculas de bajo peso molecular que inhiben el sistema
antibacteriano mieloperoxidasa-peróxido de
hidrógeno-haluro (Canning y col 1985). Por ello, aunque
los neutrófilos son las primeras células
relacionadas con la eliminación de patógenos
extraños, ellos son considerados de baja eficiencia contra
Brucella, ya que esta bacteria puede crecer y sobrevivir
en su interior y además es diseminada a través de
estos leucocitos a órganos y diferentes localizaciones,
desarrollándose una infección
persistente.

4.1.3. Células Natural Killer. Las
células NK forman parte de la primera línea de
defensa contra Brucella y una vez que son activadas
pueden eliminar células infectadas. B. abortus
puede activar la actividad lítica de las células
NK, estimulando la producción de interleuquina- 12 (IL-12)
por parte de las células presentadoras de
antígenos. IL-12 además estimula a las
células NK a secretar IFN-γ (Fernández y col 1995;
Golding y col 2001).

4.1.4. Complemento. Uno de los primeros
eventos que
ocurren después de la entrada de la Brucella al
organismo es la activación del complemento por la
vía alterna; sin embargo, se ha demostrado que esta
vía es incapaz de eliminar la cepa virulenta de
Brucella abortus 2308 (Eisenschenk y col 1999).
Por lo tanto, la lisis de Brucella estaría
mediada principalmente por la vía clásica del
complemento, la cual es dependiente de anticuerpos
(Fernández y col 2001).

4.2. Inmunidad adaptativa. Está
ampliamente aceptado que la inmunidad mediada por células
es el mecanismo efector más relevante en la
protección frente a Brucella debido a que es un
parásito intracelular (Oliveira y col 1996). Las
citoquinas son moléculas clave para una adecuada respuesta
inmune mediada por células (Oliveira y col., 1996). La
exposición prolongada de un animal a Brucella
cambiaría la naturaleza de
la respuesta inmune, desde una inmunidad mediada por
células hacia una respuesta humoral (caracterizada por la
producción de IgM e IgG1), respuesta que se relaciona con
una disminución en la actividad de las células T
ayudadoras tipo 1, con una baja en la producción de
INF-γ,
favoreciéndose de esta forma un incremento de la actividad
de las células T ayudadoras de tipo 2, disminuyendo la
respuesta inmune celular, lo que favorecería de esta forma
el establecimiento de la enfermedad crónica (Oñate
y col 2000). Las funciones de la respuesta inmune adaptativa en
la brucelosis se basan principalmente en tres mecanismos.
Primero, la producción de IFN-γ por células T
CD4+, CD8+, y células T
γδ, que
activa la función
bactericida en macrófagos. Segundo, la citotoxicidad de
células T CD8+ y células T
γδ que
eliminan macrófagos infectados. Y tercero, isotipos de
anticuerpos Th1, tales como IgG2a que opsonizan al
patógeno para facilitar su fagocitosis (Ko y Splitter
2003).

En general, se considera que los anticuerpos
bloqueadores no son efectivos en la respuesta inmune contra
Brucella (Corbeil y col 1988). Sin embargo, los animales
infectados con Brucella producen anticuerpos contra
varios componentes bacterianos (Tabatabai y Hennager 1994) que
interfieren en la eliminación del patógeno,
especialmente aquellos anticuerpos específicos para el
antígeno O y algunas porinas. En este sentido, los
anticuerpos serían importantes en bloquear la
liberación de cantidades demasiado elevadas de
Brucella al medio extracelular.

4.2.1. Linfocitos T CD4+ y
CD8+. Después de la activación de los
macrófagos, las células T inmaduras (Th0) se
diferencian de células efectoras y de memoria, que
están programadas para secretar distintos patrones de
citoquinas (Golding y col 2001). Las células Th1 secretan
interleuquina-2 (IL-2) e INF-γ, mientras que los linfocitos Th2
producen interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5) e
interleuquina-10 (IL-10) (Zhan y col 1995). La generación
de células Th1 de memoria sólo puede realizarse si
la respuesta inicial al estímulo se asocia a la
producción de IL-12 e IFN-γ (Scharf y col 2001).

