Vitrificación como técnica de crioconservación de embriones bovinos (página 2)

4. Crioprotectores

Los embriones, al ser congelados, necesitan ser
deshidratados parcialmente a fin de evitar la formación de
cristales que lesionan las estructuras
citoplasmáticas (). Esta deshidratación se logra
incorporando un agente crioprotector al medio de
congelación. En la congelación de embriones se
utilizan dos tipos de crioprotectores:

PERMEABLES O INTRACELULARES: De bajo peso
molecular, Glicerol (G), Dimetilsulfóxido (DMSO), 1-2
propanodiol, etilenglicol (EG), propilenglicol (PG),
polietilenglicol (PEG), etanol y otros alcoholes;
todos estos compuestos deshidratan la célula
penetrando a ésta para ayudar a proteger el citoplasma
(Miyake
y col., 1993).

IMPERMEABLES O EXTRACELULARES: De alto peso
molecular, polivinilpirrolidona (PVP), glucosa,
fructosa, ficol, dextrano sorbitol, sucrosa, lactosa, trealosa,
rafinosa y otros azucares (Kuleshova
y col., 1999), estos compuestos extraen el agua libre
intracelular utilizando la diferencia de presión
osmótica sin penetrar a la célula;
son efectivos para preservar la funcionalidad y estructura de
las membranas a baja actividad de agua;
deshidratan junto con el crioprotector las células de
los embriones durante el equilibrio
(Sommerfeld
y Nieman, 1999).

Los crioprotectores previenen la deshidratación
total y la degeneración proteica, causada por la
congelación del agua intra y extracelular durante el
proceso.
Además, no deben ser tóxicos a los embriones. Para
reducir el daño
osmótico y tóxico del crioprotector, debido a la
alta concentración de sales, se ha dejado de utilizar G y
DMSO para hacer uso de EG, solo o en combinación con
sucrosa o trealosa que ha demostrado ser menos tóxico
(Dochi
y col., 1990;
Leeuw y col., 1994). Dado su bajo peso
molecular, el EG tendría una mayor velocidad de
penetración y, por ende, necesitaría menor tiempo de
exposición, disminuyendo su efecto
tóxico (Saha
y col., 1996).

Se ha demostrado lo importante que es el estado de
desarrollo
embrionario en la velocidad de penetración del
crioprotector.
Leibo (1977) demostró que la
permeabilidad de los embriones a los crioprotectores se
incrementa luego de la fecundación, aumentando a medida que el
desarrollo
embrionario progresa. Esto se debería a la diferencia
que existe en la relación área/volumen en un
embrión en los primeros estadios del
desarrollo.

La etapa del desarrollo más apropiada para la
vitrificación en etilenglicol es la mórula compacta
y blastocisto temprano de embriones producidos in vivo o in
vitro (Cocero
y col., 2000), así como también se
ha demostrado que embriones producidos in vitro tienen
menor tolerancia a la
congelación debido a la formación de hielo
intracelular, aumento en la concentración de lípidos y
enzimas que
digieren la zona pelúcida, lo que los hace más
sensibles al enfriamiento y a la invasión de virus, bacterias y
hongos
(Saha
y col., 1995;
Semple y col., 1995;
Kobayasi y col., 1994;
Le Gal y Massip, 1999;
Dattena y col., 2000). Otro aspecto a
considerar es la calidad de los
embriones a vitrificar, ya que cuando se congelan embriones de
buena calidad, se obtienen mejores resultados que cuando se
congelan aquellos de calidad regular (Humbolt
y col., 1987).

Está claro que la congelabilidad de los embriones
mamíferos varía con la especie del
animal. Esta diferencia de especie está claramente
establecida entre embriones bovinos, porcinos y equinos. Sin
embargo trabajos recientes demuestran que embriones de bovinos,
ovinos, ratones y conejos tienen un comportamiento
similar a la congelabilidad (Hasler
y col., 1995;
Sommerfeld y Niemann, 1999;

Saha y col., 1996).

