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Evaluación diagnóstica de fracciones cromatográficas de Fasciola hepatica mediante Western Blot y ELISA en animales infectados (página 2)



Partes: 1, 2

MATERIAL Y METODOS

Antígenos (Ag). Se obtuvieron fracciones
antigénicas de productos de excreción-secreción (E-S) de fasciolas adultas
recuperadas desde el hígado de animales beneficiados en un matadero de la
Región Metropolitana.

Para ello, las fasciolas
vivas recolectadas fueron lavadas en suero fisiológico estéril y luego
incubadas durante 16-18 h a 37° C, en solución Hedon-Fleig estéril (Morilla y
Bautista, 1986). El sobrenadante fue dializado en agitación contra agua
desionizada, durante 24 h a 4° C, luego fue sometido a ultracentrifugación
(15.000 x g por 20 minutos) y liofilización hasta un volumen de 1 ml. El
sobrenadante fue almacenado en alícuotas, a -70° C, previa determinación de la
concentración proteica (Bradford, 1976).

Cromatografía. El extracto E-S fue
semipuri-ficado por fraccionamiento cromatográfico de exclusión por tamaño
molecular o filtración en geles (Stites y Terr, 1991).

Se cargaron 5 ml del Ag E-S
(4 µg/µl de proteína) previamente filtrados a través de membrana de
nitrocelulosa (poro 0.45 µm), en una columna de Sephacryl S-300 (Sigma), de 2.5
cm de diámetro y 90 cm de largo, cuya fase líquida fue buffer PBS 0.01 M con
azida 0.03% p/v (pH: 7.4). La detección fue a 280 nm en un detector de flujo
continuo (Pharmacia). Las fracciones fueron colectadas en un colector
automático (Pharmacia) e inmediatamente liofilizadas hasta obtener un volumen
final aproximado de 500 µl al cual se le agregaron 500 µl de una mezcla de
inhibidores enzimáticos.

Se obtuvo, además, una
curva cromatográfica patrón con polipéptidos comerciales cuyos pesos
moleculares (PM) oscilaron entre los 2.000.000 a los 29.000 (azul dextrano
2.000 kDa; tiroglobu-lina bovina 669 kDa; apoferritina esplénica equina 443
kDa; alcohol dehidrogenasa 150 kDa; albúmina sérica bovina 66 kDa y anhidrasa
carbónica 29 kDa), en un tiempo de corrida inferior a las 24 h desde que se
cargó la muestra. De esta manera se obtuvo una estimación del PM de los
polipép-tidos constituyentes del preparado antigénico en su forma nativa.

Análisis de fracciones
cromatográficas
. Se
analizó la curva cromatográfica y las fracciones colectadas, correspondientes a
los "peaks" con más alta absorbancia, mediante SDS-PAGE y su
posterior WB. Se emplearon sueros de animales infectados y no infectados con F.
hepatica, agrupados en "pools" de 10 muestras cada uno. Los sueros
detectores fueron de ovinos sin F. hepatica, ovinos infectados naturalmente,
ovinos sin F. hepatica, pero con quistes hidatídicos o Thysanosoma
actinioides
, equinos sin F. hepatica, equinos infectados naturalmente,
porcinos sin F. hepatica, porcinos infectados naturalmente y porcinos
sin F. hepatica, pero con Cysticercus cellulosae.

La infección natural de los
ovinos se realizó trasladando corderos procedentes de la Estación Experimental
Hidango del Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA del
Ministerio de Agricultura) a un predio de la VII Región, donde la fasciolosis
es endémica (Alcaíno y col., 1992). Luego ellos fueron transportados a
dependencias de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la
Universidad de Chile, para su estudio. Mediante exámenes coprológicos se
estableció la patencia de la infección.

SDS-PAGE y WB. La técnica se realizó en
mini-geles (8 x 7 x 1.5 mm) a una concentración de 12%, en una cámara vertical
(Mini-Protean II, BIO-RAD), en condición denaturante, con peineta discontinua y
a una diferencia de potencial de 100 V (Tsang y col., 1983). En el carril
central se incluyó un peso molecular comercial estándar, con un rango de 14.2 a
66 kDa, mientras que en los otros carriles se colocaron los diferentes eluidos
seleccionados. Algunos de los geles fueron teñidos con azul de Coomassie o
plata y otros fueron electrotransferidos.

