Detección de bovinos portadores e inmunotolerantes al virus de la diarrea viral bovina en predios lecheros de la Región Metropolitana de Chile (página 2)

MATERIAL Y METODOS

La viremia persistente se
pesquisó a través del aislamiento viral (AV) desde 2 muestras de sangre
tomadas, desde un mismo animal, con tres meses de separación. La cuantificación
de anticuerpos se efectuó por prueba de seroneutra-lización (SN) en muestras de
suero tomadas en los mismos tiempos en que se tomó la muestra para AV.

Muestras. Se seleccionaron 238 bovinos
pertenecientes a 34 rebaños productores de leche de diferentes predios de la
Región Metropolitana, con antecedentes que hacían sospechar de la presencia de
animales PIT al VDVB en el predio. De los animales seleccionados 124 correspondían
a vacas con antecedentes, ya sea de abortos, muertes perinatales, nacimiento de
crías malformadas y/o débiles, bajos niveles de producción, "síndrome de
vaca repetidora" o hijos de vacas con estos antecedentes; 74 no tenían
antecedentes de signología clínica y en 40 animales se desconocían sus
antecedentes.

De cada animal se tomó una
muestra de sangre que se recibió en dos tubos de extracción (con y sin
anticoagulante), de donde se extrajeron plasma, linfocitos y suero. En una
segunda etapa, tres meses después, se sangró a todos los animales que
resultaron virémicos en el primer muestreo.

Procesamiento de las
muestras. El plasma
y la capa flogística se extrajeron partir de la muestra de sangre obtenida con
anticoagulante (heparina), por centrifugación a 1.000 x g. Las células de la
capa flogística se suspendieron en 1 ml de solución "buffer" fosfato
0.01 M, pH 7.2, se depositaron sobre una columna de 4 cm de Ficoll-Hypaque
(densidad 1.074) y se centrifu-garon a 1.500 x g por 30 minutos, lográndose
establecer una gradiente que permitió separar a los linfocitos, los que se
lavaron por tres veces en PBS y se suspendieron en 0.5 ml de medio de cultivo
mínimo esencial (MEM), adicionado de 10% de suero fetal bovino (SFB) y 10% de
glicerina. Las muestras de linfocitos y de plasma se conservaron a-70° C hasta
el momento de ser inoculadas en cultivos celulares.

De la muestra de sangre
obtenida sin anti-coagulante se extrajo el suero, el que se inactivó por
calentamiento a 56° C por 30 minutos y se conservó a -20° C.

Aislamiento viral e
identificación de los aislados. Para el AV se emplearon cultivos primarios de testículo de
bovino, en su cuarto pasaje, probados de estar libres de contaminación por
prueba de inmunoperoxidasa indirecta (IPI) (IPEX-BVDV, Central Veterinary
Laboratory, Weybridge). De cada muestra se tomaron 300 ul de plasma, los que se
inocularon sobre una monocapa de 400.000 células a 24 horas de ser sembradas y
cultivadas en MEM, adicionados de un 10% de SFB, 100 ug de estreptomicina y 100
UI de penicilina. Después de un período de adsorción de 90 minutos a 25° C, se
eliminó el inóculo, se lavó la monocapa con solución salina A de Puck (Puck y
col., 1961) y se adicionaron 300 ul de la suspensión de linfocitos, incubándose
por 20 horas a 37° C; posteriormente se adicionó MEM con antibióticos, sin SFB,
y se mantuvo a 37° C por 96 horas, haciéndose observaciones diarias de la
monocapa celular. Al final de este período los cultivos celulares se congelaron
y descongelaron por tres veces consecutivas a modo de lisar las células y
liberar el posible virus multiplicado y de ubicación intracitoplasmática.

Para evidenciar la
presencia del supuesto aislado se aplicó la prueba de IPI sobre las células
infectadas; para ello, los lisados obtenidos del primer pasaje, en cultivos
celulares, se inocularon sobre monocapas de células dispuestas en microplacas
de 96 pocillos, inoculándose 6 pocillos por cada muestra con un volumen de 50
ul por pocillo. Después de un período de adsorción de 90 minutos a 25° C, se adicionó
MEM con antibióticos, sin SFB, y se incubó por 48 horas a 37° C; al final de
este período se eliminó el medio de cultivo, se lavó la monocapa con PBS 0.01 M
pH 7.6 y las células se fijaron con acetona al 10% en PBS 0.01 M pH 7.6 por 5
minutos, para aplicar sobre éstas la prueba de IPI. En cada microplaca se
infectaron células con VDVB y se dejaron células sin infectar a modo de control
positivo y negativo, respectivamente.