5. Conservacion de embriones

Los embriones pueden ser conservados, in vitro,
para su posterior transferencia mediante: Cultivo a temperatura
ambiente,
refrigeración entre 0 °C a + 4 °C
ó congelación a –196 °C.

CONSERVACION A TEMPERATURA AMBIENTE. Un paso
indispensable en la transferencia de embriones es la
conservación temporal de embriones recobrados de una
donadora antes de ser transferidos o congelados, ésta se
realiza en un medio de Solución Buffer Fosfato (PBS),
suplementado con 10% suero, una fuente de proteínas
que reduce la tensión superficial favorece la
sedimentación, evita que los embriones se adhieran a
algún elemento utilizado para su manipulación,
incorpora sustancias promotoras del crecimiento que favorecen su
desarrollo, absorbe e inhibe metales pesados
tóxicos que puedan estar presentes en el medio. La
viabilidad embrionaria declina después de 12 horas
(Palma
y Brem, 1993).

REFRIGERACION. Ha quedado claro que embriones de
bovinos mantenidos en un medio no nutritivo por un largo tiempo y
a temperatura ambiente decrecen ampliamente su capacidad de
desarrollo, este desarrollo puede ser preservado si los embriones
se refrigeran de 0 a 4 ºC por no más de 24 horas
(Refsdal
y col., 1988). La refrigeración se
efectúa vehiculizando los embriones en PBS envasados en
pajuelas de 0.25 ml y colocadas en un refrigerador. Se utiliza
hielo y agua para regular el descenso de la temperatura, de
manera similar a como se realiza la estabilización del
semen (Landsverk
y col. 1992). La refrigeración de
embriones puede ser considerada como una alternativa interesante
cuando no sea posible recurrir a la
congelación.

CONGELACION ESTANDAR. El método de
congelación estándar posibilitó a

Wilmut y Rowson (1973)obtener el primer
ternero nacido de la transferencia de un embrión
congelado. Al método estándar se le han efectuado
desde entonces distintas modificaciones tendientes a su
simplificación.

En el método de congelación
estándar la exposición de los embriones al medio de
congelación (PBS + G) debe realizarse a temperatura
ambiente (20 – 22 °C), en un solo paso, de 10 a 30 minutos de
duración (Chupin
y Procureur, 1984;
Niemann, 1991). Este período
incluye el envasado de los embriones en pajuelas
plásticas. Esto permite realizar más
rápidamente y con mayor precisión la inducción de la cristalización o
"seeding" (Maurer,
1978). Las pajuelas deben ser colocadas en un
equipo de congelación a -7 °C durante 5 minutos para
equilibrar la temperatura de las pajuelas con la del equipo; el
seeding se realiza poniendo en contacto la superficie de la
pajuela con una placa metálica enfriada con
nitrógeno líquido (NL2); el agente
refrigerante del equipo puede ser nitrógeno líquido
alcohol o
etanol enfriado por medio de un compresor.

El no inducir la cristalización conduce a la
formación de cristales de hielo bajo un estado de
súperenfriamiento y a una elevación repentina de
temperatura (se genera calor latente
de –10º – –15 ºC), resultando un severo
trauma físico que puede dañar las células
(Niemann,
1995).

Una vez efectuado el seeding, se mantiene la temperatura
estable durante 10 minutos (período de
estabilización) y luego se desciende a una velocidad de
entre 0.1 y 0.5 °C hasta -30 ó -35 C para establecer
un adecuado balance entre deshidratación y
formación de hielo intracelular, en este momento las
pajuelas pueden ser retiradas del equipo de congelación y
sumergidas en nitrógeno líquido (Lehnjensen
y Greve, 1982). La descongelación se
realiza de manera rápida, sumergiendo las pajuelas en
baño María a 30 ó 35 °C durante
20–30 segundos.

