Construcción y expresión de una proteína recombinante de la envoltura del virus linfotrópico humano tipo I (HTLV-I)
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RESUMEN
El virus
linfotrópico humano tipo I de las células T
(HTLV-I) es un oncorretrovirus asociado con la leucemia de
células T adultas (ATL) y la Paraparesia Espástica
Tropical (PET). El gen env del virus codifica la
glicoproteína precursora gp62, que mediante procesamiento
produce la gp21 (transmembranal) y la gp46 (superficie). Se ha
demostrado la alta inmunorreactividad de la gp46 en sueros de
individuos infectados. Con el propósito de obtener una
proteína recombinante útil en diagnóstico y en una potencial vacuna, se
clonó en el vector de expresión de Baculovirus
"bácmido" pBlueBac4.5His el segmento de 144bp obtenido
mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con
cebadores que amplifican la región 5622-5765 nt. El
construido pBlueBacRENV fue transfectado en células del
insecto Mamestrae brassicae (clon MB 8003) recuperándose
la proteína recombinante. La proteína RENV
reaccionó específicamente con suero de personas
infectadas con HTLV-I. Los resultados obtenidos mostraron que la
proteína RENV puede ser utilizada para el
diagnóstico serológico de la infección por
HTLV-I y en la evaluación
de nuevas vacunas.
Palabras clave: ADN recombinante.
Retrovirus. gp46. HTLV-I. Clonación. Baculovirus.
SUMMARY
Human T-Cell Lymphotropic Virus Type I (HTLV-I) is an
oncoretrovirus associated with Adult T-Cell Leukemia/Lymphoma
(ATL) and Tropical Spastic Paraparesis (TSP). The viral env gen
encodes gp62 glycoprotein precursor that is cleavage to produce
the gp21 (transmembrane) and gp46 (surface). Previous reports
showed that gp46 is highly immunoreactive in sera from infected
individuals. With the purpose to obtain a recombinant protein to
be used for diagnosis and potential vaccine, we cloned into
Baculovirus expression vector pBluebac4.5His bacmids, the 144bp
segment obtained by PCR with primers for 5622-5765 nt region. The
construct pBlueBacRENV was transfected into insect cells of
Mamestrae brassicae (MB 8003) and the recombinant protein was
recovered. The protein showed cross reactions with sera of HTLV-I
infected people exclusively. These results enabled us to propose
this protein can be used in serologic diagnosis for HTLV-I
infection and as a candidate for a vaccine.
Key word:
Recombinant DNA. Retroviruses. gp46. HTLV-I. Cloning.
Baculoviruses.
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El virus linfotrópico humano tipo I de las
células T (HTLV-I) presenta una elevada seroprevalencia en
el suroccidente colombiano, es el agente etiológico
asociado con la leucemia de células T del adulto (ATL) y
con una enfermedad neurodegenerativa denominada paraparesia
espástica tropical/mielopatía asociada con el
HTLV-I (PET/HAM)1. La PET/HAM y la ATL son dos
enfermedades
completamente diferentes a pesar de estar asociadas con el
HTLV-I2,3.
El genoma del HTLV-I posee tres regiones
genéticas que codifican los precursores de la
nucleocápside (gag) del complejo transcriptasa
reversa-polimerasa-integrasa (pol) y de las
glicoproteínas de la envoltura viral (env). Además
posee dos regiones de repetición largas en sus extremos
denominadas LTRs. El producto del
gen env del HTLV-I es la glicoproteína precursora gp62,
que es procesada para producir las dos proteínas
maduras de la envoltura del virión: la
glicoproteína gp46 de superficie y la transmembranal gp21.
La gp46 es esencial en las etapas tempranas de la
infección viral y es la proteína más
inmunogénica de todos los antígenos virales. Inicialmente
Palker4, demostró que la proteína gp46
de la envoltura del HTLV-I es el antígeno viral
predominante reconocido por anticuerpos circulantes en el suero
de pacientes infectados con HTLV-I. También se ha
demostrado que en otras infecciones retrovirales como en el caso
del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1), la
mayoría de los anticuerpos neutralizantes son dirigidos
contra proteínas de envoltura2.
Estudios previos realizados por Palker4,
revelaron variaciones en la reactividad de diferentes regiones de
la proteína de envoltura del HTLV-I. Estos autores
ensayaron tres péptidos sintéticos que
cubrían diferentes dominios de la proteína gp62 y
encontraron que la región más inmunoreactiva es la
parte media que corresponde al dominio de
superficie SU de la gp46. La información sobre los niveles de
reactividad de anticuerpos humanos a regiones específicas
de la gp62 es de gran utilidad en los
procedimientos
de diagnóstico clínico, tamizaje y en el desarrollo de
una posible vacuna contra el HTLV-I5.
Uno de los objetivos
más importantes de la biotecnología molecular es lograr la
expresión de la información genética
en sistemas
heterólogos. Uno de los sistemas más utilizados
para expresar proteínas de genes clonados es el sistema de
Baculovirus. Este virus posee un promotor de expresión
fuerte, derivado del promotor de polihedrina, el cual se ha
insertado en plásmidos bacterianos para proveer un sistema
de clonación de genes eucarióticos que pueden
expresarse en células de insecto. Una de las ventajas de
este sistema es poder expresar
proteínas virales de otros organismos en un sistema
seguro como
son las células de insecto. En este trabajo se
construyó el vector recombinante pBlueBacRENV y se
expresó en células del insecto Mamestrae brassicae
(MB8003) una proteína recombinante del epítope B
(161-206 a.a.) de la gp46 de la superficie del HTLV-I. El
producto obtenido mostró reactividad inmunológica
con el suero de pacientes infectados con el HTLV-I. Los
resultados obtenidos demostraron que esta proteína
recombinante puede ser potencialmente útil para el
desarrollo de pruebas de
detección de anticuerpos específicos para el virus.
Además, se considera que esta proteína
podría ser utilizada como inmunoprotectora en un potencial
desarrollo de una vacuna efectiva que controle la
infección por el HTLV-I.
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