Cuadro 1.
Clasificación y detalles de las edades medias y resultados en la competición de los equinos utilizados.
Classification mean age and performance record of horses in the study.

Los valores son medias ± desviaciones tìpicas: n, número de animales.Entre paréntesis se indica el número de carreras computadas en cada categoría. H, M, hembras y machos, respectivamente. *No hubo hembras en esta categoría.

Para los análisis histoquímicos, los trozos de tejido muscular, de 75 a 100 mg de peso, fueron montados en corchos usando OCT embedding medium (Tissue-Tek II, Miles Laboratories, Naperville, IL, USA) y orientados para obtener cortes transversales de las fibras musculares. Estas muestras fueron congeladas por inmersión en isopentano (durante 30 segundos), y almacenadas a temperatura de su punto de congelación con nitrógeno líquido hasta su procesamiento histoquímico.

Métodos histoquímico-enzimáticos. De cada muestra se obtuvieron cortes seriados de 10 µm de grosor en un criostato a ?20° C que fueron incubados para demostrar su actividad adenosín trifosfatasa miofibrilar activada por calcio (mATPasa, Enzyme Commission, E.C., 3.6.1.3) a pH 9.4 después de tres preincubaciones a pH 10.3, 4.5 y 4.2. Para evaluar la capacidad oxidativa de los tipos de fibras se utilizó la técnica de NADH-tetrazolium reductasa (NADH-TR, E.C., 1.6.99.3). Para estimar cualitativamente el potencial glucolítico de las miofibras se empleó a-glicerofosfato deshidrogenasa unido a menadione (GPD, E. C., 1.1.99.5). Todos los métodos histoquímicos usados fueron los descritos por Dubowitz (1985).

Las fibras musculares fueron clasificadas como tipo I (contracción lenta) y tipos IIA, IIB y IIC (contracción rápida) de acuerdo a lo propuesto por Dubowitz (1985) según el patrón de tinción con la técnica de mATPasa. Las fibras intermedias tipo IIAB (White y Snow, 1985) fueron redistribuidas por partes iguales dentro de las poblaciones fibrilares IIA y IIB (Fry y col., 1994). Además, las fibras tipo IIC estuvieron ausentes o fueron muy escasas (<1-2%) y se incluyeron en el grupo de fibras tipo IIB (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985). Las fibras tipo IIB fueron nuevamente subdivididas en dos subgrupos según la intensidad de reacción con la técnica de NADH-TR: IIB oxidativas y IIB no oxidativas (López-Rivero y col., 1991). Se clasificaron como fibras con baja capacidad oxidativa las fibras no coloreadas en su parte periférica y con un color blanco-azulado uniforme en el centro.

De los cortes seriados teñidos por mATPasa tras preincubación a pH 4.5 y NADH-TR se obtuvieron fotomicrografías (x 200 aumentos) usando un microscopio óptico Leitz Wetzlar Dialux 20EB. Para obtener los datos del porcentaje fibrilar se examinó un área representativa de cada biopsia (rango 250000-500000 µm²). Las frecuencias relativas de las fibras tipos I, IIA y IIB y de los subtipos IIB oxidativas y IIB no oxidativas fueron calculadas sobre las fotomicrografías mediante el cómputo de un promedio de 400 fibras/biopsia.

Análisis estadístico. La variabilidad de la frecuencia relativa de los tipos de fibras fue expresada por la desviación típica. Los componentes de la varianza total de los porcentajes fibrilares, para cada caballo, fueron evaluados a cada profundidad por un análisis múltiple de varianza de tres factores (MANOVA) según el siguiente modelo (SAS Institute 1982):

Y_ijkl = µ + E_i + S_j + CR_k + CI + Error_l(ijk)

donde los factores fueron edad (E), sexo (S) y categoría de rendimiento (CR) y donde µ es la media poblacional del porcentaje un tipo de fibra en cada muestra biópsica. Debido a la influencia de la raza Arabe en todos los caballos de este estudio, la varianza ligada a la raza fue incluida en el coeficiente de error aleatorio (Error_l(ijk)). Los efectos de los factores examinados fueron considerados significativos con una probabilidad p<0.05. Las variaciones de las características musculares entre categorías de rendimiento fueron analizadas mediante un análisis de covarianza (ANCOVA) para corregir la influencia que la profundidad de la muestra ejerce sobre los porcentajes fibrilares. Para cada categoría de rendimiento se calcularon las ecuaciones de regresión lineal de los porcentajes fibrilares, frente a la profundidad de muestreo.

RESULTADOS

La influencia de la edad y el sexo en la proporción de los distintos tipos de fibras no fue significativa (p>0.05). Por ello, los resultados globales son presentados por categorías de rendimiento, sin considerar las edades ni el sexo.

La categoría de rendimiento influyó significa-tivamente (p<0.05, MANOVA de 3 factores) sobre los porcentajes fibrilares. Los porcentajes de los tipos de fibras fueron marcadamente distintos en ambos grupos de animales (cuadro 2). A una profundidad determinada del músculo, el Grupo CRE presentó mayor porcentaje de fibras tipo I y menor proporción de fibras tipo IIB, particularmente del subtipo IIB no oxidativas, que el Grupo CRM. Las fibras IIA fueron más numerosas en el Grupo CRE, pero esta diferencia fue significativa sólo a 40 mm de profundidad (p<0.05).