El rol principal de la secreción de IFN-
γ por las
células Th1 en la inmunidad contra Brucella es
activar la función bactericida de los macrófagos y
linfocitos T CD8+ citotóxicos, así como
la estimulación de la secreción de IgG2a (Scharf y
col 2001; Ko y Splitter 2003). En términos
numéricos, la población celular predominante es la
de linfocitos T CD4+ productores de
IFN-γ (Ko
y Splitter 2003), responsables de la activación de
macrófagos y la atracción de células
inflamatorias efectoras, de ahí su importancia en promover
la respuesta celular adquirida contra Brucella (Bae y
col 2002, Wyckoff 2002). Además, el IFN-γ inhibe la acción
de IL-4 sobre las células T (Scharf y col
2001).

Las células citotóxicas T CD8+
pueden actuar como células efectoras y eliminar
macrófagos infectados con Brucella directamente
(Oliveira y col 2002; Wyckoff 2002). Las células blanco
son reconocidas por las células citotóxicas en el
contexto de las moléculas de histocompatibilidad de clase
I (MHC I) y son eliminadas por la acción de perforinas y
granzimas (Golding y col 2001).

4.2.2. Linfocitos T γδ. Las células T
γδ
representan una pequeña población de
linfocitos, con un patrón único de reconocimiento
de antígenos (Dieli y col 2003). En humanos, las
células T γδ controlan el aumento en el
número de microorganismos ya que secretan TNF-α e
IFN-γ,
después de ser activadas por antígenos no
peptídicos, en su mayoría fosfoantígenos,
los cuales no son presentados en el contexto del MHC
(Giambartolomei y col 2002, Baldwin y col 2002, Ko y Splitter
2003). Mediante la secreción de estas citoquinas, activan
la función bactericida de los macrófagos y,
además, son capaces de lisar células infectadas por
citotoxicidad directa in vitro. El rol de estas
células in vivo aún no ha sido determinado
(Ko y Splitter 2003), aunque se cree que son parte de la
inmunidad innata (Wyckoff 2002). En bovinos menores de un
año, la población celular predominante es la de
células T γδ y no la de
células T αί, lo que
sugiere que el rol de este tipo celular es más
significativo en la infección del ganado con brucelosis
(Ko y Splitter 2003). De todas maneras, en bovinos, la
producción de IFN-γ por estas células es menor que la
producida por las células CD4+ (Baldwin y col
2002).

4.2.3. Linfocitos B. Las células B son
estimuladas directamente por las células T a través
de la interacción de moléculas
coestimulatorias como CD40 y su ligando CD40L presente en
la
célula T, lo cual, junto a las citoquinas liberadas,
son importantes en promover el cambio de
isotipo de IgM a IgG (Golding y col 2001). Con respecto al rol
que cumplirían los anticuerpos durante la infección
por Brucella, se ha visto que tanto IgM como IgG, en
bajas concentraciones, son capaces de promover la lisis de
Brucella a través de la vía clásica
del complemento (Corbeil y col 1988). También se han
encontrado títulos elevados de IgG anti-SOD Cu/Zn en
animales infectados, pero aún no se determina si estos
anticuerpos juegan un rol importante en la inmunidad contra
Brucella (Tabatabai y Hennager 1994). La
opsonización acoplada al aumento de muerte de
Brucella intracelular podría ser considerada como
el principal rol de los anticuerpos contra la infección
con Brucella (Ko y Splitter 2003). Aunque
paradójicamente en brucelosis bovina la alta
concentración de IgG durante la infección activa
previene la lisis extracelular de la bacteria mediada por
complemento y promueve la fagocitosis bacteriana, aumentando la
localización intracelular de la bacteria y la
extensión de la enfermedad (Ko y Splitter
2003).

4.2.4. Citoquinas. Las citoquinas son
moléculas clave en el control de la
brucelosis, ya que permiten dirigir las respuestas hacia una
respuesta inmune celular o humoral. B. abortus estimularía
a las células presentadoras de antígenos para que
secreten IL-12, la que induce a los linfocitos Th0 a
diferenciarse en linfocitos Th1, secretores de
IFN-γ
(Splitter y col 1996, Oliveira y col 2002, Ko y Splitter
2003). Sin embargo, otros autores señalan que
Brucella no es un inductor potente de la
secreción de IL- 12 (Pasquali y col 2001).
IFN-γ
participa en la regulación de los mecanismos
defensivos de los macrófagos y es considerado un factor
crucial para el desarrollo de la protección contra la
infección por Brucella (Oliveira y col
1996).