CONGELACION RAPIDA. Método desarrollado
por
Chupin (1986). Los embriones son
deshidratados parcialmente como ocurre en el método
estándar, luego se les deshidrata nuevamente
colocándolos en una solución mixta de glicerol y
sucrosa. Esta segunda deshidratación deja a los embriones
en condiciones de ser enfriados rápidamente. Las pajuelas
son colocadas en el cuello del termo de nitrógeno, durante
5 minutos, posteriormente son sumergidas al NL. Los resultados
obtenidos fueron dispares, según el estadio de desarrollo
del embrión congelado.
Martino y col. (1996)realizaron
modificaciones, congelando ovocitos en gradillas de microscopio
electrónico con 1 µl de EG sumergiéndolas
inmediatamente en NL. Obteniendo tasas de sobrevivencia
semejantes a los de ovocitos expuestos al EG, pero sin
congelamiento.

VITRIFICACION. La vitrificación es un
proceso físico de solidificación utilizado para
conservar órganos, tejidos y
embriones. La solución vitrificante (SV) lleva incorporado
crioprotectores en alta concentración. Al ser enfriada no
cristaliza, sino que se torna viscosa y pasa del estado
líquido a un estado sólido no estructurado similar
al vidrio, tomando
de ahí su nombre. Todo el procedimiento
desde el equilibrio hasta la inmersión en NL no requiere
más de 10 minutos (Fahy
y col., 1984;
Rall y Fahy, 1985).

Durante el proceso de vitrificación, el
embrión esta sometido a deshidratación durante el
enfriamiento e hidratación durante el descongelamiento.
Esto se debería a que a medida que desciende la
temperatura, se va formando mayor número de cristales de
hielo provenientes de agua pura intracelular, y así la
concentración del soluto va aumentando en los espacios que
aún no se congelan. Este choque osmótico es
conocido como "efecto solución", y puede llegar a ser
dañino para la sobrevivencia del embrión
(Scheider
y Mazur, 1984), debido a la pérdida del
equilibrio de las soluciones
intra y extracelulares, respuestas químicas y
osmóticas de las células a dichos
efectos.

Para obtener buenos resultados se deben tomar en cuenta
los siguientes factores: volumen de la muestra,
concentración de crioprotector, método de
adición, temperatura y tiempo de equilibrio,
solidificación, tasa de enfriamiento y cambios en el
volumen (Arav
y col., 2000), debido a que estos factores
están estrechamente relacionados con la permeabilidad y la
toxicidad del crioprotector (Miyake
y col., 1993).

El máximo daño en el embrión
durante el enfriamiento ocurre de -15 a -16 ºC debido a la
fase de transición de la membrana lipídica. Esta
fase se ve afectada por la fusión de
los liposomas afectando el termocomportamiento de las membranas
en la transición de líquido a gel (Zeron
y col., 2000) y la velocidad de
penetración de los crioprotectores (Thompson,
1997;
Pugh y col., 2000). El daño celular
incluye pérdida de microvellosidades, disrupción de
la membrana plasmática, cambios mitocondriales,
hinchamiento del retículo endoplásmico,
pérdida de uniones entre células así como
fractura de zona pelúcida (Edashige
y col, 1999;
Ohboshi y col., 1998).

TECNICAS DE VITRIFICACION. Antes de la
vitrificación, los embriones deben ser equilibrados con el
crioprotector a temperatura ambiente. La metodología descrita por
Sheffen y col. (1986)indica que la
exposición a la solución de equilibrio (SE) (10% G
+ 20% PG en PBS) debe realizarse a temperatura ambiente (20
ºC), durante 10 minutos y la exposición a la SV (25%
G + 25% PG) a 4 ºC.
Dobrinsky y col. (1991)deshidrataron al
embrión en SE (10% G y 25% PG) por 7 minutos a 20 ºC,
pasando a SV (25% G y 25% PG) manteniendo la misma temperatura
hasta introducirlo al NL.

