Un método nuevo para aislar e identificar directamente mutantes Nit- en Escherichia coli K12 (página 2)

METODOLOGÍA

1. Cepas y condiciones de
crecimiento. Las cepas bacterianas de E.
coli, de fagos y plásmidos utilizadas se describieron
en la Tabla 1. Las bacterianas se incubaron a 30º C. Los
cultivos anaeróbicos se prepararon sembrando en tubos
totalmente llenos con el medio de cultivo, e incubando sin
agitación; la anaerobiosis estricta se realizó bajo
atmósfera
de hidrógeno y dióxido de carbono,
utilizando el sistema Gas-Pack.

2. Medios de
cultivo. La composición del medio sintético y
los suplementos adicionados fueron descritos en la Tabla 2. La
composición de los medios ricos y diferenciales fue
reportada (Miller 1972). Cuando se indicó fueron
añadidos: 20mM de KNO3, 1mM de
Na2Mo4, 16 mM de KClO3, 40 mM de
fumarato de sodio, 2 mg/ml de casaminoácidos, 0,05 mg/ml
de ampicilina, 0,1 mg/ml de 2,3,5 trifenil tetrazolio cloruro
(TTC). Como fuente de carbono en los medios sintéticos se
agregó 2 mg/ml de glucosa o
lactosa y 4 mg/ml de glicerol, según el caso.

3. Experimentos
genéticos. (3.1) Ensayos de
ligamiento. La localización de la mutación
pleiotrópica Nit- Gas- de las cepas MA se determinó
por transducción generalizada con el fago P1vir,
siguiendo el procedimiento de
Lennox descrito por Miller (1972).

Las cepas MA se utilizaron como donante para transducir
a las receptoras LCB413 y LCB559, según el cruce. Antes de
sembrar, las mezclas de
transducción fueron lavadas por centrifugación y
concentradas diez veces. Los transductantes Gal+ fueron aislados
en medio diferencial y los Met+ en medio sintético
selectivo; una vez purificados en ese mismo medio fueron
sometidos a los ensayos fisiológicos y fenotípicos
indicados. El grado de ligamiento de la mutación se
expresó como el porcentaje de Nit- Gas- respecto al total
de clones transductantes ensayados Gal+ o Met+, según el
caso.

(3.2) Obtención y caracterización de
merodiploides heterocigotas. Una preparación
conteniendo ADN del
plásmido pSJE100 (moa+), obtenida por lisis
alcalina de la cepa SE5000, se utilizó para transformar a
la cepa RK5200, siguiendo las metodologías descritas
(Sambrook et al. 1989). Transformantes Nit+ ApR fueron
aislados por el método TNC
aquí desarrollado y algunos clones independientes
reaislados se sometieron a ensayos fenotípicos y
fisiológicos. La presencia física del
plásmido fue verificada en geles de agarosa al 1%,
según la metodología descrita (Sambrook et al.
1989). 

4. Ensayos fisiológicos. (4.1) Crecimiento
por resistencia al
clorato (ChlR), se modificó el método
original (Piéchaud et al. 1969) sembrando las bacterias en
superficie o por rayado (Ortega de L. 1982). (4.2)
Crecimiento utilizando nitrato como aceptor final de electrones,
se sembró en superficie sobre medio sintético
conteniendo glicerol y nitrato, e incubó en anaerobiosis
estricta por 4 a 5 días (Lambden y Guest 1976).
(4.3) Reducción del nitrato a nitrito (Nit+), se
determinó espectrofotométricamente agregando
reactivo de nitritos a cultivos crecidos anaeróbicamente
en caldo nutritivo glucosado conteniendo nitrato (Showe y Demos
1968); en medio sólido se utilizaron colonias crecidas por
rayado sobre agar nutritivo conteniendo glucosa, luego se
colocó un papel filtro impregnado con nitrato y,
después de 20 a 30ºC, se reemplazó por otro
impregnado con reactivo de nitritos. (4.4)
Reversión fenotípica por molibdato, se
procedió igual al punto anterior pero suplementando el
medio con molibdeno (Glaser y Demos 1971). (4.5)
Reducción del nitrito (Nir+), se procedió igual que
en 4.3 pero el nitrato se reemplazó por nitrito para
verificar su desaparición con el crecimiento del cultivo
(Abou-Jaoude et al. 1978). (4.6) Aparición de
colonias rojas (TNC+), se evaluó durante el crecimiento
usando el método TNC aquí desarrollado.
(4.7) Liberación de gas (Gas+), se evidenció
durante el crecimiento anaeróbico en tubos durham
conteniendo caldo nutritivo glucosado (Puig et al. 1969). (4.8)
Crecimiento utilizando fumarato como aceptor final de electrones
(Frd+), se sembró en superficie sobre medio
sintético conteniendo glicerol y fumarato, e
inocubó en anaerobiosis estricta por 4 a 5 días
(Lambden y Guest1976).

