Detección de anticuerpos contra el virus de la peste porcina clásica mediante la prueba inmunoenzimática (CIV-ELISA) y seroneutralización (página 2)

MATERIAL Y METODOS

En el presente estudio se analizaron mediante las
técnicas de ELISA y SN un total de 149
sueros provenientes de cerdos inoculados experimentalmente con el
virus de la
PPC y de muestras de hembras reproductoras de planteles
industriales.

1. OBTENCION DE LAS MUESTRAS SEROLOGICAS

1.1. Animales
experimentales. Para el estudio de la PPC experimental se
utilizaron 20 cerdos híbridos Landrace x Large White de 20
kg de peso vivo al inicio de la experiencia. Con ellos se
constituyeron 5 grupos de 4
cerdos cada uno, 4 grupos correspondientes a animales inoculados
experimentalmente sin vacunar, y el quinto grupo estuvo
formado por 4 animales vacunados e inoculados. Los animales
permanecieron en corrales, debidamente separados por grupos en
dependencias del Servicio
Agrícola y Ganadero (SAG).

1.1.1. Cerdos inoculados experimentalmente no vacunados.
Los 4 grupos de cerdos fueron inoculados experimentalmente con
una dosis de 100.000 DICT50 del aislado virulento
Quillota del virus PPC. La toma de muestras se realizó de
la siguiente manera:

– Grupo 1. Se recolectaron muestras a los 3 días
post-inoculación (dpi).
– Grupo 2. Se recolectaron muestras a los 3 y 6 dpi.
– Grupo 3. Se recolectaron muestras a los 3, 6 y 9 dpi.
– Grupo 4. Se recolectaron muestras a los 3, 6, 9, 12 y 14
dpi.

1.1.2. Cerdos vacunados e inoculados experimentalmente.
Este grupo estuvo constituido por 4 cerdos, los cuales fueron
vacunados con una dosis de vacuna comercial diluida 160 veces
(1/160). Luego de 14 días, los cerdos fueron inoculados de
la misma manera como el grupo anterior. De estos animales
también se recolectaron muestras a los 3, 6, 9, 12 y 14
dpi.

De todos los animales inoculados experimentalmente, se
llevó un registro de
temperatura
corporal por 28 días (desde el día de la
vacunación hasta el día del sacrificio del
último cerdo, 14 dpi).

1.2. Hembras reproductoras. Para ello se utilizaron 100
sueros provenientes de hembras reproductoras, aportados por el
SAG. Las muestras fueron obtenidas en planteles industriales
localizados en áreas de mayor riesgo
epidemiológico durante los brotes de la enfermedad el
año 1993.

En cada muestreo se
obtuvieron 10 ml de sangre por cerdo,
y se dejaron reposar hasta que la sangre coaguló.
Posteriormente los tubos fueron centrifugados y los sueros
almacenados en congelación (-20° C) hasta el momento
de su análisis.

2. DETERMINACION DE LOS ANTICUERPOS

La determinación de los anticuerpos se
realizó mediante la técnica de SN en el Laboratorio de
Virología del SAG, y la prueba de ELISA (CIV-ELISA
policlonal, Girona, España) en
el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina
Veterinaria de
la Universidad de
Concepción.

Para la interpretación de la prueba de ELISA se
consideraron como negativos los sueros con menos de un 40% de
inhibición, sospechosos entre 40 y 50% de
inhibición y positivos con más de un 50% de
inhibición.

3. ANALISIS DE RESULTADOS

La cinética de los anticuerpos séricos fue
graficada por una curva de regresión cuadrática (y
= a+bx+cx2), en que los dpi se grafican en el eje "X"
y el % de inhibición en el eje "Y". La comparación
entre el CIV-ELISA y la técnica de SN
incluyó:

– 39 de 40 muestras correspondientes a cerdos inoculados
experimentalmente no vacunados, ya que el volumen de suero
obtenido en un animal no permitió realizar ambas pruebas.
– 10 muestras correspondientes a cerdos vacunados e inoculados
experimentalmente. De las 20 muestras a las que se les
realizó ELISA, sólo a 10 de ellas se les
realizó SN.
– 100 muestras de hembras reproductoras.