Dochi y col. (1990) y
Kasai (1996) equilibraron mórulas y
blastocistos bovinos (10% G + 20% 1–2 Propanodiol) durante
10 minutos, luego los expusieron a SV (25% G + 25% 1-2
Propanodiol + sucrosa 1M en PBS), inmediatamente después
de cerrada, la pajuela se introdujo lenta y progresivamente en el
nitrógeno para que se produzca simultáneamente la
vitrificación de los compartimentos extra e
intracelulares, lo que posibilitó transferir los embriones
a campo. Utilizando estas soluciones se obtuvo porcentajes de
preñez del 50%, demostrando que son soluciones estables
con poca tendencia a cristalizar durante el
enfriamiento.

Sommerfeld y Niemann (1999)vitrificaron
embriones bovinos producidos in vitro (IVP) con EG 1.5 –
1.8 M, teniendo porcentajes de desarrollo del 42%.

Dochi y col. (1995)utilizaron 40% EG, 20%
PVP y 11,3% trealosa, para determinar la toxicidad de la
vitrificación con relación a la temperatura y
tiempo de exposición. El tratamiento fue llevado a cabo a
20 ºC, durante 5 minutos, en PBS, obteniendo tasas de
desarrollo del 84%.

Rall y Fahy (1985) y
Massip y col. (1987)vitrificaron embriones
de ratón de 8 células, éstos se equilibraron
progresivamente a 4 ºC, con DMSO 20.5%, acetamida 15.5%, PG
10% y PEG 6% en PBS Dulbeco modificado, luego se sumergieron en
NL. Los embriones sobrevivieron después de ser cultivados
in vitro y se obtuvieron nacimientos vivos en un
39.1%.

Vajta y col. (1996a)equilibraron embriones
de 7 días en SV al 50% (12.5% EG y 12.5% DMSO + 75% PBS) a
temperatura ambiente durante 5 minutos, fueron transferidos a SV
al 100% (25% EG y 25% DMSO) a 4 ºC durante 20 segundos y
posteriormente sumergidos en nitrógeno, obteniendo altas
tasas de preñez con blastocistos tempranos.

Dhali y col. (2000)utilizaron una
combinación de EG 3.5M y DMSO 3.4M con un tiempo de
equilibrio de 3 minutos obteniendo tasas de desarrollo del
69%.
Yang y col. (2000) probaron la
adición de PVP (10%) y Trealosa (0.3M) obteniendo
porcentajes de preñez del 50% en embriones producidos
in vitro y 55% en embriones producidos in
vivo.

La técnica descrita por
Vajta y col. (1996a) ha sido usada para
vitrificar embriones posterior a la biopsia, para un eventual uso
en el sexaje de embriones (Vajta
y col., 1996b;
Vajta y col., 1997a), sin afectar el
desarrollo hasta blastocisto sobre los controles.

La misma técnica se ha usado también para
vitrificar embriones posterior a una eclosión asistida de
los blastocistos (Vajta
y col., 1997b) sin afectar el desarrollo
posterior sobre los controles.
Saito (1994),
Saito e Imai (1997),
Donnay y col. (1998)vitrificaron
blastocistos de bovinos en tres pasos 1) 5 minutos (Sucrosa 0.1M,
Xilosa 0.1M, PG 1%, G 10%,.); 2) 5 minutos (Sucrosa 0.1M, Xilosa
0.1M, PG 1%, Glicerol 10%, EG 10%) 3) 1 minuto (Sucrosa 0.1M,
Xilosa 0.1M, PG 1%, G 10%, EG 20%), en Dulbeco-PBS a temperatura
ambiente y posteriormente sumergidos en NL. Obteniendo tasas de
desarrollo del 72%, 88,9% y 71% respectivamente.
Kaidi y col. (2000),
López y López
(2000)utilizaron la misma técnica
empleando embriones de ovinos y conejos, mejorando los resultados
antes mencionados. Este método, en dos pasos, había
sido descrito por
Sheffen y col. (1986) en embriones de
ratón, obteniendo resultados similares a los de sus
colegas, más no así
Viscarra (1996).