Interleuquina-18 (IL-18) citoquina sintetizada por
macrófagos activados, también estimula la
producción de IFN-γ, por lo que actúa
sinérgicamente con IL-12 sobre las células T en la
estimulación de la respuesta mediada por células
contra Brucella (Pasquali y col 2002).

TNF-α
contribuye a la resistencia
frente a Brucella por una vía independiente de
IFN-γ,
estimula el influjo de fagocitos al sitio de infección y
participa en la activación de los macrófagos (Zhan
y col 1996).

IL-10, producida por linfocitos CD4+ Th2,
macrófagos activados y algunas poblaciones de
células B, inhibe la respuesta Th1, ya que disminuye la
capacidad de presentar antígenos de los macrófagos
e inhibe la secreción de IFN-γ, por lo tanto, aumenta la
susceptibilidad a la infección por Brucella
(Fernández y Baldwin 1995, Giambartolomei y col
2002).

5. ANTIGENOS DE
BRUCELLA.

Desde un punto de vista antigénico en
Brucella existen dos componentes fundamentales: el
lipopolisacárido (LPS) y las proteínas
(Hinsdill y Berman 1967).

5.1. Lipopolisacárido. El LPS es
diferente entre cepas rugosas o lisas de Brucella
(Mandell 1995). Se ha descrito que el LPS de cepa lisa, que
contiene polisacárido O, probablemente juega un rol
importante en la sobrevivencia intracelular, en
comparación con una cepa rugosa que no tiene o tiene muy
poca cadena O (Corbell 1997). La falta de una definición
genética sobre cepas rugosas naturales, que son
patogénicas para su hospedadores, como Brucella
ovis y Brucella canis, confunde tal interpretación. Sin embargo, se ha descrito
en B. ovis y B. canis la presencia de LPS que
es idéntico al encontrado en cepas mutantes lps
de B. abortus, mutantes que no tienen cadena O, pero
tienen diferente capacidad de sobrevivencia dentro de los
macrófagos (Allen y col 1998).

La cadena O del LPS es la estructura
antigénica más expuesta de esta bacteria, un
homopolímero de aproximadamente 100 residuos de
4-formamido-4,6-didesoximanosa (Caroff y col 1984, Corbel 1997,
Cloeckaert y col 2002), componente inmunodominante en cepas lisas
de B. abortus, provocando que animales infectados
produzcan anticuerpos específicos contra este
antígeno. Los anticuerpos producidos en ratones son
principalmente de isotipos IgG2a e IgG3, con baja
producción de IgM (Vemulapalli y col 2000a). Estos
anticuerpos representan un componente importante dentro de la
inmunidad protectora contra Brucella, complementando la
respuesta inmune mediada por células (Montaraz y col
1986).

La avidez del LPS para unirse al receptor CD14 de los
fagocitos mononucleares se debe al lípido A; esta
interacción estimula en estas células la
producción del TNF-α, interleuquina-1 (IL-1), interleuquina-6
(IL-6) e interleuquina-8 (IL-8), los cuales son mediadores de la
mayoría de los síntomas de choque séptico
(Aréstegui y col 2001).

El LPS de Brucella se diferencia en estructura
química y
actividad biológica al LPS de bacterias
enteropatógenas comunes, ya que no está
estabilizado por cationes divalentes; contiene una menor carga
negativa y menor cantidad de ácido 2-ceto-3-deoxioctanoico
que el LPS de otras bacterias, disminuyendo así su
susceptibilidad a la acción de péptidos
catiónicos bactericidas (Folch y Oñate 1995). Las
moléculas de manosa que presenta el extremo terminal del
LPS de Brucella (cepa lisa) favorecen la adherencia a
los fagocitos mononucleares del huésped, ya que
éstos tienen los receptores de manosa (Pontow y col 1992).
Además de los fagocitos mononucleares, las células
de la placenta contienen gran cantidad de receptores de manosa,
lo que sumado al tropismo de estas bacterias por el eritritol
placentario de bovino, aumenta las probabilidades de abortos en
estos animales, debido a la presencia de la bacteria en ese
tejido (Aréstegui y col 2001).

5.2. Proteínas. En estudios sobre
componentes estructurales proteicos de relevancia en
Brucella se han descrito proteínas de membrana
externa, proteínas de ubicación
citoplasmática y proteínas de choque
térmico.