En total la comparación incluyó 149
muestras analizadas con ambas técnicas; con los resultados
fue posible determinar sensibilidad, especificidad, falsos
positivos y falsos negativos.

Las fórmulas utilizadas fueron las siguientes
(Jenicek, 1987) :  

En que:
VP: Verdaderos positivos (positivos a SN y ELISA)
FP: Falsos positivos (positivos a ELISA y negativos a SN).
FN: Falsos negativos (negativos a ELISA y positivos a SN).
VN: Verdaderos negativos (negativos a SN y ELISA).

ANALISIS ESTADISTICO

Para determinar si ambas pruebas son similares, se
realizó un análisis estadístico utilizando
la prueba de McNemar.

RESULTADOS

Cerdos inoculados experimentalmente no vacunados. La
totalidad de los sueros analizados con el CIV-ELISA entre los 3 y
14 dpi resultaron negativos (% de inhibición <40). Los
resultados se presentan como porcentajes de inhibición en
la tabla 1, observándose valores de
24.25, 20.00, 28.27, 29.40 y 30.80 a los 3, 6, 9, 12 y 14
días post-inoculación, respectivamente.

La cinética de anticuerpos séricos entre
los 3 y 14 dpi se grafica de acuerdo a los promedios grupales en
la figura 1; en ella es posible observar que ninguna muestra
alcanzó positividad, presentándose la totalidad de
ellas bajo el umbral de 40% de inhibición hasta el momento
del último muestreo (14 dpi). Sin embargo, la tendencia de
la curva es ir en aumento, indicando claramente un incremento de
la cantidad de anticuerpos séricos.

Cerdos vacunados e inoculados experimentalmente. Los
resultados se presentan como porcentajes de inhibición en
la tabla 2, observándose valores de 22.70, 30.75, 45.70,
58.00 y 60.25 a los 3, 6, 9, 12 y 14 días
post-inoculación respectivamente.

La cinética de los anticuerpos séricos
desde los 3 a los 14 dpi se grafica en la figura 1; en ella se
observa un aumento progresivo en la concentración de
anticuerpos séricos, los que a los 9 dpi alcanzan el
umbral o área sospechosos y desde los 12 dpi son
considerados como positivos en ELI-SA con porcentajes de
inhibición mayores a 50%.

Grupo de muestras de hembras reproductoras provenientes
de planteles industriales. Los resultados del ELISA en este grupo
se presentan en la tabla 3; en ésta se observa que un alto
porcentaje de los sueros analizados fueron positivos (86.0%), un
5% correspondió a sueros dudosos y un 9.0% resultó
negativo.

Comparación de la técnica ELISA con la SN.
Los resultados de esta comparación se muestran en la tabla
4; de acuerdo a ellos, la sensibilidad del CIV-ELISA en
relación a la prueba de SN es de un 90.1% (82/91), la
especificidad relativa del ELISA es de un 76.4% (39/51), la
eficiencia
relativa del ELISA correspondió a un 64.0% (91/142), el
área sospechosa es de un 4.7% (7/149), los falsos
positivos son un 8.0% (12/149) y los falsos negativos
correspondieron a un 6.0% (9/149).

ANALISIS ESTADISTICO

Mediante la prueba de McNemar se determinó que no
existen diferencias estadísticamente significativas (p
> 0.05) entre los resultados obtenidos por SN y
CIV-ELISA.

Figura 1. Porcentajes de
inhibición obtenidos con la prueba CIV-ELISA en cerdos
inoculados y cerdos vacunados e inoculados experimentalmente.
Muestreo entre los 3 y 14 dpi.

Inhibition (%) obtained with CIV-ELISA in inoculated and
experimentally vaccinated-inoculated pigs. Samples were obtained
between 3 and 14 dpi.

DISCUSION

El diagnóstico serológico de la PPC en
nuestro país se ha realizado utilizando la prueba de SN;
sin embargo, en los últimos años muchos
países han incorporado técnicas que ofrecen mayor
facilidad, rapidez y economía, entre ellas
se encuentran las pruebas ELISA (Saunders, 1977; Wensvoort y
col., 1988; Schagemann y col., 1991; Koenen y col., 1992; Rosell
y col., 1994) que, aunque cumplen con las características
antes mencionadas, aún no son usadas para el
diagnóstico de la enfermedad en Chile.

