Enfermedad perinatal y viabilidad celular renal postmortem in vitro en el Hospital Universitario del Valle, Cali (página 2)
MATERIALES Y METODOS
Datos clínicos. Se recolectaron los datos de
antecedentes maternos de enfermedad perinatal de todas las
admisiones de neonatos ²3 días de edad referidos por
la sala de partos del HUV y otros centros periféricos de atención médica, a la sala de
Cuidado Intensivo del Recién Nacido (CIRENA), y de los
mortinatos del HUV en Cali, Colombia, por un
período de 27 meses, entre octubre 1 de 1992 y diciembre
31 de 1994.
Los estudios postmortem se efectuaron en los neonatos
fallecidos dentro del HUV ²3 días de edad y en los
mortinatos, previa autorización informada. No se
consideraron para necropsia los casos de neonatos fallecidos
³4 días de edad, para evitar un mayor riesgo de
infección nosocomial (observaciones personales). Tampoco
se examinaron los casos no autorizados, o que pudieran presentar
algún deterioro macroscópico o con >3 horas
postmortem.
Obtención de tejido renal. El tejido renal se
obtuvo del neonato dentro de las primeras 3 horas post-mortem
mediante técnica aséptica. En breve, se
aplicó con guantes y gasa estéril una
solución al 10% de yodo (Wescodyne®) sobre el dorso
del cuerpo. Con instrumentos igualmente estériles, se hizo
una incisión paralumbar bilateral y se disecó el
tejido hasta obtener tejido renal. Este se colocó
inmediatamente en un recipiente estéril con medio de
transporte
(medio mínimo esencial de Eagle en sales de Hank)
adicionado de peptona y antibióticos, refrigerado a
4º C y mantenido así hasta su proceso en el
laboratorio.
Obtención de células
renales. El tejido renal se transportó a 4º C en el
medio antes descrito y se procesó en el laboratorio de In
Vitro del Departamento de Microbiología de la Universidad del
Valle, en Cali, Colombia, dentro de las primeras 24 horas de su
recolección. El tejido se cortó en fragmentos
pequeños en condiciones de esterilidad, con el empleo de una
cabina de flujo laminar de bioseguridad y técnicas
asépticas. La extracción de las células se
efectuó por digestión enzimática de acuerdo
con técnicas convencionales modificadas por Freshney
mediante el uso de colagenasa tipo IV. Las células se
suspendieron después en medio mínimo esencial de
Eagle en sales de Hank. La viabilidad de las células se
determinó por el método de
exclusión de azul tripán. Este es un colorante
vital al que es impermeable la membrana celular de las
células vivas, pero no lo es la de las células
muertas, que sí se tiñen por el
colorante10,25. Para la coloración se mezclaron
0.1 ml de suspensión de células y 0.9 ml de
solución de azul tripán al 0.4%.
El recuento de las células viables se hizo al
microscopio
(10X) en un hemacitómetro (cámara de Neubauer). Se
definió "caso con células viables" aquel donde la
viabilidad celular o número de células
identificadas al microscopio en términos de
exclusión de azul tripán fue ³50%.
Estudios microbiológicos. Se realizaron estudios
microbiológicos postmortem en los casos recolectados en
1994, con hemocultivo por punción intracardíaca,
cultivo de fluido intratisular y cultivo de la suspensión
misma de las células renales. En los casos con
células no viables se omitió el cultivo de fluido
intratisular y las células renales se inocularon en
cultivos de fibroblastos de pulmón humano para investigar
la presencia de citomegalovirus (CMV).
Cada una de las muestras se inoculó en 3 medios de
cultivo diferentes: tioglicolato de sodio, tripticasa soya e
infusión cerebro corazón
(BHI). Se incubaron por 15 días a 37º C. Luego se
hicieron repiques de estos medios en agar sangre de cordero
y en agar chocolate con isovitalex. Se consideraron negativas las
muestras que a las 48 horas de incubación en recultivo no
mostraban crecimiento
bacteriano.
Se definió como caso con sepsis aquel con
cultivos para ³1 bacteria (s) significativamente
patógena (s) en >1 de las muestras.