5. Ensayos fenotípicos. Los requerimientos
nutricionales, fermentación de azúcares,
resistencia a drogas,
inmunidad a fagos y termosensibilidad fueron ensayados
según Miller (1972).

6. Ensayos enzimáticos. La actividad NRA
fue cuantificada espectrofotométricamente en células
enteras inducidas crecimiento en anaerobiosis con nitrato),
siguiendo la reacción de oxidación del donador
artificial bencil viológeno (BV-H), dependiente del
nitrato y bajo las condiciones descritas (Jones y Garland 1977);
la concentración de nitritos producidos se
cuantificó usando una curva de calibración. Las
proteínas totales se determinaron
según Lowry et al. (1951), y se usó una curva de
calibración elaborada con albúmina
bovina.

RESULTADOS Y
DISCUSIÓN

Desarrollo y estandarización del TNC como
método nuevo para identificar mutantes Nit- afectados en
cualquiera de los genes nar, mol y
fnr.

Fimmel y Haddock (1979) desarrollaron un método
muy eficiente para aislar, en forma directa y selectiva,
mutaciones en chlC (operon narGHJI). Las cepas
bacterianas mutantes se coloreaban de rojo, a diferencia de las
silvestres y mutantes pleiotrópicas Nit- Gas- afectadas en
chlA(moa) y chlB(mob) que
permanecían incoloras después de 6 días de
crecimiento en anaerobiosis estricta, en cajas de medio
sintético (Vogel-Bonner) conteniendo glucosa, nitrato y
tetrazolio (TTC).

En el presente trabajo, el
método anterior fue sometido a una serie de modificaciones
para ampliar su espectro de especificidad y lograr identificar
una mayor variedad de genes mutados. Los cambios más
importantes fueron los siguientes:

1. La composición del medio de cultivo. En
la fórmula del medio sintético de Vogel-Bonner
(Vogel y Bonner 1956), los aminoácidos fueron reemplazados
por una solución de casaminoácidos libre de
vitaminas. Se
ensayaron concentraciones crecientes de tetrazolio (0,025 hasta
0,250 mg/ml), nitrato (1 hasta 2 mg/ml) y glucosa (1 hasta 4
mg/ml).

2. Las condiciones de aereación. Las cajas
fueron incubadas con y sin anaerobiosis estricta, durante tiempos
crecientes (1 hasta 6 días).

Cada modificación fue valorada comparando el
comportamiento
de capas de E. coli Nit-, seleccionadas por resistencia al
clorato (Tabla 1, colección J. Puig) y sus respectivas
isogénicas silvestres. Tres métodos de
siembra fueron ensayados:

i. Agotamiento;
ii. Rayado;
iii. Siembra en superficie de una mezcla preparada a partir de
dos cultivos de igual concentración celular,
correspondientes a una cepa mutante y otra silvestre
Nit+.

La mejor condición fue denominada TNC (tetrazolio
nitrato casaminoácidos) (Tabla 2) y se escogió
porque permitió evidenciar, más rápida y
claramente, la coloración roja de las colonias (fenotipo
TNC+), indistintamente de la mutación llevada por cada una
de las cepas mutantes ensayadas; las cepas silvestres utilizadas
como control
permanecieron incoloras (fenotipo TNC-). Los resultados obtenidos
fueron totalmente reproducibles en más de diez ensayos
independientes. Esto también fue observado cuando se
utilizaron mutaciones de deleción y de inserción en
diferentes genes (Tabla 1).