La prueba de IPI consistió
en detectar la presencia de antígenos virales de ubicación intracitoplasmática,
a través del empleo de una mezcla de 4 anticuerpos monoclonales, elaborados en
ratón, dirigidos contra la proteína mayoritaria del virión (gp 53). Después de
sucesivos lavados y de la adición de un conjugado de conejo anti-ratón unido a
peroxidasa de rábano picante, que actuó sobre el sustrato diaminobencidina, se
observaron manchas de color marrón de ubicación intracitoplasmática en las
células infectadas con el VDVB y con los aislados, identificándose a éstos como
muestras positivas al VDVB y por consiguiente al animal virémico.

Identificación y
cuantificación de anticuerpos. Para cada animal virémico se identificó y cuantificó la
presencia de anticuerpos seroneutrali-zantes, para lo cual diluciones del
suero, desde 1:2 hasta 1:128, en volúmenes de 50 ul se enfrentaron a iguales
volúmenes de una suspensión viral citopatogénica, cepa Singer, conteniendo 200
dosis infectante cultivo de tejido 50% (DICT50). Después de incubar 90 minutos
a 25° C, a cada pocillo de la microplaca (donde se efectuó la mezcla suero
virus), se adicionó un volumen de 100 ul de una suspensión celular con una
concentración de 300.000 células por ml adicionada de un 20% de SFB y
antibióticos. Paralelamente se controló la viabilidad y proliferación celular, la
citotoxicidad del suero, el título del virus y las DICT50. La microplaca se
incubó a 37° C por un período de 5 días haciéndose observaciones microscópicas
diarias. El título del suero se expresó como el valor recíproco de la dilución
de suero que es capaz de neutralizar el efecto citopático producido por 100
DICT50 de virus.

A los animales que
resultaron virémicos en un primer muestreo se les tomó una segunda muestra de
sangre tres meses después y se procedió de igual forma que en el primer
muestreo. Se consideró animal PIT al que en las dos muestras de sangre se le
detectó la presencia de virus y los anticuerpos para el VDVB se mantuvieron con
títulos <8.

RESULTADOS

De los 34 predios
muestreados, en 22 se detectaron bovinos PIT, lo que corresponde a una
prevalencia predial de un 65%. De los 238 bovinos seleccionados en 97 se pudo
pesquisar el VDVB en un primer muestreo, lo que corresponde a un 41% de
positividad. Todos los sueros de estos animales presentaron títulos de
anticuerpos neutralizantes menores que 8. En el segundo muestreo sólo se pudo
ubicar a 59 animales, de los 97 virémicos al primer muestreo. La diferencia fue
producto de muerte natural, sacrificio, venta o traslado de animales.

Con las 59 muestras
recuperadas en el segundo muestreo, en que 42 resultaron positivas al
aislamiento viral y con títulos de anticuerpos seroneutralizantes menores que
8, se pudo establecer que existe un 18% de PIT al VDVB en predios sospechosos
de poseer animales en esta condición en la Región Metropolitana (cuadro 1).

En base a los antecedentes
clínicos, recopilados en el momento de tomar la primera muestra, se pudo
observar que de los 124 animales con antecedentes de signos clínicos, 36 (29%)
resultaron positivos al aislamiento viral y 88 (71%) resultaron negativos; de
los 74 animales con antecedentes de no mostrar signos clínicos de enfermedad 49
(66%) resultaron positivos al aislamiento y 25 (34%) negativos; y de los 40
animales en que se desconocían sus antecedentes clínicos, 12 (30%) resultaron
positivos al aislamiento viral y 28 (70%) fueron negativos (cuadro 2).

Cuadro 1.
Prevalencias predial e intrapredial de vacas portadoras e inmunotolerantes al
virus
de la diarrea viral bovina en predios lecheros de la Región Metropolitana de
Chile.
Prevalence of persistently infected cows with bovine viral diarrhea virus in
dairy herds in the
Region Metropolitana of Chile.

Referente a los resultados
obtenidos en el segundo muestreo, en que se sangraron 59 animales que fueron
virémicos al primer muestreo, en el grupo en que se tenían antecedentes
clínicos de enfermedad, 12 de 22 resultaron positivos al aislamiento viral; en
el grupo con antecedentes de no mostrar signos clínicos de enfermedad, 27 de 33
resultaron positivos al aislamiento viral; y en el grupo en que se desconocían
sus antecedentes clínicos 3 de 4 animales resultaron positivos al aislamiento
viral (cuadro 2).