Los polipéptidos separados
por peso molecular fueron transferidos a 100 V por 90 minutos, a 4° C, a
membranas de nitrocelulosa. Estas fueron incubadas con los sueros detectores,
diluidos 1:100 en PBS-Tween 20, posteriormente se incubaron en una solución
conteniendo el conjugado anti-IgG antiespecie específica, marcadas con
peroxidasa (Sigma) y PBS-Tween 20 según titulación previa. Luego fueron
reveladas con el sustrato (diaminobenzidina, PBS y H2O2). Una vez aparecidas
las bandas, las membranas se lavaron en agua destilada. El WB permitió la
identificación y separación de aquellas fracciones cromatográficas conteniendo
los polipéptidos considerados relevantes desde el punto de vista diagnóstico
para cada especie animal.

Aplicación de la prueba
de ELISA
. Se empleó
una técnica de ELISA en microplaca, para evaluar la eficiencia diagnóstica de
las fracciones así seleccionadas. Para ello se usaron sueros individuales de
animales infectados y no infectados con F. hepatica distribuidos en
sueros de 10 ovinos con fasciolosis en etapa prepatente, 37 ovinos con
fasciolosis en etapa crónica, 35 ovinos sin infección, 40 equinos con
fasciolosis crónica, 40 equinos sin infección, 40 porcinos con fasciolosis
crónica y 40 porcinos sin infección.

Los sueros de ovinos,
porcinos y equinos sin infección con F. hepatica fueron obtenidos de
animales de la XII Región y de mataderos de la Región Metropolitana que al
examen post mortem no demostraron la infección.

Los sueros de ovinos con
quistes hidatídicos o infectados con T. actinioides pero sin infección con F.
hepatica también se obtuvieron de animales de la XII Región, mientras que los
sueros de los cerdos infectados con C. cellulosae se obtuvieron de
mataderos de la Región Metropolitana previa inspección post mortem, para
demostrar la ausencia de fasciolas. Los sueros de ovinos en fase prepatente de
la infección se obtuvieron de 10 corderos naturalmente infectados. Los sueros
en fase patente o con infección crónica, de las diferentes especies animales,
provenían de animales de matadero, en que mediante examen post mortem se
verificó la presencia de la infección. Se utilizaron como controles negativos
un "pool" de sueros de animales de la XII Región y como controles
positivos, un "pool" de sueros de las diferentes especies animales
con infección crónica.

La prueba de ELISA se
realizó en microplacas de fondo plano de 96 pocillos (12 x 8). Previa
titulación en duplicado de cada una de las diferentes fracciones antigénicas,
de los sueros y del conjugado, se seleccionaron sólo aquellas fracciones que
demostraron discriminación entre las densidades ópticas (PO) de los controles
negativos y los controles positivos.

Con cada fracción
cromatográfica seleccionada se sensibilizaron dos placas de poliestireno por
especie animal. Estas fueron diluidas en una solución tampón (pH: 9.6) para
lograr una concentración proteica de 4 µg/ml. Siempre se dejó en la misma
ubicación un pocillo vacío como blanco. Luego las placas se lavaron y se
bloquearon con leche descremada al 3% en PBS-T20 0.05% v/v, se sellaron y se
mantuvieron en congelación (-70° C) hasta su uso.

Todos los sueros en estudio
se diluyeron (1/64) en una solución de leche descremada al 3% en PBS-T20 0.05%
v/v y se agregaron 100 µl a cada pocillo en duplicado. Las placas se incubaron
por una hora a 37° C en cámara húmeda. Luego se lavaron, se incubaron con 100
µl de una anti-IgG peroxidasa especie específica, diluida al 1/4000 en PBS-T20
0.05% v/v, por una hora a 37° C en cámara húmeda. Luego se lavaron y en cada
pocillo se agregaron 100 µl del sustrato ortofenilendiamina, buffer citrato,
H2O2 y se incubaron por 10 a 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La
reacción enzimática se detuvo adicionando a cada pocillo 25 µl de H2SO4 0.25 M.
La lectura de cada placa se realizó a 492 nm con un lector automático de ELISA
(BDSL Imunoskan Plus).