Análisis estadístico. Para realizar el
análisis estadístico se
definió proporción de viabilidad como el cociente
de dividir el número de casos viables entre el total de
necropsias realizadas. Como medida de fuerza de
asociación se utilizó la razón de
proporciones (RP) con intervalos de confianza (IC) de 95%,
descrito en el paquete estadístico EPI INFO versión
6.0 (Statcal). Como prueba de significancia estadística se aplicó el
Chi2 de Manthel-Haenszel.
RESULTADOS
Entre octubre 1 de 1992 y diciembre 31 de 1994, la sala
de CIRENA del HUV, registró 3,628 admisiones de neonatos
(²28 días de edad). Esto equivale a un promedio de
134 admisiones por mes o 4.5 por día. De estos, 2,578
(71%) fueron de sala de partos intrahospitalaria y 897 (25%)
fueron referidos de otros centros periféricos. No se
logró establecer la procedencia de 153 (4%) admisiones.
Casi todas las admisiones (68%) fueron de neonatos ²3
días de edad.
En total se registraron 787 muertes neonatales para una
tasa de mortalidad hospitalaria de 22%, con un mayor riesgo para
el grupo de 0-3
días de edad con 587 (16%) muertes y el menor riesgo para
el grupo de 4-7 días de edad con 58 (2%) muertes. Si la
edad del neonato era igual o mayor a 8 días, su riesgo de
muerte
intrahospitalaria era de 4% (Cuadro 1); 73 neonatos de este
último grupo murieron el mismo mes de admisión y
los 69 restantes murieron el mes calendario siguiente o
siguientes, con una estancia promedio de 17 días. Se
observó entonces, una tasa total de sobrevivencia del
neonato a la hospitalización en CIRENA cercana a
80%.
Se lograron analizar los antecedentes maternos de
enfermedad perinatal en 1,214 neonatos (49%) del total de 2,469
registrados con ²3 días de edad. No hubo información sobre los antecedentes maternos
en los restantes 1,255 neonatos.
De ellos, 889 (73%) o casi 3 de cada 4 fueron neonatos
con ² 2,500 g de peso al nacer o bajo peso al nacer (BPN).
El antecedente de enfermedad perinatal más frecuente en
ambos grupos fue
eclampsia con un total de 407 (33%) casos, seguido por ruptura
prematura de membranas con un total de 373 (31%) casos. Estas dos
complicaciones comprometen por tanto a casi 2 de cada 3 neonatos
²3 días de edad (Cuadro 2).
De las 587 muertes informadas en el grupo de neonatos
²3 días de edad, se realizaron 357 (61%) necropsias.
Hubo un total de 39 necropsias en mortinatos, sumando 396 casos
examinados postmortem. De éstos 321 (81%) tenían
BPN. Un total de 96 (24%) casos tenían antecedente materno
de eclampsia y 55 (14%) de ruptura prematura de membranas. No
hubo información sobre antecedentes maternos de enfermedad
perinatal en 155 (39%) de los casos examinados postmortem (Cuadro
3).
En general hubo un orden de frecuencia similar en la
distribución de los antecedentes de
enfermedad perinatal y peso al nacer entre los casos examinados
postmortem y el total de los 1,214 neonatos en el Cuadro 2, lo
que sugiere una muestra adecuada
para los casos en estudio.
En este trabajo, en
total se obtuvieron 239 casos con células renales viables
postmortem de 396 necropsias realizadas, de donde resulta una
viabilidad celular renal postmortem (VCRP) global de 60%. Al
analizar los datos de VCRP de acuerdo con peso al nacer, se
obtuvieron 59% más de VCRP en los casos con BPN (65%) que
en los de mayor peso (41%), es decir, una razón de 1.6 (IC
95% = 1.2-2.08). Esta diferencia fue estadísticamente
significante (p = 0.00018).
Cuando se analizaron los datos de VCRP de acuerdo con el
peso al nacer y los antecedentes maternos de enfermedad perinatal
se obtuvo una VCRP de 64% en los casos de BPN con antecedente
perinatal de eclampsia. Este valor fue 2.5
(IC 95% = 1.2-5.9) veces mayor que la VCRP de los casos de mayor
peso con igual antecedente (26%). Esta diferencia fue
estadísticamente significante (p = 0.0013). Al analizar
los datos de VCRP de acuerdo con los distintos antecedentes
maternos de enfermedad perinatal, se observó la más
alta VCRP en corioamnionitis, (67%); luego infección
urinaria, (64%); ruptura prematura de membranas, (62%);
eclampsia, (55%); hipertensión arterial, (53%); diabetes, (50%);
prolapso de cordón, (44%); abruptio placentae, (35%); y
rubéola, (0%). Sin embargo, estas diferencias no fueron
estadísticamente significantes (Cuadro 3).