Con respecto al signo
clínico, en el grupo de animales con antecedentes, el aborto fue el que
presentó mayor frecuencia (60 de 124 en el primer muestreo, con un 35% de
positividad y 9 de 12 en el segundo muestreo con un 60% de positividad).

No obstante lo anterior, la
mayor cantidad de bovinos con infección persistente se registró en los animales
con antecedentes de no mostrar signos clínicos asociados a la enfermedad,
encontrándose diferencias significativas con los que registraban algún signo
clínico (p < 0.05) (cuadro 2).

Según la distribución de
los animales por sus edades, la mayor frecuencia de muestras se obtuvo de
animales de 3 a 8 años, observándose en este rango la mayor positividad, en el
primer y segundo muestreo. Al comparar las edades promedios de los bovinos PIT
con los no PIT no se observaron diferencias significativas (p > 0.05)
(cuadro 3).

DISCUSION

En este estudio se adoptó
el procedimiento de AV y cuantificación de anticuerpos por SN para identificar
PIT al VDVB, ya que está descrito como el método más adecuado y confiable
(Bezek y Mechor, 1992). Otro procedimiento consiste en evaluar la respuesta de
anticuerpos frente a una vacunación con el VDVB, pero esta medición es poco
confiable dado que algunos animales PIT responden adecuadamente a la vacunación
y algunos animales inmunocompetentes pueden no responder (Bolin, 1988). No
obstante, Harnel y col. (1995) cuestionan la prueba de AV como método de
diagnóstico para la detección del VDVB, por la posibilidad de que el SFB y/o
las células empleadas estén contaminados con el VDVB. En este trabajo esta
situación fue superada, puesto que los cultivos celulares empleados fueron
controlados repetidamente, a la vez que se empleó un SFB comercial certificado
como libre de VDVB y probado de estar en tal condición.

La alta frecuencia de AV
podría explicarse por el método empleado, dado que de la muestra en estudio se
intentó pesquisar el virus que se encontraba libre en el plasma, así como el
asociado a linfocitos, se estima que sólo el 4.4% de los leucocitos sanguíneos
están infectados con virus (Bolin y col., 1987); una vez efectuado un primer
pasaje del supuesto aislado, las células se lisaron para rescatar el virus de
ubicación intracelular; se mantuvieron largos períodos de incubación entre
células (linfocitos con el cultivo celular) a modo de facilitar el contacto
entre ellas; y se usó SFB desprovisto de anticuerpos para el VDVB en el proceso
de crecimiento y mantención de los cultivos celulares.

Cuadro 2.
Aislamiento de
virus diarrea viral bovina (VDVB) de vacas lecheras de la Región Metropolitana,

en dos muestreos según antecedentes de signos clínicos.
Isolation of the bovine viral diarrhoea virus from dairy cows of Region
Metropolitana, Chile

Cuadro 3.
Aislamiento del
virus diarrea viral bovina (VDVB) de vacas lecheras de la Región Metropolitana
en dos muestreos según edad.
Isolation of the bovine viral diarrhoea virus from dairy cows of Region
Metropolitana, Chile, according to age.

En este estudio se pesquisó
una prevalencia de PIT animal de 18% y predial de 65%, valor que puede estar
subestimado, por cuanto 38 de 97 animales virémicos en un primer muestreo no
pudieron ser diagnosticados en una segunda oportunidad. Este valor parece elevado,
ya que si bien en la literatura no son frecuentes las mediciones de prevalencia
de PIT, se registran datos de un 1% en Dinamarca (Meyling y col., 1990), de un
1% a 5% de animales de algunos rebaños de Australia (Littlejohns y Horner,
1990), de un 9% (6/66) de rebaños con un 1.7% (54/3.157) de animales en Estados
Unidos de Norteamérica (Baker, 1987). Datos registrados de toros de un centro
de inseminación artificial del Reino Unido entregan valores de 0.78% (Howard y
col., 1990) y Waxweiler y col. (1992) en un estudio de 5 años en un centro de
selección de toros en Bélgica no detectaron más de un 1% de PIT. No obstante
estas bajas prevalencias detectadas, Bolin y col. (1985) y Taylor y col. (1994)
describen valores tan altos como de un 27 y 28%, respectivamente, en rebaños
individuales.