Las proteínas de membrana externa han sido
clasificadas en tres grupos: el
Grupo I se
relaciona con la biosíntesis de la propia envoltura celular
y tienen un peso molecular entre 88 a 94 kDa; el Grupo II es
equivalente a las porinas de otras bacterias Gram negativas, como
Omp 2, OmpC y OmpF y tienen un peso molecular entre 35 a 40 kDa,
finalmente, el Grupo III con peso molecular entre 25 a 30 kDa que
interacciona fuertemente con el LPS (Verstreate y col 1982,
Santos y col 1984, Douglas y col 1984, Verstreate y Winter 1984,
Ficht y col 1989). Estos tres grupos de proteínas de
membrana externa son reconocidos por el sistema inmune durante el
curso de la infección (Bae 1999).

Entre las proteínas citoplasmáticas de
importancia destacan la proteína superóxido
dismutasa Cu/Zn (SOD) y la catalasa. La SOD Cu/Zn forma parte del
sistema de defensa antioxidante de Brucella, el cual
protege a la bacteria de los efectos tóxicos de los
intermediarios reactivos del oxígeno, ya que transforma
los radicales superóxido (O2 -) en
peróxido de hidrógeno (H2O2)
y oxígeno gaseoso (O2), contribuyendo a la
sobrevivencia intracelular de Brucella (Ko y Splitter
2003). La proteína SOD Cu/Zn pertenece a la familia de
metaloproteínas, clasificada en tres tipos (SOD Cu/Zn, SOD
Mn y SOD Fe) dependiendo del metal que se encuentre en el sitio
activo. La enzima catalasa ayuda a la proteína SOD Cu/Zn a
detoxificar el ambiente bacteriano, actuando sobre el
peróxido de hidrógeno (H2O2)
generado al interior del macrófago después de la
fagocitosis de la bacteria, transformándolo en agua y
oxígeno (Aréstegui y col 2001). La expresión
de estas enzimas
favorecería la permanencia de Brucella en el
interior del fagocito.

El rol de las proteínas de choque térmico
en la patogénesis de Brucella es incierto. Se ha
observado que en bacterias intracelulares se expresan niveles
elevados de proteínas de choque térmico en el
ambiente intracelular (Roop II y col 1994, Ko y Splitter 2003,
Bae y col 2002). Entre estas se encuentran GroEL (60 kDA), GroES
(10 kDa) y HtrA (60 kDa). Las proteínas GroEL y GroES son
chaperonas relacionadas con el plegamiento correcto de
proteínas, mientras que HtrA (High temperature requirement
A stress response
protein) es una proteasa que degrada proteínas
dañadas oxidativamente (Bae y col 2002). HtrA protege a la
bacteria intracelular del daño
oxidativo y contribuye a la resistencia de Brucella a la
destrucción por los fagocitos (Elzer y col 1996). La
enzima UvrA repara las lesiones del ADN después del
daño oxidativo, como mecanismo de protección
bacteriano (Oliveira y col 1996).

6. VACUNAS CONTRA
BRUCELLA ABORTUS.

La prevención de la diseminación de la
brucelosis se basa en la
administración de vacunas adecuadas contra la
infección por B. abortus. Con este objetivo se
han utilizado clásicamente cepas bacterianas atenuadas y
componentes antigénicos propios de la Brucella.
La habilidad de un antígeno específico para inducir
en forma preferencial una respuesta Th1 es un aspecto importante
a considerar en el desarrollo de vacunas contra Brucella
abortus (Stevens y col 1994, Oliveira y col
1996).

6.1. BACTERIAS ATENUADAS

6.1.1. Brucella abortus S19. La cepa 19 de
Brucella abortus es una cepa lisa que posee la cadena O
del LPS, por ello, en animales inmunizados con esta cepa se
pueden observar anticuerpos específicos contra este
antígeno del tipo IgG1, IgG2b e IgM (Vemulapalli y col
2000a). El defecto genético que permite la
atenuación de esta cepa aún no ha sido definido,
pero hace que pierda un mecanismo de virulencia esencial (Briones
y col 2001). Su efectividad en el ganado bovino depende de
variables como
la edad de vacunación, dosis, ruta de administración y de la prevalencia de la
brucelosis en el rebaño vacunado (Schurig y col 2002). Los
anticuerpos inducidos por la vacunación con esta cepa
interfieren con el diagnóstico tradicional de bovinos
infectados con cepas silvestres de B. abortus, por lo
que tiene un uso limitado en la vacunación del ganado;
esta cepa puede también inducir aborto en hembras
preñadas y es patógena para la especie humana (WHO
1997, Oliveira y Splitter 1996, Olsen 2000).