En este ensayo se
utilizó un ELISA policlonal de competición que
detecta IgG producida en respuesta a la vacunación e
infección por virus PPC. Los resultados obtenidos mediante
este método
fueron comparados con la técnica de SN, que es la prueba
oficial en Chile para el diagnóstico serológico de
la PPC, junto con la IFD y cultivo celular en células
PK-15 (Quinteros, 1994).

En el grupo de cerdos inoculados experimentalmente (sin
vacunar) todos los animales fueron seronegativos a la prueba de
ELISA, producto
probablemente de una débil respuesta antigénica
inicial de los cerdos al virus en esta primera etapa. Al
respecto, Wensvoort y col. (1988) sólo detectaron
anticuerpos después de 21 dpi (41% de inhibición),
alcanzando un 65% de inhibicíón a los 28 dpi. Una
forma de diagnosticar la enfermedad más tempranamente la
constituye la utilización de un ELISA que detecta antígenos en la fase virémica de la
enfermedad, como ya ha sido utilizado recientemente por Depner y
col. (1995), quienes encontraron con este método animales
positivos a partir de los 9 dpi. En este mismo grupo sólo
un animal resultó positivo a la SN, presentando bajos
títulos de anticuerpos.

En el grupo de cerdos vacunados e inoculados se
observó un incremento de los anticuerpos séricos, a
diferencia del grupo anterior. Esto se debería a que las
muestras pertenecen a animales que recibieron un estímulo
antigénico previo (dosis vacunal diluida 1/160);
también cabe destacar que el monitoreo de anticuerpos
séricos es más extenso, desde los 18 a los 29
días post-vacunación. Estos resultados demuestran
que los anticuerpos detectados por el ELISA provienen
principalmente del estímulo vacunal, ya que ésta es
la única característica que diferencia a este grupo
de cerdos con el grupo anterior. Resultados similares a
éstos han sido obtenidos por Dahle y Liess (1996), quienes
detectaron respuesta de anticuerpos neutralizantes al virus
vaccinal después de la segunda semana
post-vacunación. Por otra parte, Wensvoort y col. (1988),
utilizando un CTB-ELISA monoclonal, detectaron animales
seropositivos a anticuerpos neutralizantes desde los 35
días post-vacunación. El CIV-ELISA utilizado en
esta investigación reconoce anticuer-pos desde
los 23 días post-vacunacion.

Por la técnica de SN nueve animales de este grupo
presentaron anticuerpos, de los cuales siete resultaron positivos
y dos sospechosos a la prueba de ELISA.

Moennig y col. (1990) realizaron un monitoreo
serológico durante 14 semanas utilizando un ELISA de
captura, logrando detectar anticuerpos tan temprano como la SN
(con títulos desde la tercera semana), que se mantuvieron
durante todo el período de muestreo. En el grupo de
hembras reproductoras provenientes de planteles industriales se
observó un alto porcentaje de sueros positivos al ELISA
(86%), debido a que pertenecen a planteles que vacunan
periódicamente. Por otra parte, aquellas muestras que no
presentaron una cantidad de anticuerpos suficientes para ser
detectadas por el ELlSA, pueden pertenecer a casos individuales
de vacunación poco exitosa o a cerdos con una respuesta
inmune deficiente, que en un futuro podrían provocar
riesgos
epidemiológicos.

Los resultados obtenidos en este grupo de muestras
indican que el CIV-ELISA es efectivo para detectar anticuerpos
vacunales o inducidos por infecciones; sin embargo, la prueba no
puede discriminar el origen de ellos debido a que detecta IgG. En
la actualidad no existen métodos
serológicos que permitan diferenciar entre los anticuerpos
de origen vaccinal y los producidos en la enfermedad natural
(Wensvoort y col., 1988). Con la prueba de SN se obtuvo un 87% de
sueros positivos a la PPC en este grupo.

Al comparar el CIV-ELISA con la SN se observa que la
sensibilidad y especificidad de este ensayo fue de un 90.1 y
76.4%, respectivamente, valores más bajos que los
observados por Yu y col. (1988), quienes compararon un ELISA
modificado (virus vacunal de la cepa China,
liofilizado) con la SN, obteniendo una sensibilidad y
especificidad de un 100 y 92.2%, respectivamente.