La alta prevalencia de PIT
detectada en este estudio podría explicarse por el hecho de que el 76% de las
muestras fueron tomadas de 28 predios de pequeños productores de una comuna de
la Región Metropolitana, en que no se disponía de asistencia médico
veterinaria, con malas condiciones sanitarias, gran intercambio de animales
entre predios, uso de monta natural con un mismo toro en diferentes predios, y
además en estos predios la mayor parte del muestreo estuvo orientada a bovinos
que hacían sospechar de la condición de ser PIT. Por el contrario, las muestras
tomadas desde 6 predios con asistencia médico veterinaria y con mejores
condiciones de manejo no evidenciaron la presencia de animales PIT. Esta
situación, sumada a los datos de preva-lencias antes mencionadas, hace suponer
que la frecuencia de PIT en un rebaño está fuertemente influenciada por las
condiciones de manejo, puesto que el surgimiento de PIT está determinado por la
frecuencia con la cual las hembras son infectadas al principio de la preñez.
Cabe destacar que en los predios en que no se detectó la presencia de animales
virémicos, no se investigó la existencia de anticuerpos para el VDVB, lo que
impide argumentar si la no detección de PIT se debió al azar o a predios libres
de VDVB.

El hecho de haber detectado
una mayor frecuencia de animales PIT en el grupo sin antecedentes de haber
mostrado signología que hiciera sospechar de tal condición, con respecto al
grupo de animales con antecedentes, puede ser cuestionada puesto que el 100% de
los PIT se obtuvieron de los predios sin asistencia médico veterinaria, donde
no se disponía de fichas clínicas y sólo se obtuvieron antecedentes aportados
por la observación y memoria de los dueños de los animales. No obstante, la
literatura señala que los animales PIT en un rebaño no necesariamente
manifiestan algún signo que los haga sospechosos (Bolin, 1990; Brownlie, 1990;
Shimizu, 1990; Bezek y Mechor, 1992).

En este trabajo no se
encontró diferencia entre la edad promedio de los bovinos PIT con los no PIT, a
pesar de que hubo una mayor cantidad de muestras tomadas desde animales de 2 a
8 años y en este grupo hubo una mayor frecuencia de positivos; al respecto es
reconocido que la prevalencia de PIT decrece con la edad del rebaño
(Littlejohns y Horner, 1990).

Se concluye que la técnica
implementada para detectar animales PIT fue apropiada y que existe una alta
prevalencia animal y predial de animales PIT en predios lecheros de pequeños
productores de la Región Metropolitana, sin asistencia médico veterinaria, en
que se sospecha de poseer animales en dicha condición, no encontrándose
animales PIT en predios de la misma región con asistencia médico veterinaria y
mejores condiciones sanitarias.

BIBLIOGRAFIA

AMES, T.R. 1986. The
causative agent of BVD: Its epidemiology and pathogenesis, Vet. Med. 81:
848-869.

BAKER, J.C. 1987. Bovine
viral diarrhea virus: A review, J. Am. Vet. Med. Assoc. 190: 1449-1458.

BEZEK, D.M., G.D. MECHOR.
1992. Identification and eradication of bovine viral diarrhea virus in a
persistently infected dairy herd, J. Am. Vet. Med. Assoc. 201: 580-586.

BOLIN, S.R. 1988. Viral and
viral protein specificity of antibodies induced in cows persistently infected
with noncytopathic bovine viral diarrhea virus after vaccination with
cytophatic bovine viral diarrhea virus, Am. J. Vet. Res. 49: 1040-1044.

BOLIN, S.R. 1990. Control
of bovine virus diarrhoea virus, Rev. sci. tech. Off int. Epiz. 9:
163-171.

BOLIN, S.R., A.W.
McKLURKIN, M.F. CORIA. 1985. Frequency of persistent bovine viral diarrhea
virus infection in selected cattle herds, Am. J. Vet. Res. 46:
2385-2387.

BOLIN, S.R., J.M. SACKS,
S.V. CROWDER. 1987. Frequency of association of noncytopathic bovine viral
diarrhea virus with mononuclear leukocytes from persistently infected cattle, Am.
J. Vet. Res. 48: 1441-1445.

BROWNLIE, J. 1990. The
pathogenesis of bovine virus diarrhoea virus infections, Rev. sci. tech.
Off. int. Epiz. 9: 43-59.

CELEDON, M.O. 1993. Nuevos
antecedentes en el comportamiento del virus de la diarrea viral bovina.
Situación en Chile, Av. Cs. Vet. 8: 11-17.

CELEDON, M.O., C. VARGAS,
A. SALINAS, A. CASANOVA, L. IBARRA, P. BERRIOS. 1996. Prevalencias serológicas
para el virus de la diarrea viral bovina y de la rinotraqueítis infecciosa
bovina en ganado lechero de la Región Metropolitana de Chile, Av. Cs. Vet. 11:
75-80.