El criterio que se empleó
para interpretar el resultado de las lecturas fue uno de los indicados por
Voller y col. (1979), en que se considera positivo a aquel suero que ofrece una
densidad óptica (DO) superior o igual a dos veces la lectura promedio de los
sueros controles negativos. Cada placa incluyó 3 controles negativos en
duplicado. Este criterio entregó un valor "cut off" para cada placa.
Se analizaron y compararon los resultados obtenidos por ELISA y el examen post
mortem mediante la prueba de Mc Nemar para proporciones correlacionadas o
dependientes (Remington y Schork, 1970).

El análisis de los
resultados permitió establecer la sensibilidad y especificidad de las
fracciones seleccionadas, así como los correspondientes valores predictivos
positivo y negativo, para una proyección práctica en un diagnóstico
inmunológico de rutina (ELISA) de las infecciones naturales con F. hepatica.
 

RESULTADOS Y DISCUSION

Al analizar los resultados
de este estudio, encaminado a la selección y caracterización de antígenos de
relevancia diagnóstica, se corroboró la alta complejidad proteica y antigénica
de F. hepatica (Gorman y col., 1992). Sin embargo, esta complejidad
influye en forma negativa en el rendimiento de las pruebas inmunodiagnósticas,
por las reacciones cruzadas o inespecíficas generadas por los determinantes
antigénicos compartidos con otras parasitosis (Gorman y col., 1994, 1995). Es
por ello que la separación y purificación de estos antígenos parasitarios surge
como necesaria para aumentar los valores de sensibilidad y especificidad de las
pruebas diagnósticas.

El método cromatográfico de
exclusión por tamaño molecular y el tipo de relleno utilizado (Sephacryl S-300,
con rango de fraccionamiento para proteínas globulares de 10.000 a 1.500.000),
permitió diferenciar hasta 5 "peaks" medianamente resueltos, aunque
el último de ellos correspondió a péptidos muy pequeños (fig.1).

Cuadro 1.
Bandas de
reconocimiento antigénico específico reconocidas por sueros de
animales infectados mediante western blot empleando fracciones cromatográficas

de productos de E-S de Fasciola hepatica.
Specific bands recognized by infected animal sera tested by western blot with
Fasciola
hepatica chromatographic fractions of excretory-secretory products.

Fracción

Bandas específicas (kDa)

 cromatográfica

Ovinos

Equinos

Porcinos

 2.000

 400

29

150

29

29

29

29 y 14

29 y 14

29 y 14

<29

29

29 y 14

29 y 14

La interpolación con la
curva cromatográfica estándar permitió calcular aproximadamente los pesos
moleculares de aquellos polipéptidos obtenidos en los diferentes eluidos
cromatográficos, correspondiendo a 2.000-400-150-29 y menores de 29 kDa, en su
forma nativa (fig. 1). Este rango de valores concuerda con los obtenidos por
Zimmerman y Clark (1986), quienes también purificaron y fraccionaron antígenos
de parásitos empleando un preparado antigénico E-S de F. hepatica y
diferentes métodos cromatográficos. Ellos usaron una columna Sephacryl S-200
obteniendo hasta 4 "peaks" y con una columna de Superosa-6 (FPLC)
obtuvieron 9 "peaks". Sin embargo, por el primer método, ellos
determinaron pesos moleculares aproximados de 376.000, 202.000, 70.000 y 40.000
respectivamente, valores que en sí difieren con los del presente estudio,
probablemente debido a diferentes marcadores comerciales utilizados, así como
al tipo de columna empleada (Sephacryl S-200), la cual resuelve proteínas
globulares de 5.000 a 250.000. El quinto "peak" que describimos, por
su pequeño tamaño, puede corresponder sólo a péptidos de degradación del
material antigénico original. Esto se confirma al observar en la figura 2 el
correspondiente análisis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) de cada eluido,
al encontrar sólo bandas que fueron arrastradas de la fracción anterior,
fenómeno que ocurre cuando los "peaks" son medianamente resueltos.