6.1.2. Brucella abortus 45/20. La cepa 45/20 es
una cepa rugosa, fue desarrollada por 20 pasajes repetidos de
Brucella abortus 45 en cobayos (Corbeil y col 1988). A
pesar de que no induce anticuerpos contra la cadena O del LPS e
induce una protección significativa contra la
infección por Brucella abortus (WHO 1997), no es
muy utilizada porque es inestable y puede revertir a su forma
virulenta in vivo (Corbeil y col 1988). La cepa 45/20
también ha sido utilizada en forma inactiva, pero
adicionada junto a un adyuvante oleoso, la que ha demostrado una
relativa efectividad, pero provoca una reacción
inflamatoria local en el sitio de la inyección (McDonel
1990).

6.1.3. Brucella abortus RB51. Brucella
abortus RB51 es una cepa rugosa, resistente a rifampicina,
que ha sido derivada de la cepa virulenta Brucella
abortus 2308 (Schurig y col 1991, Schurig y col 2002). Esta
cepa es utilizada desde 1996 contra la brucelosis bovina en
Estados Unidos y en otros países, como Chile. Es
administrada en dosis que fluctúan entre 1×1010
y 4×1010 UFC por mililitro (Unidades Formadoras de
Colonias) en bovinos no menores de 4 meses de edad (Olsen 2000,
Vemulapalli y col 2000a). La protección que proporciona la
vacunación con esta cepa se debe a la activación de
linfocitos T (Stevens y Olsen 1996, Vemulapalli y col 2000ª,
Olsen 2000). La vacunación induce altos niveles de
IFN-γ, lo
cual es fundamental en las etapas primarias de la
infección (Pasquali y col 2001). La inoculación
intraperitoneal de B. abortus RB51 en ratones resulta en
una colonización del bazo que desaparece luego de cuatro
semanas postinmunización (Schurig y col 1991). La
vacunación del ganado permite la diferenciación
entre bovinos vacunados y aquellos infectados con cepas
silvestres debido a que no induce anticuerpos contra la cadena O
del lipopolisacárido (Pasquali y col 2001). Sin embargo,
se ha determinado que puede causar placentitis, endometritis e
infección fetal, en vaquillas adultas que han sido
vacunadas durante la preñez (Lopetegui 1998, Van Metre y
col 1999, Olsen, 2000).

Basándose en reportes sobre la efectividad de la
proteína SOD Cu/Zn de B. abortus expresada en
E. coli DH5α en proteger a ratones
vacunados del desafνo con la cepa patogιnica
de B. abortus 2308 (Oñate y col 1999), Schurig y
col desarrollaron una nueva cepa de B. abortus RB51, que
sobreexpresa la proteína SOD Cu/Zn de Brucella
(B. abortus RB51-SOD) (Vemulapalli y col 2002). La
inmunidad protectora proporcionada por la cepa B.
abortus RB51-SOD contra Brucella es superior a la
de B. abortus RB51, cepa parental, sin alterar las
características de atenuación de la vacuna
(Vemulapalli y col 2000c).

6.2. Vacunas subcelulares. Se han probado
distintos antígenos de Brucella en su capacidad
de inducir respuesta inmune mediada por células. Estos
antígenos forman parte de la estructura de la bacteria,
como la lipoproteína de 18 kDa presente en la superficie
de Brucella (Vemulapalli y col 2000b), la
proteína periplásmica P39, la proteína
bacterioferritina (Al-Mariri y col 2001b) y la proteína
ribosomal L7/L12, que produce una protección equivalente a
la alcanzada con la cepa 19 de B. abortus en ratones,
con activación de células T CD4+ que
secretan niveles significativos de IFN-γ (Oliveira y col 1994,
Oliveira y col 2002, Ko y Splitter 2003). Las proteínas
bacterioferritina y P39 no producen niveles significativos de
protección contra Brucella, aunque se utilicen
adyuvantes como CpG en su administración (Al-Mariri y col 2001a).
También se han probado proteínas de choque
térmico, como las proteínas UvrA, GroEL, GroES y
HtrA de B. abortus (Oliveira y col 1996), ya que se ha
encontrado que éstas son altamente inmunogénicas en
el curso de la infección con Brucella,
estimulando tanto la inmunidad celular como la inmunidad humoral
en el huésped infectado (Roop II y col 1994); sin embargo,
no son capaces de estimular una respuesta inmune protectora
eficiente frente a la infección con Brucella (Bae
y col 2002). A partir del extracto de proteínas totales de
B. abortus RB51 se purificaron dos proteínas: una
de 22,9 y otra de 32,2 kDa, de las cuales sólo la
proteína de 22,9 kDa demostró ser capaz de otorgar
cierto grado de protección (Céspedes y col 2000).
Los mejores resultados se han obtenido con la proteína de
18,5 kDa, SOD Cu/Zn de B. abortus, que es capaz de
inducir una respuesta celular de tipo Th1, con inducción de la producción de
IFN-γ e
IL-2, pero no de IL-4 (Oñate y Folch 1995) y además
la capacidad de inducir una respuesta inmune protectora
(Oñate y col 1999).