Sin embargo, la cinética de los anticuerpos
mostrada por Yu y col. (1988) fue similar a la que se obtuvo en
este estudio. Las muestras consideradas como falsos negativos
(muestras negativas a ELISA y positivas a SN) fueron de un 6.0%,
y los resultados falsos positivos (muestras positivas a ELISA y
negativas a SN) fueron de un 8.0%. Los resultados falsos
positivos podrían corresponder a sueros infectados con
virus DVB, ya que el ELISA policlonal no logra discriminar entre
estos pestivirus, situación que se podría aclarar
usando un ELISA monoclonal, el cual ya se está utilizando
en los países declarados libres de PPC (Edwards y col.,
1991; Terpstra, 1991; Wensvoort y col., 1988; Rosell y col.,
1994). También la SN puede discriminar entre PPC y DVB
utilizando diluciones iniciales elevadas de los sueros problemas,
descartando las infecciones por virus DVB; el título que
logran los anticuerpos dirigidos contra el virus de la PPC es muy
alto, a diferencia de aquel inducido por el virus DVB en cerdos
que es bajo (Rosell y col., 1994).

Los resultados obtenidos en este ensayo muestran que el
CIV-ELISA podría ser muy útil para detectar el
nivel de anticuerpos en grupos de cerdos representativos de los
diferentes planteles del país, e incorporarlos a los
programas de
erradicación de esta enfermedad, ya que la prueba de ELISA
es fácil de realizar en un gran número de muestras,
no presenta diferencias significativas para el diagnóstico
comparada con la SN y resulta más económica que
otras técnicas.

Debido a que no hay publicaciones referentes a la
utilización de ELISA para PPC en Chile, los resultados
obtenidos con el CIV-ELISA podrían servir para sentar las
bases de posteriores investigaciones
con ELISA monoclonales, que son específicos y más
sensibles y que es imperativo utilizarlas cuando un país
desea ser reconocido internacionalmente como libre de la PPC
según la CEE.

BIBLIOGRAFIA

ADRIAZOLA, S. 1994. Situación nacional de la
peste porcina clásica, pp. 29-37. En: Curso de
perfeccionamiento: Actualización en patología
porcina. Universidad de Concepción, Fac. Med. Vet.
Chillán, Chile.

DAHLE, J., B. LIESS. 1992. A review on classical swine
fever infections in pigs: epizootiology, clinical diseases and
pathology. Comp. Immun. Microbiol., Infect. Dis. 15 (3):
203-211.

DAHLE, J., B. LIESS. 1996. Assessment of safety and
protective value of a cell culture modified strain "C" vaccine of
hog cholera/classical swine fever virus. Vet. Bull. 66(3):
1492.

DEPNER, K., D.J. PATON, C. CRUCIERE, G.M. DE MIA, A.
MULLER, F. KOENEN, R. STARK, B. LIESS. 1995. Evaluation of the
enzyme-linked immunosorben assay for the rapid screening and
detection of classical swine fever virus antigens in the blood of
pigs. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 14(3):
677-689.

EDWARDS, S., V. MOENNIG, G. WENSVOORT. 1991. The
development of an international reference panel of monoclonal
antibodies for the differentiation of hog cholera virus from
other pestiviruses, Vet. Microbiol. 29:
101-108.

FENNER, F., P. BACHMANN, E.P. GIBBS, F. MURPHY, M.
STUDDERT, D. WHITE. 1992. Virología veterinaria.
(3ª ed.). Acribia, Zaragoza, España.

GOMEZ-TEJEDOR, C., M. VALENCIANO. 1994.
Epizootiología y patogenia de la peste porcina
clásica, Revista PORCI.
(22): 11-17.

HAVE, P. 1984. Detection of antibodies against swine
fever virus by enzime-linked immunosorbent assay (ELISA), Acta
Vet. Scand. 25(3): 463-465.

JENICEK, M.,  R. CLEROUX. 1987.
Epidemiología: principios,
técnicas y aplicaciones. Ediciones Científicas y
Técnicas, Barcelona, España.