Más de 70% de los casos post-mortem examinados,
tenían registro de
diagnóstico de muerte "prematurez,
enfermedad de membrana hialina (EMH), síndrome de
dificultad respiratoria (SDR), anoxia y/o asfixia perinatal" y
uno de cada 5 casos tenía registro de "hemorragia
cerebral, hemorragia pulmonar, sepsis, y/o
broncopneumonía." De cada 10 necropsias realizadas, una
fue en mortinatos.
Se obtuvo una VCRP 6.7 (IC 95% = 2.3-19.6) veces mayor
en mortinatos ²2,500 g (88%) que en mortinatos de mayor peso
(13%). Esta diferencia fue estadísticamente significante
(p = 0.0000053). No se encontró diferencia significante
entre los otros grupos analizados (Cuadro 4).
En 1994, se recolectaron 145 casos postmortem para
estudios microbiológicos de los cuales 79 (54%)
tenían células renales viables y 66 (46%) eran no
viables (Cuadro 5). De estos, 133 (92%) fueron estériles y
en sólo 12 (8%) casos crecieron bacterias
patógenas en cultivo, que se clasificaron como
sépticos. De los 12 casos sépticos, 10 (83%) fueron
casos no viables (p = 0.0062).
En orden de frecuencia, las bacterias aisladas de los
casos sépticos no viables fueron Escherichia coli, 3;
Pseudomona aeruginosa, 3; Klebsiella pneumoniae, 2; y
Staphylococcus aureus, 2. En los dos casos sépticos con
células viables, las bacterias aisladas fueron S. aureus y
P. aeruginosa. El contaminante superficial más frecuente
de los casos "estériles" con células renales
viables fue S. epidermidis. En sólo 1 caso (2%) de los 66
no viables se demostró la presencia de CMV.
DISCUSION
El servicio de
CIRENA del HUV, es el nivel público más alto (Nivel
III) de atención médica neonatal en la zona. Es
pues un centro de referencia que cubre los casos críticos
de múltiples centros médicos periféricos y
de la sala de partos intrahospitalaria, siendo esta última
responsable por más de 70% de los ingresos.
Para el período del estudio la tasa de mortalidad
hospitalaria en este servicio es de 22% ó 1 de cada 5
admisiones (1:4), con el mayor riesgo de muerte (16%) en los
primeros 3 días de edad, cuando ingresa una gran
proporción (68%) de neonatos. Son pues, los primeros 3
días de edad del neonato los más críticos en
la sala de cuidado intensivo. El período de
hospitalización en cuidado intensivo menos crítico
para el neonato es el de 4 a 7 días de edad, cuando mueren
menos de 2%. Si el neonato tiene 8 ó más
días de edad durante la hospitalización en CIRENA,
su riesgo de muerte aumenta de nuevo, lo que indica muy
probablemente un problema médico más complejo que
requiere mayor tiempo de
atención y cuidado.
La mayoría (casi 3 de cada 4) de las admisiones a
CIRENA, son neonatos de BPN al nacer, y casi 2 de cada 3, tienen
antecedente perinatal de eclampsia o ruptura prematura de
membranas.
Los casos postmortem examinados tienen una
distribución de antecedente materno de enfermedad
perinatal similar a la población del total de neonatos admitidos
lo que demuestra la gran importancia de tales antecedentes al
ingreso. Los diagnósticos de muerte que se informan con
más frecuencia (71%) son "prematurez, EMH, SDR y anoxia
y/o asfixia perinatal."
Es pues, necesario continuar con las investigaciones
médicas multidisciplinarias con el fin de reducir la tasa
de mortalidad hospitalaria y mejorar la salud del recién
nacido y su madre. El examen postmortem es una herramienta
invaluable que intenta descubrir la causa de muerte, entender la
historia natural
de la enfermedad y elucidar mecanismos de función a
nivel celular que permitan comprender mejor al hombre y su
entorno.