El ANCOVA aplicado al material en conjunto permitió diferenciar los efectos de la profundidad de la muestra y la categoría de rendimiento (cuadro 3). Los valores F asociados a la varianza provocada por la profundidad de la toma de muestras fueron mayores que los relacionados con el efecto de la categoría de rendimiento, especialmente para los porcentajes de fibras tipo I, IIB y IIB oxidativas.

En ambos grupos los porcentajes de todos los tipos de fibras cambiaron significativamente en función de la profundidad de muestreo, pero la tasa de cambio no fue idéntica (cuadro 4). Así, entre las profundidades a 20 mm y 60 mm, la proporción de fibras tipo I aumentó un 135% en el Grupo CRE y el 100% en el Grupo CRM (p<0.01 entre las pendientes de sus rectas de regresión), mientras que las fibras tipo IIB y IIB oxidativas disminuyeron el 95% y 93%, respectivamente, en el Grupo CRE y el 57% y 40%, respectivamente, en el Grupo CRM (p<0.05).

DISCUSION

Las principales observaciones del presente estudio indicaron que las fibras tipo I y IIA fueron más abundantes en los equinos del Grupo CRE que en los del Grupo CRM; las fibras tipo IIB, incluyendo los subtipos IIB oxidativas y IIB no oxidativas, mostraron el patrón opuesto. Además, la tasa de cambio con la profundidad del porcentaje de las miofibras fue generalmente mayor en el Grupo CRE que en el Grupo CRM, especialmente para las fibras tipo I. En general, estos resultados coinciden con los de Snow y col. (1981) y Hodgson y col. (1983), pero difieren de los obtenidos por Essén-Gustavsson y col. (1984), quienes no observaron diferencias significativas entre caballos con diferentes resultados en la competición. Estos tres estudios estuvieron basados en el examen de una sola biopsia del músculo Gluteus medius, mientras que nuestro estudio proporciona mayor información sobre la proporción de los distintos tipos de fibras en muestras tomadas a distintas profundidades de dicho músculo.

Cuadro 2:
Porcentajes de los diferentes tipos histoquímicos de fibras.
Percentage of various histochemical fibre types.

Los valores son medias ± desviaciones típicas; número de animales; NS, no significativo.

Cuadro 3.

Valores F de un análisis de covarianza sobre el material global indicando la variación
en la composición fibrilar atribuible a la distinta categoría de rendimiento y a la profundidad.
F values covariance analysis in muscle fibre type composition of different horse categories
at different sampling depths.

Cuadro 4.
Ecuaciones de regresión lineal simple para los porcentajes fibrilares vs. profundidad de muestreo
en las dos categorías de rendimiento.
Simple linear regression equation for muscle fibre type composition vs. sampling depth
in both performance categories.

Valores expresados como±error típoco de la media. Significación de los valores t del coeficiente de regresión: *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. La letra "a" indica que los coeficientes de regresión son distintos (p<0.05) entre categorías de rendimiento.

En el presente estudio no se encontraron diferencias significativas entre sexos en la proporción de los tipos de fibras. Este hecho coincide con los resultados obtenidos en equinos fina sangre de carreras (Ronéus y col., 1991) y trotadores (Ronéus, 1993). Así, y aunque en nuestro estudio no hay equilibrio entre el número de machos y hembras incluidos en cada categoría (cuadro 1), este factor no debe haber influido significa-tivamente sobre los resultados. En equinos, durante el desarrollo postnatal y la maduración, la proporción de fibras de contracción lenta respecto a la de fibras rápidas es dinámica (y plástica) independientemente del efecto del entrenamiento, lo que parece estar relacionado con la necesidad de hacer frente a mayores demandas posturales y propulsivas (Rivero y col., 1993a). La mayoría de estudios longitudinales sobre el entrenamiento en equinos no han descrito una interconversión entre fibras de tipo I y II (Lindholm y Piehl, 1974; Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; Hodgson y col., 1986; Hodgson y Rose, 1987; Essén-Gustavsson y col., 1989; Gottlieb y col., 1989; López-Rivero y col., 1991). Por el contrario, un incremento significativo (p<0.05) del porcentaje de fibras de tipo I con el entrenamiento sí fue descrito en otros casos (Henckel, 1983; Ronéus y col., 1987; Rivero y col., 1995).

En el presente estudio las diferencias en las características musculares observadas entre equinos jóvenes y adultos no fueron significativas. Aunque no se cuantificó, los equinos adultos habían sido entrenados durante un período de tiempo más prolongado que los jóvenes. Esto sugiere la posibilidad de que el entrenamiento no haya sido el principal causante de la alta proporción de fibras de tipo I observada en los equinos con excelente rendimiento y, por tanto, esta característica muscular puede ser más bien el resultado de la selección genética que del entrenamiento.

