Construcción y expresión de una proteína recombinante de la envoltura del virus linfotrópico humano tipo I (HTLV-I) (página 2)

MATERIALES Y MÉTODOS

El ácido desoxirribonucleico (ADN) proviral se
extrajo de las células
MT4 provenientes de un paciente de Japón
con ATL. El procedimiento de
extracción se llevó a cabo siguiendo la metodología desarrollada por Soto-Ramírez et
al.6 con algunas modificaciones introducidas en el
laboratorio.
La pureza de las preparaciones de ADN se valoró
midiendo la absorbancia a 260 nm y 280 nm. Relaciones de
A260/A280 >1.8 se consideraron óptimas para
reacción en cadena de polimerasa (PCR).

PCR en la región env. Se realizó un
PCR anidado utilizando los oligonucleótidos cebadores que
aparecen en el Cuadro 1. Las condiciones de PCR para generar un
amplificado de 1440 bp del gen env completo con los
oligonucleótidos cebadores ENV1+ y ENV3- fueron las
siguientes: un paso de 3 minutos a 94°C, 35 ciclos de 1
minuto a 94°C, 30 segundos a 48°C, 45 segundos a
72°C, un ciclo de extensión de 10 minutos a 72°C.
Luego se efectuó otro PCR empleando los
oligonucleótidos cebadores ENV2+ y ENV4-, para ello se
emplearon las mismas condiciones del PCR anterior. El producto de
este segundo PCR fue un amplicón de 1440 bp que incluye
todo el gen env (5180 a 6619 bp). El fragmento de 1440 bp
fue sometido a un segundo PCR empleando el par de
oligonucleótidos cebadores RENV1+ y RENV2- (Cuadro 1).
Para este nuevo PCR las condiciones fueron: un paso de 3 minutos
a 94°C, 35 ciclos de 1 minuto a 94°C, 30 segundos a
45°C, 45 segundos a 72°C y un ciclo de extensión
de 10 minutos a 72°C. Después se realizó una
electroforesis en gel de agarosa 2% del fragmento obtenido cuyo
tamaño fue de 144 bp. Con el fin de recuperar los
amplificados se realizó la electroforesis en el gel de
agarosa de bajo punto de fusión y
se empleó el estuche QiaGen® de elución de
bandas siguiendo los procedimientos
recomendados por los fabricantes.

Cuadro 1 .
Oligonucleótidos cebadores empleados en la
obtención del gen env completo
y el segmento recombinante RENV

Experimentos de clonación. El fragmento de 144 bp fue
clonado en el sitio Hind III del vector pCR2.1. Este vector se
empleó como control de
clonación del amplificado que luego se insertó en
un vector de Baculovirus. La reacción de ligación
se realizó a partir de los amplificados obtenidos en la
elución de bandas y el vector pCR2.1 (Invitrogen®)
digerido con Hind III; luego se repitió el proceso con el
vector de Baculovirus pBlueBac4.5 (Figura 1). Este vector de
transfección de Baculovirus se utilizó para
reemplazar el gen de polihedrina tipo AcMNPV por un gen
heterólogo, en este caso el gen que codifica para el
fragmento de 144 bp de la gp46 de HTLV-I. Al vector recombinante
obtenido se le denominó pBlueBacRENV.

Figura 1.
Protocolo
empleado para la
clonación del fragmento recombinante de 144 bp
en un vector de expresión de Baculovirus pBlueBac
4.5

 Secuenciación de ácidos
nucleicos. Para la secuenciación del fragmento de 144 bp,
se utilizó el estuche "Big Dye Terminator" (QiaGen®),
siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. La
secuenciación se realizó mediante la
metodología de secuenciación cíclica
utilizando un secuenciador automático AbiPrism serie
3700.