JENSEN, M.H. 1981. Detection of antibodies against hog
cholera virus and bovine viral diarrheas virus in porcine serum.
A comparative examination using CF, PLA and NPLA assays, Acta
Vet. Scand. 22: 85-98.

KOENEN, F., A. CAY, J. LEFEBVRE, A. DESMET. 1992.
Evaluation of the complex trapping blocking-ELISA in a
serological survey during the Belgian classical swine fever
epizootic in 1990, Vet. Rec. 131(17): 396.

LEFORBAN, Y., P. HAVE, A. JESTIN, P. VANNIER. 1987.
Utilisation d’un test ELISA pour la mise en évidence
des anticorps Peste porcine classique dans les sérums de
porcs, Recl. Méd. Vét. 163: 667-677.

LEFORBAN, Y., S. EDWARDS, G. IBATA, P. VANNIER. 1990. A
blocking ELISA to differentiate hog cholera virus antibodies in
pigs sera from those due to other pestivirus, Ann. Rech.
Vét. 21: 119-129.

MOENNIG, V., G. SCHAGEMANN, J. DAHLE, I. GREISER-WILKE,
L. LEDER. 1990. A new approach for the diagnosis hog cholera,
Dtsch. Tierärztl. Wschr. 97: 91-93.

PEARSON, J.E. 1992. Hog cholera diagnostic techniques,
Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 15(3):
213-219.

QUINTEROS, G. 1994. Diagnóstico de la peste
porcina clásica. pp. 24-28. En: Curso de
perfeccionamiento: Actualización en patología
porcina. Universidad de Concepción, Fac. Med. Vet.
Chillán, Chile.

ROSELL, R., A. SAN GABRIEL, J. PUJOLS. 1994.
Diagnóstico y control de la
Peste Porcina Clásica, Revista Porci. (22):
57-71.

SAUNDERS, G. 1977. Development and evaluation of an
enzime-labeled test for the rapid detection of hog cholera
antibodies, Am. J. Vet. Res. 38(1): 21-25.

SCHAGEMANN, G., I. GREISER-WILKE, B. LIESS, V. MOENNIG.
1991. A sensitive enzime-linked immunosorbent assay (ELISA) for
the serological detection of antibodies against the virus of hog
cholera (HCV), Tierärztl. Prax. 19: 54-57.

TERPSTRA, C. 1991. Hog cholera: an update of present
knowledge, Br. Vet. J. 147: 397-406.

WENSVOORT, G., C. TERPSTRA, J. BOONSTRA, M. BLOEMRAAD,
D. VAN ZAANE. 1986. Production of monoclonal antibodies against
swine fever virus and their use in laboratory diagnosis, Vet.
Microbiol. 12: 101-108.

WENSVOORT, G., M. BLOEMRAAD, C. TERPSTRA. 1988. An
enzyme immunoassay employing monoclonal antibodies and detect
specifically antibodies to classical swine fever virus, Vet.
Microbiol. 17: 129-140.

WENSVOORT, G. 1989. Topographical and functional mapping
of epitopes on hog cholera virus with monoclonal antibodies,
J. Gen. Virol. 70: 2865-2876.

YU, L., J.H. LIU, M.F. SHAO, X.M. LI, X.M. ZHANG. 1988.
An enzime-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of
antibodies against swine fever virus using horseradish
peroxidaseprotein A as conjugate, Dtsch. Tierärztl.
Wschr. 95: 106-107.

A. ISLAS1, M.V. M.Sc.; G.
QUINTEROS3, M.V.; M. FLORES2,
M.V.; M. QUEZADA2, M.V. Dr. Vet.; N.
DIAZ3, M.V.; M. SIERRA4,
M.V., Dr. Vet.
1. Depto. de Ciencias
Clínicas, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de
Concepción, Avda. Vicente Méndez 595,
Chillán, Chile.
2. Depto. de Patología Animal, Facultad de
Medicina Veterinaria, Universidad de Concepción, Avda.
Vicente Méndez 595, Chillán, Chile.
3. Depto. de Laboratorios, Servicio Agrícola y
Ganadero (SAG), Av. Sucre 2397, Santiago, Chile.
4. Depto. Anatomía y
Anatomía Patológica Comparadas, Facultad de
Veterinaria, Universidad de Córdoba, Avda. Medina Azahara
7, 14071 Córdoba, España.