CELEDON, M., L. PALACIOS,
J. PIZARRO, L. IBARRA. 1997a. Prevalencia de anticuerpos seroneutralizantes
para el virus de la diarrea viral bovina en ganado de carne de la Región
Metropolitana de Chile, Av. Cs. Vet. (en arbitraje).

CELEDON, M.O., L. ROCO, G.
QUINTEROS, M. SANTIBAÑEZ, P. BERRIOS. 1997b. Puesta en evidencia del virus
diarrea viral bovina en bovinos clínicamente afectados, Arch. Med. Vet. 29
(2): 189-195.

GALLETTI VERNAZZANI, E.
1997. Relación del virus diarrea viral bovina con aborto y/o síndrome de vaca
repetidora en bovinos serológicamente negativos a brucelosis. Memoria Título
Med. Vet., U. de Chile, 53 pp.

HARNEL, A.L., M.D.
WASYLYSHEN, G.P. NAYAR. 1995. Rapid detection of bovine viral diarrhea virus by
using RNA, extracted directly from assorted specimens and a one tube reverse
transcription PCR assay, J. Clin. Microbiol. 33: 287-291.

HOWARD, T.H., B. BEAN, R.
HILLMAN, D.R. MONKE. 1990. Surveillance for persistent bovine viral diarrhea
virus infection in four artificial insemination centers, J. Am. Vet. Med.
Ass. 196: 1951-1955.

LITTLEJOHNS, I.R., G.W.
HORNER. 1990. Incidence, epidemiology and control of bovine pestivirus
infections and disease in Australia and New Zealand, Rev. sci. tech. Off.
int. Epiz. 9: 195-205.

McCLURKIN, A.W., E.T.
LITTLEDIKE, R.C. CUTLIP, G.H. FRANK, M.F. CORIA, S.R. BOLIN. 1984. Production
of cattle immunotolerant to bovine viral diarrhea virus, Canad. J. Comp. Med.
48: 156-161.

MELENDEZ, P., M.O. CELEDON.
1995. Pesquisa del virus diarrea viral bovina desde un cuadro respiratorio
atípico en novillo, Av. Cs. Vet. 10: 83-85.

MEYLING, A., H. HOUE, A.M.
JENSEN. 1990. Epidemiology of bovine virus diarrhoea virus, Rev. sci. tech.
Off. int. Epiz. 9: 75-93.

PUCK, T.T., S.J. CIENVRA,
A. ROBINSON. 1961. Genetic of somatic mammalian cells, J. Exp. Med. 33:
339-349.

REINHARDT, G. 1992. Diarrea
viral bovina/enfermedad mucosa, una enfermedad viral compleja, Monografías
Med. Vet. 14: 49-55.

REINHARDT, G., S.
RIEDEMANN, H. FIEDLER, M. NIEDDA, M. AGUILAR, V. CUBILLOS, E. PAREDES. 1986.
Diarrea viral bovina/enfermedad mucosa. Primer aislamiento del agente causal en
Chile, Arch. Med. Vet. 18: 157-161.

REINHARDT, G., S.
RIEDEMANN, S. ERNST, M. AGUILAR, R. ENRIQUEZ, J. GALLARDO. 1990. Seroprevalence
of bovine viral diarrhea/mu-cosal disease in southern Chile, Prev. Vet. Med.
10: 73-78.

SHIMIZU, M. 1990. Current
situation of bovine virus diarrhoeamucosal disease (BVD-MD) virus infections
and their antigenic diversity in Hokkaido, Japan, Rev. sci. tech. Off. int.
Epiz. 9: 181-194.

TAYLOR, L.F., J. VAN
DONKERSGOED, O.M. RADOSTITS, C.W. BOOKER, E.J. DUBOVI, J .V. VAN DEN HURK, E.D.
JANZEN. 1994. Investigation of an outbreak of mucosal disease in a beef cattle
herd in southwestern Saskatchewan, Can. Vet. J. 35: 425-432.

WAXWEILER, S., B.T.L.
KARELLE, D. BOULAN-GER, B. MIGNON, E. ERNST, G. DETAL, F. BOONEN. P.P.
PASTORET. 1992. Bilan de cinq années de détection des taurillons infectés de
manière persistante par le virus BVD au centre de sélection bovine de Ciney, Ann.
Méd. Vét 136: 57-60.

* Trabajo financiado por el
Departamento Técnico de Investigación de la Universidad de Chile. Proyecto A
3141

M. CELEDON1, M.V., M.S.; J. CARBONELL1, M.V.; L. IBARRA1, M.V., Mg. Bioest.; J. PIZARRO1, B.Q., Dr. Cs.
1 Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Veterinarias y
Pecuarias, Casilla 2, Correo 15, Santiago, Chile.