7. NUEVAS TENDENCIAS EN LA GENERACION
DE VACUNAS PARA BRUCELLA.

En los últimos años han surgido dos nuevas
estrategias de
inmunización altamente efectivas, basadas en la
vacunación con moléculas de ácidos
nucleicos, generándose la aparición de las vacunas
de tercera generación, que son las vacunas ADN y las ARN,
aplicándose este tipo de estrategia para
la infección por Brucella.

7.1. Vacunas ADN. La inmunización con vectores de
expresión plasmidial se basa en la expresión in
vivo de algún antígeno seleccionado, que
induciría una respuesta inmune protectora, y tienen
algunas de las ventajas que presenta el uso de los
patógenos vivos o atenuados, pero sin el riesgo de la
infección (Tang y col 1992). En principio, el método de
vacunación con ácidos nucleicos se basa en el uso
de un plásmido bacteriano que tiene un promotor viral
fuerte capaz de expresarse en células eucariontes, un gen
que codifica para un antígeno seleccionado y una secuencia
de término de la transcripción o
poliadenilación. El plásmido se replica en una
bacteria (E. coli), se purifica y luego se inyecta por
una vía determinada en el huésped. Las
células del huésped son capaces de sintetizar,
procesar y presentar el antígeno a los linfocitos,
originando eventualmente una respuesta de células T y B
específicas para el antígeno seleccionado. El
plásmido es fabricado sin su origen de replicación
funcional en células eucariontes, por lo tanto nunca se
replica en una célula
huésped de mamífero, ni se integra al ADN
cromosomal del hospedador (Donnelly y col 1997).

7.1.1. Mecanismos celulares de captura de ADN.
Un paso crucial en el desarrollo de la terapia génica por
medio de la inyección de ADN desnudo, es la
translocación del ADN a través de la membrana
plasmática, esto es importante para determinar el
mecanismo real de captura de ADN desnudo por células en
tejido animal (Satkauskas y col 2001). Estudios en el sitio de
inyección con heparina, una molécula
policatiónica que inhibe la captación de ADN,
indican que la inhibición es dosis dependiente y
compatible con la unión al receptor o al sitio de
unión específico, asumiendo que el mecanismo de
captación de ADN plasmidial es la endocitosis mediada por
receptores (Satkauskas y col., 2001). Sin embargo, los
últimos estudios en keratinocitos humanos muestran que el
mecanismo de captación de ADN es a través de
diferentes vías, principalmente por macropinocitosis, y se
han identificado las proteínas CD44 e ICAM-1 involucradas
en la unión y el tráfico de ADN (Basner-Tschakarjan
y col 2004).

7.1.2. Mecanismos celulares involucrados en la
respuesta inmune generada por la inmunización
genética. Algunas de las cualidades de las vacunas
ADN son: expresar antígenos de proteínas nativas
in vivo para reconocimiento de células B y
presentación por moléculas MHC clase I y II para
estimular células T ayudadoras, linfocitos T
citotóxicos. Así, el modo preciso de
estimulación inmune de las vacunas ADN se reduce a una
combinación de tres mecanismos por los que las
proteínas codificadas por el ADN plasmidial son
presentadas y procesadas para generar respuesta inmune: a)
estimulación directa por células somáticas
(miocitos, keratinocitos, o cualquier célula MHC clase II
negativa), b) transfección directa de células
presentadoras de antígeno (CPA) profesionales (Ej.
células dendríticas) y c) presentación
cruzada (crosspriming) en la cual el plásmido ADN
transfecta una célula somática y/o CPA profesional
y la proteína secretada es tomada por otra célula
CPA profesional y presentada a células T (Donnelly y col
2000, Gurunathan y col 2000).