El tejido renal postmortem de neonatos es un excelente
ejemplo de un recurso adecuado para la obtención de
cultivos celulares primarios en la investigación biomédica. En los
laboratorios del Programa In Vitro
del Departamento de Microbiología de la Universidad del
Valle, se demuestra que a partir de casos de neonatos postmortem
y mortinatos en el HUV se puede lograr una VCRP de 60%. La
viabilidad más baja en humanos se debe quizá al
antecedente de enfermedad que produjo la muerte, en
combinación con mayor tiempo entre muerte y
obtención del tejido.
Las observaciones en esta experiencia sugieren que la
VCRP disminuye 10% por hora postmortem hasta el momento de
conseguir el tejido. Una vez que se obtiene el tejido en
condiciones adecuadas de medio y transporte, la VCRP se
estabiliza hasta por 24 horas. La viabilidad celular aumenta
significativamente en mortinatos ²2,500 g de peso (88%) y
neonatos fallecidos con ²3 días de edad y BPN (65%).
Esta mayor viabilidad en el tejido renal se puede relacionar con
el grado de prematurez en muchos casos y por ello con el grado de
indiferenciación celular del tejido embrionario que se
refleja en mayor actividad de la multiplicación celular.
Como este estudio no determinó la edad gestacional con
respecto a peso al nacer, no es posible confirmar esta
presunción.
La VCRP disminuye de modo significativo en neonatos
fallecidos ²3 días de edad y de >2,500 g de peso
con antecedente materno de eclampsia (26%). Este hallazgo y las
posibles implicaciones en la función renal del neonato
ameritan estudios más amplios. Por ahora, este dato apoya
aún más la conducta
establecida de adelantar el parto en la
eclampsia para controlar este estado en la
madre, pues también podría favorecer al neonato y
prevenir un posible deterioro de su función renal, si la
disminución de tal viabilidad in vitro es un reflejo del
daño
celular in vivo.
Se observa también una disminución en la
viabilidad celular en casos sépticos (p = 0.0062). Sin
embargo, las células renales viables sépticas se
pueden tratar in vitro con antibióticos de amplio espectro
(penicilina, gentamicina, estreptomicina, anfotericina) de donde
resultan cultivos celulares de la misma calidad y
esterilidad que los no sépticos. Esto establece que la
infección celular puede ser erradicable con el tratamiento
in vitro apropiado. Ahí se ofrece una situación
práctica favorable en la tecnología de
cultivos celulares primarios de origen humano. Los estudios en
este campo deben continuar para buscar mecanismos que mejoren la
eficiencia de
los cultivos de células renales in vitro.
AGRADECIMIENTOS
Por su interés y
decisiva colaboración a los doctores Carlos Starck y
Héctor Fabio Montes, jefes de la sala de recién
nacidos; al Departamento de Ginecología y Obstetricia,
Hospital Universitario del Valle; a la Fundación CIRENA y
a todo el personal
médico, de enfermería, trabajo social y
administrativo de la sala por su valiosa ayuda en el desarrollo del
estudio.
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Alvaro Dueñas L., M.D.1, William
David Criollo, Bact.2, Ana Julia Miranda de Bernal,
Trab. Soc.3, José Ever Piamba, Tec.
Lab.4
1. Profesor
Titular (R), Departamento de Microbiología, Escuela de
Ciencias
Básicas Médicas, Facultad de Salud, Universidad del
Valle. Director Programa IN VITRO, Cali, Colombia.
2. Bacteriólogo, Programa IN VITRO, Departamento de
Microbiología, Escuela de Ciencias Básicas
Médicas, Facultad de Salud, Universidad del Valle, Cali,
Colombia.
3. Trabajadora Social, Coordinadora Programa IN VITRO,
Departamento de Microbiología, Escuela de Ciencias
Básicas Médicas, Facultad de Salud, Universidad del
Valle, Cali, Colombia.
4. Técnico de Laboratorio, Programa IN VITRO, Departamento
de Microbiología, Facultad de Salud, Universidad del
Valle, Cali, Colombia.
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