Por lo tanto, el método TNC aquí
desarrollado resultó ser más sencillo y
presentó las siguientes ventajas adicionales: i. Es
eficiente para detectar directamente mutantes Nit-, en cualquier
gen nar, mol y fnr; ii. El color rojo de las
colonias puede observarse tempranamente, a partir de las 24 hr.
de incubación; los mejores resultados en la siembra de
superficie son obtenidos con cantidades máximas de 2.000
colonias por caja; iii. No es necesario incubar bajo condiciones
de anaerobiosis estricta.

Los resultados aquí obtenidos dejan sin validez
la hipótesis de trabajo propuesta por Fimmel y
Haddock (1979), para explicar bioquímicamente la no
reducción del TTC en las cepas con mutaciones diferentes a
chlC-.

Según esos autores, la citocromo oxidasa es
inhibida por el bajo pH resultante
de la acumulación del ácido fórmico
producido durante el crecimiento anaeróbico, en ausencia
de un sistema Formiato Hidrógeno Liasa (FHL)
funcional.

Todos los mutantes aquí utilizados (Tabla 1) se
chequearon previamente para los fenotipos Nir, Nit,
reversión fenotípica por molibdato y Frd, a tiempos
crecientes de incubación en los medios de cultivo: 24, 48
y 72 horas. Los resultados se correspondieron con lo esperado
(Stewart 1988), excepto para los mutantes afectados en el
operón moe (chlE) que fueron capaces de
revertir con molibdato después de las 48 h de
incubación. Esto último permitió establecer
un criterio preliminar de clasificación fisiológica
para los mutantes Nit- Gas- basado en cuatro subclases
genotípicas (Tabla 3).

Comparación del método TNC con el de
resistencia al clorato, para aislar mutantes Nit.

La resistencia al clorato (ChlR) es un
método de alta eficiencia que,
permite seleccionar directamente mutantes Nit-, por su capacidad
de crecer en agar nutritivo con glucosa y clorato, en un lapso de
4 a 5 días de incubación en anaerobiosis estricta
(Piéchaud et al. 1969). Es tradicionalmente utilizado para
tal fin, pero la mayoría de los mutantes ChlR
llevan mutaciones en los genes mol (moa, mod o moe)
y preferencialmente en moa o mob (Piéchaud
et al. 1969, Case 1970, Glaser y DeMoss 1972).

Sin embargo, el método TNC aquí
desarrollado ofrece otras ventajas: i. Se basa en el uso de un
medio semisintético diferencial, lo cual evita la
presencia de compuestos bacterianos tóxicos como manera de
ejercer una presión
selectiva, ii. Los resultados se observan una presión
selectiva, ii. Los resultados se observan tempranamente, durante
el crecimiento de las colonias, iii. No se requiere anaerobiosis
estricta.

Con el propósito de valorar la aplicación
del TNC, como un método nuevo y alternativo al de
resistencia al clorato, ambos fueron utilizados para aislar
mutantes ApR previamente inducidos por
mutagénesis biológica (Ortega de L. y Orozco de S.
1982) usando el fago MudI (Casadaban y Cohen 1979).

El porcentaje de clones ApR TNC+ fue
considerablemente superior al de ApR ChlR:
1,2% y 0,4%, respectivamente (Tabla 4), y, es posible atribuirlo
a la presión selectiva ejercida por el clorato. Cientos de
clones independientes aislados por cada método fueron
retenidos y relacionados como MA. Se escogieron aquellos que
cumplían con las características de la receptora, y
se examinaron los fenotipos Nit-, TNC+ y ChlR. La
correspondencia observada entre esos tres fenotipos fue inferior
al 100% (Tabla 4), por lo tanto, ninguno de los dos
métodos fue totalmente específico para aislar
mutantes Nit-. Sin embargo, el valor
corregido de la frecuencia de mutantes Nit- TNC+ fue 6,2 x
10-3 que, es aproximadamente 3 veces superior a 2,6 x
10-3 obtenido con el método
ChlR.

Valoración del TNC como método que
permite aislar un mayor espectro de genes mutados.

Los mutantes MA que resultaron Nit-, se clasificaron
preliminarmente en diferentes subclases genéticas (Tabla
5), aplicando el criterio descrito en la Tabla 3.