7.1.3. Vacunas ADN para B. abortus. Se ha
demostrado que vacunas ADN que contienen el gen para la
proteína L7/L12 (Kurar y Splitter 1997) y lumazina
sintetasa (Velikovsky y col 2002) inducen un significativo nivel
de protección contra brucelosis en el modelo
ratón. Por otro lado, ratones BALB/c vacunados con un
plásmido ADN que tiene el gen (sodC) que codifica
para la proteína SOD Cu/Zn de Brucella
abortus (pcDNA-SOD), desarrollan anticuerpos
específicos contra la proteína SOD recombinante
(SODr), exhibiendo una dominancia de inmunoglobulinas de tipo
IgG2a sobre IgG1, lo que induce una respuesta proliferativa por
parte de células T, con la producción
INF-γ
pero no de IL-10 o IL-4, demostrando de esta forma que la
inoculación con pcDNASOD induce los anticuerpos adecuados
y una respuesta inmune celular de tipo Th1, respuesta que es
protectora frente al desafío con la cepa patógena
de Brucella (Oñate y col 2003). Además, se
ha demostrado en el modelo murino que la inmunización
intraesplénica con pcDNASOD induce una eficiente respuesta
inmune tipo Th1 protectora y que la producción de
IFN-γ es
realizada por células T CD4+ y la
inducción de actividad citotóxica, importante para
la eliminación de bacterias facultativamente
intracelulares como Brucella, es realizada por las
células T CD8+ (Muñoz y col 2004).

En bovinos, actualmente el único trabajo que ha
estudiado la utilización de una vacuna ADN para
Brucella describe que la inmunización con
pcDNA-SOD es capaz de estimular una respuesta inmune celular y
una eficiente estimulación de células T
citotóxicas, respuestas clave en la inducción de
protección frente a Brucella. Lo que
además destaca el trabajo, es
la gran variabilidad de respuesta observada en el ganado bovino,
lo que podría atribuirse a la constitución genética de la especie
bovina con la cual se trabajó, especies que no son 100%
genéticamente puras (Guzmán y col 2004).

7.2. Vacunas ARN. Además de los vectores
plasmidiales existen otros vectores de expresión como los
basados en el virus Semliki
Forest (SFV). Estos vectores son partículas virales
suicidas del virus Semliki Forest, cuyo genoma corresponde a un
ARN desnudo autorreplicable, cuya secuencia contiene inserto el
gen de interés
que codifica para la proteína con capacidad inmune.
Experimentos
previos han demostrado la alta eficiencia de estos sistemas de
expresión para expresar proteínas
heterólogas en células eucariotas, así como
también la capacidad para conferir excelentes niveles de
protección en animales inmunizados con estos sistemas de
expresión, superando incluso a las vacunas ADN (Andersson
y col 2001, Fleeton y col 1999).

7.2.1. Virus Semliki Forest. El virus Semliki
Forest es un Alfavirus que pertenece a la familia
Togaviridae. Este virus se transmite principalmente a
través de mosquitos y es capaz de infectar al ser humano
causándole fiebre, artritis
y encefalitis (Willems y col 1979.). El virus Semliki Forest es
un virus ARN que puede infectar una gran variedad de hospedadores
y se replica de manera efectiva en células en cultivo.
Este virus se ha utilizado en el estudio de la biología molecular de
los virus ARN y además se ha investigado su uso como
instrumento en la expresión de proteínas
recombinantes (Olkkonen y col 1993, Lundström y col
1994).

7.2.2. Entrada del virus a la célula
hospedadora. El virus Semliki Forest entra a la
célula hospedadora por endocitosis mediada por receptores
(probablemente antígenos de histocompatibilidad), que
fijan la partícula viral a la membrana plasmática
(Helenius y col 1978); estos receptores se concentran
principalmente en invaginaciones de la membrana
plasmática, recubiertas en su cara citosólica por
una red de la
proteína clatrina (DeTulleo y Kirchhausen 1998). En el
citoplasma, la vesícula endocítica se fusiona con
un endosoma, dentro del cual el pH es
ácido, lo cual induce la disociación de la
proteína estructural del virus E1E2, lo cual genera la
formación del homotrímero E1E1E1, el que facilita
la fusión de la membrana viral con el endosoma,
liberándose la nucleocápside al citoplasma de la
célula. Finalmente, las proteínas de la
cápside liberan el genoma viral, mediante una
reacción gatillada por ribosomas que se unen a algunos
aminoácidos de esta proteína (residuos 94 al 106),
los cuales están directamente implicados en la
unión de la cápside con la molécula de ARN
(Singh y Helenius 1992).