Expresión de la proteína recombinante. La
expresión de la proteína recombinante se
logró por transfección del construido pBlueBac RENV
en células de insecto. Se empleó el protocolo de
transfección con fosfato cálcico7 que es
eficiente para la introducción de genes clonados en
plásmidos recombinantes. Se colectaron por
centrifugación células 3×106 de
Mamestrae brassicae (MB3008) (obtenidas de la Fundación In
Vitro) que se utilizaron para los experimentos de
transfección. Después, a partir de lisados
celulares, se purificó la proteína mediante
cromatografía de ultra filtración en
Sephadex G-50 hasta obtener una sola banda de Western
blot8.

ELISA de la proteína recombinante. Se depositaron
cantidades variables de
proteína recombinante (50 a 100 mg) en el fondo de los 96
pozos de una microplaca para ELISA; ésta se incubó
durante toda la noche a 4ºC. Posteriormente se
bloqueó con una solución de 5% de albúmina
bovina fracción V (BSA) diluida en solución fosfato
salina (PBS). A continuación se incubaron tanto sueros
como los anticuerpos monoclonales MET3 y LAT27 para la
proteína de la envoltura gp46 (donados por el Dr. Y.
Tanaka) con la proteína recombinante RENV y se
procedió a efectuar la prueba de ELISA9. Los
sueros de los individuos incluidos en el estudio diluidos 1:100 y
los anticuerpos monoclonales 1:500 se incubaron con la
proteína recombinante RENV durante toda la noche a
4°C. Después de tres lavados en PBS pH7.0 durante 5
minutos cada uno, se procedió a incubar a 37°C con el
anticuerpo secundario humano acoplado con
streptavidina-peroxidasa durante una hora. Después de este
proceso se lavó 3 veces durante 5 minutos en PBS pH7.0; la
reacción se reveló mediante adición de
biotina, diaminobencidina y peróxido de hidrógeno.

La densidad óptica
(DO) se calculó mediante un microlector Spectra II a una
longitud de onda de 450 nm. Para determinar el punto de corte de
la prueba Elisa se tomó el promedio de tres lecturas de
sueros negativos al cual se le adicionó 1.5 veces el valor
de la desviación estándar. Todas aquellas lecturas
que mostraron valores
mayores al punto de corte se consideraron como reactivas. Se
utilizaron un total de 75 sueros de personas infectadas con el
virus y 75
sueros de sujetos seronegativos tanto para el HTLV-I como para el
VIH-1.

Cálculos estadísticos. Las diferencias de
reactividad entre sueros negativos y positivos para el HTLV-I se
evaluaron mediante la aplicación de la prueba exacta de
Fisher.

RESULTADOS

Inicialmente se realizó la amplificación
con el par de primers ENV-1+ y ENV-3- y luego con el segundo par
de primers ENV-2+ y ENV-4-, lo cual ofreció mayor
especificidad en la amplificación (Figura 2A). Se obtuvo
el fragmento recombinante de 144bp a partir de PCR (Figura 2
B,C).

Figura 2.
A. Electroforesis en gel de agarosa al 2% del segmento de
envoltura total obtenido mediante PCR con los primers ENV-2+ y
ENV-4-. 1 Escalera 100bp 2 2.0mM MgCl2 3 2.5 mM MgCl.
B. Electroforesis en gel de agarosa al 2% del segmento
recombinante de envoltura obtenido mediante PCR con los primers
RENV-I-1+ y RENV-I-2-. 1 Escalera de 100bp 2 2.0 mM MgCl2 3 2.5
mM MgCl2 .
C. Electroforesis en gel de agarosa al 2% del segmento
recombinante de envoltura y la envoltura total obtenido mediante
PCR con los primers RENV-I-1+/ RENV-I-2- y ENV-2+ /ENV-4-
respectivamente. 1 Escalera de 100bp, 2, 3 y 4, los segmentos de
144bp a 1.5, 2.0 y 2.5 mM MgCl2 respectivamente 5 envoltura
total.  