Efectivamente, el método de resistencia al
clorato fue de mayor especificidad para aislar mutantes
pleiotrópicos Nit- Gas- (98,5%). Por su parte, el TNC
permitió aislar eficientemente mutantes no
pleiotrópicos (21%) y pleiotrópicos (79%), con una
mayor distribución de genes mutados. Con ambos
métodos se aislaron posibles mutantes en fnr, pero
el TNC mostró el mayor porcentaje.

Todos los mutantes pleiotrópicos ensayados
conservaron la capacidad de crecer anaeróbicamente en
medio sintético a expensas de glucosa, lo cual
descartó la presencia de una mutación ana
(30). Doce mutantes pleiotrópicos, excluyendo los posibles
mod-, fueron ensayados bioquímicamente y todos
resultaron defectivos en la actividad enzimática de la
NRA. Seis de ellos fueron analizados genéticamente
transduciendo la mutación a una cepa receptora que
presentaba un marcador de aislamiento (gal o met,
según el cruce), ligado al posible gen mutado (Tabla
6).

Clones recombinantes para el marcador respectivo fueron
aislados y caracterizados: todos los TNC+ fueron Nit- Gas- y
todos los TNC- permanecieron Nit+ Gas+. El valor de
cotransducción de Nit- Gas- se comparó con
criterios previamente establecidos: entre 20% y 32% con
gal+ indicaba mutaciones moa (2,18,31), entre 9% y
17% con met+ eran mob (15) y un 3% con gal+
eran moe (2,18,32,33). Los valores
obtenidos en los distintos cruces realizados (Tabla 6) mostraron
una estrecha correspondencia con el tipo de mutación
estimada según la clasificación fisiológica
preliminar (Tabla 3), lo cual aportaba confiabilidad a este
criterio.

Las cepas donantes MA14, 31 y 45 habían sido
aisladas 4como mutantes ApR TNC+, entonces fue posible
proponer al TNC como un método alternativo pero que
permite alcanzar una mayor frecuencia y distribución de
genes mutados, detectando simplemente la aparición de
colonias rojas.

Aplicación del método TNC para otros
fines genéticos.

Clones merodiploides heterocigotas moa+ /
moa– se construyeron transformando una cepa mutante
moaA– 200::Mucts (RK5200) con el plásmido
pSJE100 que porta el operón moa+. El fenotipo TNC-
(colonias incoloras) se utilizó en combinación con
el marcador ApR del plásmido, para aislar
transformantes silvestres Nit+ Gas+. De doce clones
independientes reaislados, todos ellos mostraron
restauración en trans de ambos fenotipos; la
presencia del plásmido fue comprobada
físicamente.

Transformantes merodiploides heterocigotas para el
operón narC, se han aislado aplicando el
método TNC, observándose además que, la
intensidad del color de las colonias variaba, según el
porcentaje de restauración del fenotipo Nit+ (datos no
presentados).

El método TNC se ha valorado ampliamente con
fines genéticos diversos, obteniéndose muy buenos
resultados (Ortega de L. 1982,1985, Ortega de L. y Ball 1985,
Ortega de L. y Díaz 1995).

CONCLUSIONES

1. El método TNC aquí desarrollado es
recomendable por su sencillez, eficiencia y confiabilidad para
aislar, identificar y cotransferir fenotipos Nit+ (TNC-) y Nit-
(TNC+) de procedencia genómica o
plasmídica.

2. Por lo tanto, puede ser utilizado con diferentes
propósitos, entre otros:

Construir simplemente cepas bacterianas nuevas; Estudios
de ligamiento dirigidos a mapear mutaciones TNC+ recién
aisladas; Estudios fisiológicos y de regulación;
Análisis de estructura
fina.

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. J. Puig (Facultad de Ciencias,
Universidad de
Los Andes, Mérida, Venezuela) por
la generosa donación de sus cepas. Igualmente agradezco al
Dr. M.

Chippaux (L.C.B., C.N.R.S., Marsella, Francia) por
suministrarme la cepa SE5000 del Dr. D. Boxer, y al
Dr.

M. Dubourdieau (Facultad de Ciencias, U.L.A.,
Mérida, Venezuela) por las cepas del Dr. V. Stewart. El
apoyo financiero de este trabajo fue suministrado por el
CDCHT-ULA, Venezuela, a través de distintos proyectos.

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