La descongelación puede realizarse exponiendo las
pajuelas a temperatura ambiente durante 10 segundos antes de
colocarlas en baño María 30-35 ºC, 20-30
segundos (Rall
y Meyer, 1986). En ésta debe estar
presente un agente permeable extracelular como la albúmina
sérica bovina (BSA) que proteja y estabilice las membranas
celulares para que no se detenga el transporte de
agua a través de éstas, evitando que la
célula sufra lisis durante la difusión del
crioprotector y daño en la capa trofoblástica
(Saha
y col., 1996;
Massip y col., 1987).

Los crioprotectores pueden ser removidos de los
embriones en tres y seis pasos en forma escalonada, hasta lograr
una concentración final de PBS sin crioprotector.

Saito (1994) utilizó dos pasos
sucrosa 0.5M. y 0.25M, manteniendo al embrión durante
cinco minutos en cada una. El embrión también puede
transferirse en forma directa.
Leibo (1984) desarrolló técnicas
que permiten extraer el glicerol dentro de la pajuela,
modificación conocida como "método de un solo paso
en pajuela", donde la variación radica en la
disposición de las distintas soluciones (0.24M sucrosa,
1.4M G con el embrión y 0.25M sucrosa en PBS divididas las
soluciones por columnas de aire).

Esta técnica permite transferir embriones
congelados a campo sin necesidad de equipos y laboratorios muy
costosos, obteniendo tasas de preñez que oscilan entre el
30 y el 50 %. Cuando el glicerol es extraído dentro de la
pajuela, los porcentajes de preñez se pueden ver afectados
por prescindir de la evaluación
morfológica (Niemann,
1991).

En los últimos trabajos realizados en
vitrificación se ha intentado reducir al máximo el
daño celular, por los crioprotectores, su
concentración y su volumen. Esto llevó a

Vajta y col. (1997c,
1998) a ensayar una técnica de
vitrificación denominada OPS (Open Pulled Straw) que
consiste en adelgazar una pajuela plástica de 0.25 ml,
calentándola sobre una platina y estirándola en su
parte central hasta que su diámetro interior llegue a 0.7-
0.8 mm. Luego de enfriada la pajuela es cortada en su parte
más delgada. El embrión es recogido por la parte
más fina de la pajuela mediante capilaridad y luego esta
es inmediatamente sumergida en NL. Embriones de 8 días
sobrevivieron al cultivo en un 81% utilizando este
método.

Kong y col. (2000)vitrificaron en una
ultra mini pajilla (1.0 – 0.8 mm de diámetro) para
reducir el daño por el alto volumen de la SV, obteniendo
tasas de desarrollo a la descongelación y cultivo del
72%.

Recientemente se ha ensayado el uso de diferentes tipos
de contenedores para vitrificación de embriones, como son
las gradillas de cobre para
microscopio electrónico (Martino
y col., 1996) y las mallas de nylon
(Matsumoto
y col., 2001). En estos contenedores se
logró vitrificar de 15 a 65 embriones a la vez. Los
resultados obtenidos utilizando estas técnicas de
vitrificación fueron similares a sus controles y ofrecen
una nueva alternativa para criopreservar gran número de
embriones.

6. Conclusiones

El resultado de la vitrificación está
condicionado previamente por dos factores. La calidad del
embrión y el estado de desarrollo embrionario. Cuando se
congelan embriones de calidades muy buena y buena se obtienen
mejores resultados que cuando se congelan aquellos de calidad
regular. La etapa del desarrollo más apropiada para la
vitrificación de embriones es mórula compacta a
blastocisto expandido, siendo más sensibles a las bajas
temperaturas los embriones producidos in vitro.

Para elegir el mejor método de
vitrificación se deben tomar en cuenta diferentes factores
como son los siguientes: crioprotectores a utilizar, estos deben
manejarse en adecuada concentración, adicionarse al
embrión en forma creciente y a tiempos determinados, en
combinación con otros crioprotectores que sean de baja
toxicidad, para que sean utilizados con el menor volumen posible,
temperatura de adición y con tasas de enfriamiento lo
suficientemente rápidas para evitar la pérdida del
equilibrio osmótico y causar daño celular que
comprometa la viabilidad embrionaria.

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