La secuencia de nucleótidos del fragmento
amplificado y clonado (5625-5762 nt) fue: TTT TAC TCA AAA AGT TTC
ACG CCT CAA TAT TAA TCT CCA TTT TTC AAA ATG CGG TTT TCC CTT CTC
CCT TCT AGT CGA CGC TCC AGG ATA TGA CCC CAT CTG GTT CCT TAA TAC
CGA ACC CAG CCA ACT GCC TCC CAC CGC CCC. Esta secuencia
representó 100% del segmento del provirus MT4. Mediante el
protocolo empleado en la elución de bandas del fragmento
recombinante de 144bp, se logró obtener los amplificados
para su utilización en la ligación con el sistema de
Baculovirus pBlueBac4.5.

Mediante traducción simulada empleando el código
genético nuclear, se obtuvo la secuencia de
aminoácidos del dominio de la
superficie de envoltura gp46 recombinante clonada en el
bacmido:

161-FSLLVDAPGYDPIWFLN TEPSQLPP
TAPPLLPHSNLDHILE PSIPW-206

Para comprobar la reactividad de la proteína
recombinante obtenida, se realizaron ensayos de
Western blot con sueros referencia positivos y negativos para
HTLV-I. Se obtuvieron las proteínas
recombinantes de células de M. brassicae y de E. coli
cuyas reactividades inmunológicas fueron ensayadas con
anticuerpos monoclonales para la envoltura (LAT27 y MET3).
Inicialmente se observó una banda de inducción que reaccionó
específicamente con los monoclonales de la envoltura
(Figura 3).

Figura 3.
Western blot de la proteína recombinante de la envoltura
del HTLV-I expresada por cuatro clones de Bacmidos en
células de insecto Mamestrae brassicae.
Se empleó el anticuerpo monoclonal MET3 como control
positivo.

Varios clones recombinantes de M. brassicae se
utilizaron para determinar la reactividad del anticuerpo
monoclonal MET3, observándose una sola banda reactiva que
no se visualizó con los sueros de individuos seronegativos
(Figura 4 A, B).

Figura 4.
A. Ensayos de Western blot de la proteína recombinante en
pacientes portadores del virus.
B. En suero de individuos seronegativos. CN = control negativo.
CP = control positivo.

La proteína recombinante de aproximadamente 21
kDa obtenida del clon 1 de M. brassicae, mostró
reactividad cruzada con sueros de pacientes PET/HAM y
seropositivos asintomáticos para el HTLV-I pero no con los
controles negativos (Figura 5).

Figura 5.
Perfil de Western blot de sueros de individuos HLTV-I positivos
contra el segmento de la proteína recombinante de
envoltura de gp46 de HTLV-I del clon 1 de M. brassicae. 2-12
suero de individuos seropositivos para HTLV-I, 13-22 suero de
individuos seronegativos para HTLV-I, 1 y 24 Control positivo, 23
Control negativo.

La proteína recombinante RENV se utilizó
para definir mediante Western blot, la especificidad. Todos los
sueros (75/75) de los individuos seropositivos mostraron una
reacción cruzada con la proteína de 21 kDa
extraída de lisados de M. brassicae clon 1, en contraste
con aquellos de los sujetos seronegativos en los que no se
observó ninguna reactividad (Figura 6). Tanto la
especificidad como la sensibilidad de la prueba de ELISA para la
proteína RENV fueron del 100%. No se observaron ni falsos
negativos ni falsos positivos.

Figura 6. Western blot de la
proteína recombinante obtenida del clon 4 de M.
brassicae.
1 y 6 controles negativos, 2-5 sueros positivos.