7.2.3. Elaboración de partículas
virales suicidas del virus Semliki Forest. A partir del
virus Semliki Forest, Smerdou y Liljeström el año
1999 elaboraron una partícula viral recombinante que tiene
la capacidad de infectar una célula eucariota animal y
liberar su genoma en su interior. Esta partícula viral
contiene en su interior un segmento de ARN mensajero, el cual
puede ser traducido por la célula hospedera (Smerdou y
Liljeström 1999). Para la construcción del virus se separó su
genoma en tres plásmidos (pSFV4.2, pSFV-Helper-Capsid y
pSFVHelper- Spike), plásmidos que son transcritos in vitro
(transcrito ARNm), utilizándolos luego para transfectar
una línea celular eucariota, obteniendo de esta forma
partículas virales que son empaquetadas y liberadas al
medio de cultivo. Durante el proceso de
elaboración de las partículas virales in
vitro, sólo el ARNm transcrito a partir del
plásmido pSFV4.2 contiene la información necesaria para ser empaquetado
al interior de la partícula viral, por ende, sólo
éste ARNm formará parte del genoma viral (Smerdou y
Liljeström 1999). El plásmido que codifica este
transcrito contiene un gen que codifica para la replicasa viral y
un sitio de multiclonaje, en el cual se puede insertar un gen que
codifique una proteína heteróloga (Frolov y col
1996). Estas características le confieren una alta
bioseguridad al sistema, debido a que permiten elaborar
partículas virales con un genoma incompleto, el cual no
puede replicarse (partículas virales suicidas),
funcionando como un simple pero eficiente vector de
expresión de proteínas heterólogas (Smerdou
y Liljeström 1999).

7.2.4. Vacunas ARN para B. abortus. Se ha
evaluado en un modelo murino la inducción de respuesta
inmune y protección, por un ARN recombinante que codifica
la proteína SOD Cu/Zn de B. abortus empaquetado
en el interior de partículas suicidas del virus Semliki
Forest (VSF-SOD). Describiéndose que la
inmunización con VSF-SOD estimula preferentemente una
respuesta inmune de tipo Th1, con la inducción de
proliferación de linfocitos T antígeno
específica y activación de células T
citotóxicas. Respuesta que fue protectora frente al
desafío con una cepa patógena, indicándose
su potencial uso como vacuna para Brucella (Oñate
y col 2005).

CONCLUSIONES

1. Brucelosis es una zoonosis que
no ha podido ser erradicada en la gran mayoría de los
países, a pesar de la aplicación de agresivos
programas de
vacunación con vacunas basadas en bacterias vivas
atenuadas.

2. Debido al potencial epidémico de
Brucella y la eficiencia de la infección por
aerosoles, este patógeno es considerado un agente
potencial que puede ser utilizado como arma biológica
liberado en bombas o a la
forma de aerosoles secos.

3. La citotoxicidad es crucial en la erradicación
de bacterias intracelulares. Linfocitos T CD8+ pueden
actuar como células efectoras y eliminar células
infectadas con Brucella directamente lisándolas,
por esto es fundamental determinar la especificidad de clones de
linfocitos TCD8+útiles en la protección
frente a Brucella.

4. Algunas proteínas purificadas de
Brucella ofrecen buenos niveles de protección
individualmente; posiblemente una vacuna compuesta por varias
subunidades de proteínas antigénicas de
Brucella proporcionaría una protección
superior.

5. La reciente generación de vacunas
genéticas basadas en ácidos nucleicos ADN y ARN
ofrecerían nuevas oportunidades de llegar a controlar las
infecciones intracelulares.

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1. Laboratorio de Inmunología Molecular, Departamento de
Microbiología, Facultad de Ciencias
Biológicas, Universidad de
Concepción, Casilla 160-C, Concepción, Chile.
# Proyecto FONDECYT
1010851, Chile.