Klitgaard y col. (1990a, b), usando técnicas de electroforesis de las cadenas pesadas de miosina en fibras musculares individuales combinado con el método histoquímico de mATPasa, demostraron que este procedimiento histoquímico puede no ser adecuado para detectar modificaciones sutiles en la composición de las cadenas pesadas de miosina en el músculo de atletas humanos. Estos investigadores encontraron en atletas, que habían seguido un entrenamiento de resistencia, que el 95% de las fibras con coexpresión de cadenas pesadas tipo I y IIA contienen mayor proporción de cadenas pesadas tipo I y, por tanto, reaccionan histoquímicamente como tipo I. Se podría esperar que el entrenamiento de resistencia produzca una transformación gradual en el contenido de cadenas pesadas de las fibras desde tipo IIA a tipo I, el cual no sería detectado por la técnica histoquímica de mATPasa.

El mayor valor del ratio de fibras tipo IIA/IIB y el menor porcentaje de fibras tipo IIB no oxidativas encontrado en los equinos del Grupo CRE puede ser una consecuencia del entrenamiento, ya que con un entrenamiento suficiente los subtipos de fibras de contracción rápida (tipo II) pueden cambiar sus propiedades contráctiles y aumentar su capacidad oxidativa (Essén-Gustavsson y Lindholm, 1985; Hodgson y col., 1986; López-Rivero y col., 1991). Las fibras IIB oxidativas pueden considerarse homólogas a las fibras tipo IIAB (White y Snow, 1985; Rivero y col., 1996a, b) y ser un estado transitorio en la conversión IIB no oxidativas<—>IIA (López-Rivero y col., 1991). El tamaño y abastecimiento capilar de estas fibras es intermedio entre el de las fibras IIB no oxidativas y IIA (Rivero y col., 1995, presentes resultados). Se podría esperar que su potencial oxidativo también debería ser intermedio.

Las mayores tasas de cambio con la profundidad de la proporción de todos los tipos de fibras, particularmente de los tipos I y IIB, en los caballos del Grupo CRE respecto al Grupo CRM pueden ser debidas a los distintos patrones de uso del músculo Gluteus medius equino durante la postura y el movimiento. Las regiones profundas del músculo, con una mayor proporción de fibras de tipo I, con un metabolismo predominantemente aeróbico, están mejor dotadas para el mantenimiento postural y actividades de baja intensidad y larga duración. Por el contrario, la mayor proporción de fibras IIB (especialmente no oxidativas) indica un patrón funcional distinto, al intervenir en la generación de fuerza propulsiva, rápida y de corta duración (López-Rivero y col., 1992). Es, por tanto, coherente el que las diferencias en los porcentajes de las fibras musculares entre caballos con distintas capacidades de resistencia fueran más pronunciadas en la parte profunda que en la región superficial del músculo. Esto también es avalado por el incremento significativo de la proporción de fibras tipo IIA a mayor profundidad en caballos sometidos a un entrenamiento de resistencia (presente estudio) pero no en caballos sedentarios (López-Rivero y col., 1992).

Aunque este y otros estudios previos en equinos de resistencia (Hodgson y col., 1983; Snow y col., 1981) han descrito una correlación significativa entre las características miofibrilares y el rendimiento deportivo, se ha manifestado que la proporción de los tipos de fibras determinada a partir de una pequeña muestra no es un indicador fiable de la capacidad atlética (Hodgson y col., 1983). Una explicación para esta valoración es que una sola biopsia no representa adecuadamente la totalidad del músculo como consecuencia de la gran variabilidad en las propiedades fibrilares (López-Rivero y col., 1992). Sin embargo, Lexell y col. (1985) concluyeron que se puede minimizar la varianza de este procedimiento de muestreo obteniendo varias biopsias a diferentes profundidades del músculo. Para el músculo Gluteus medius equino sugerimos examinar tres muestras biópsicas tomadas a profundidades de 20, 40 y 60 mm (regiones superficial, media y profunda, respectivamente), lo que permite conocer el perfil del músculo mediante el estudio de la regresión con la profundidad de los distintos parámetros musculares.

Los resultados del presente estudio demuestran la existencia de diferencias significativas en el perfil histoquímico del músculo Gluteus medius entre equinos con distinto historial en carreras de larga distancia. Los mejores equinos de resistencia tuvieron mayor proporción de las fibras tipo I y IIA, y menor porcentaje de fibras tipo IIB en el músculo que los individuos con resultados moderados en la competición. Las diferencias en la distribución de los tipos de fibras fueron más pronunciadas en la región profunda del músculo y probablemente obedecen a sus diferentes demandas funcionales. Dado que existe una buena correlación entre la distribución de los tipos de fibras en el músculo Gluteus medius y la aptitud atlética individual de caballos de resistencia, los presentes resultados indican la posibilidad de obtener un índice basado en el análisis de múltiples biopsias que permita estimar con fiabilidad las limitaciones atléticas de un determinado caballo.

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J.L. LOPEZ-RIVERO¹, M.V., Ph.D.; A. SERRANO¹, M.V., Ph.D.
¹Grupo de Biología Muscular, Universidad de Córdoba, Facultad de Veterinaria, Departamento de Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas, Avda. Medina Azahara 9, 14005 Córdoba, España.
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