DISCUSIÓN

El principal hallazgo de este estudio fue el desarrollo de
un procedimiento sencillo y altamente reproducible para la
obtención de una proteína viral inmunogénica
que pudiese ser utilizada como referencia en el diagnóstico de la infección por el
HTLV-I. Uno de los problemas que
se presenta en el diagnóstico de retrovirus humanos como
el HTLV-I, radica en la sensibilidad de la prueba. Para ello, se
emplean técnicas
como la PCR que amplifica un molde proviral inicial, determinando
el tipo de provirus HTLV-I10. Sin embargo, esta prueba
de laboratorio no podría llevarse al campo para realizar
estudios epidemiológicos en zonas distantes de la costa
pacífica colombiana y otras regiones donde se ha informado
una alta prevalencia de la infección por el virus. La
elaboración de estuches diagnósticos de gran
sensibilidad y especificidad, cumplen los requerimientos para
diagnósticos rápidos en estas zonas; por ello se
hace imprescindible la caracterización y producción de proteínas
recombinantes que cumplan estas necesidades. La proteína
recombinante de la gp46, producida en este trabajo,
cumplió con estos requisitos. Resultados previos obtenidos
en sistemas in
vitro6,11 han mostrado un aumento significativo de
reactividad de IgG y de IgA contra proteínas de envoltura
env y gag, en pacientes
PET/HAM12,13.

El desarrollo de vectores de
expresión que contienen secuencias de aminoácidos
en la región media de la gp46 como el pB-806 (166-229
a.a.) y el pB1-806 (166-201 a.a.)5, permitieron un
acercamiento en la elección de la secuencia de
aminoácidos que se deseaba producir, pues presentaron
niveles de reactividad significativos en sueros de pacientes
infectados con HTLV-I5,14. Estos resultados
demostraron que la región más inmunorreactiva de la
gp62 está localizada en la porción media C-terminal
de la gp46 (161- 209a.a.).

El sistema de Baculovirus ha sido empleado con mucho
éxito
en la expresión de proteínas de envoltura del
HTLV-I. En los trabajos de Arp et al.15 se
emplearon estos sistemas obteniendo suficiente proteína
acumulada en células de insecto. Los resultados del
presente artículo junto con los estudios de
inmunogenicidad de las proteínas de envoltura de HTLV-I,
en especial los epítopes B y B1, indican una gran factibilidad de
producir proteínas recombinantes mediante procesos
rápidos, seguros, de alto
rendimiento y confiables.

La región media de la gp46 contiene
epítopes altamente inmunogénicos. Se han comparado
las reactividades relativas de anticuerpos de varias regiones de
gp62 de HTLV-I usando proteínas recombinantes en ensayos
de Western blot y se ha encontrado que la porción media
C-terminal de gp46 es la región más
inmunogénica de la proteína5. En algunos
estudios se ha evaluado la reactividad de diferentes
proteínas recombinantes de gp46 y se han encontrado
datos
importantes en el caso del epítope B1. Los pacientes
PET/HAM poseen niveles altos de anticuerpos contra antígenos virales y una carga proviral alta
comparada con portadores asintomáticos y pacientes
ATL16.

Los ensayos de ELISA y Western blot realizados en este
trabajo empleando sueros de pacientes infectados con HTLV-I
mostraron reactividad contra la proteína recombinante
mientras RENV-21 kDa en contraste con los controles seronegativos
utilizados en los que no se determinó reactividad. Con
base en los resultados obtenidos en el presente trabajo, se
propone el uso de la proteína RENV para el
diagnóstico de la infección con HTLV-I.

AGRADECIMIENTOS

A las entidades financiadoras COLCIENCIAS, Fogarty
Institute, Universidad del
Valle y Universidad de Kagoshima.

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Paula Ordóñez, Quim.1,
Flavio Cerón2, Felipe García-Vallejo,
Ph.D.3
1. Química. Joven
investigadora de COLCIENCIAS. Laboratorio de Biología Molecular y
Patogénesis, Departamento de Ciencias
Fisiológicas, Facultad de Salud, Universidad del
Valle, Cali.
2. Estudiante de Biología. Laboratorio de Biología
Molecular y Patogénesis, Departamento de Ciencias
Fisiológicas, Facultad de Salud, Universidad del Valle,
Cali.
3. Profesor
Titular y Director Científico, Laboratorio de
Biología Molecular y Patogénesis, Departamento de
Ciencias Fisiológicas, Facultad de Salud, Universidad del
Valle, Cali.