Estos mismos autores al
emplear Dot-ELISA (una variación de ELISA que utiliza como soporte membranas de
nitrocelulosa) encontraron fracciones reaccionantes sólo en los eluidos
cromatográficos del tercer y cuarto "peak", vale decir, en los 70 kDa
y 40 kDa. Así también Rivera y col. (1988) obtuvieron mediante HPLC una
fracción muy abundante de 150-160 kDa y otra de 25-30 kDa, que adaptadas a un
Dot-ELISA resultaron ser detectadas por los sueros de conejos con fasciolosis
aguda y crónica. Estos resultados son similares a los que describimos en este
estudio, analizando los eluidos del tercer y cuarto "peak", mediante
WB y con los del cuarto "peak"evaluado mediante ELISA en microplaca
con sueros de animales detectores.

La evaluación de las
diferentes fracciones cromatográficas mediante SDS-PAGE confirmó la presencia
de varias bandas, la mayoría entre los 66 y 14 kDa (fig. 2), rango descrito por
una serie de investigadores (Zimmerman y Clark, 1986; Santiago y Hillyer, 1988;
Hillyer y col., 1988; Sexton y col., 1990; Hillyer, 1993; Ruiz-Navarrete y
col., 1993; Gorman y col., 1994, 1995).

Figura 1. Separación de los polipéptidos
comerciales (Pm st) y de antígenos E-S de F. hepatica (Ag E-S) mediante
cromatografía de exclusión por tamaño molecular.
Sephacryl S-300 separation of F. hepatica E-S antigens (Ag E-S) and molecular
weight standards.

Figura 2. SDS-PAGE de las fracciones
cromatográficas de antígenos E-S de F. hepatica, teñidas con plata (a: 2000, b:
400, c: 150, d: 29, e: <29; PM: peso molecular estándar).
SDS-PAGE of chromatographic F. hepatica E-S fractions stained with silver (a:
2000, b: 400, c: 150, d: 29, e: <29; PM: weight markers).

Así también, al utilizar
los sueros detectores de animales infectados y no infectados con F. hepatica,
junto con los sueros de animales con otras parasitosis (hidatidosis o Thysanosoma
actinioides
en ovinos y Cysticercus cellulosae en porcinos), se
constató la presencia de aquellos polipéptidos de 14 y 29 kDa descritos como
específicos y sensibles, al ser reconocidos sólo por aquellos sueros de los
animales con fasciolosis (fig. 3).

Cada fracción
cromatográfica, excepto la 2.000 kDa, presentó una o más de estas bandas. En
las fracciones cromatográficas de 400 y 150 kDa se reconoció sólo la banda de
29 kDa, hecho evidenciable en la especie ovina y porcina; mientras que en las
fracciones cromatográficas de 29 y <29 kDa se identificaron las bandas de 29
y 14 kDa en las tres especies en estudio (cuadro 2).

Cuadro 2.
Sensibilidad,
especificidad y valor predictivo de cada fracción cromatográfica,
mediante ELISA en el diagnóstico de la fasciolosis ovina en fase prepatente.
Sensitivity, specificity and predictive value of each chromatographic
fraction in the
diagnosis of prepatent fasciolosis by ELISA in sheep.

Fracción

Sensibilidad

Especificidad

Valor predictivo

 

%

%

(+)%

()%

 < 29 kDa

60

95

75

90

    29
kDa

90

90

69

97

  150 kDa

90

75

47

97

  400 kDa

50

90

56

88

Figura 3. WB de la fracción cromatográfica
de 29 kDa, de antígenos E-S de F. hepatica, en ovinos (O), equinos (E) y
porcinos (P).
Carril 1: pool animales sin fasciolosis; carril 2: pool animales con
fasciolosis; carril 3: pool animales con otras parasitosis (hidatidosis o
Thysanosoma actinioides en ovinos y Cysticercus cellulosae en porcinos).
WB of the 29 kDa chromatographic fraction of F. hepatica E-S antigens using
sheep (O), horse (E) and pig (P) sera.
Lane 1: pool sera from non infected animals; lane 2: pool sera from fasciolosis
infected animals; lane 3: pool sera from animals with other parasitic
infections (hidatidosis or Thysanosoma actinioides in sheep and Cysticercus
cellulosae in swine).

La repetición de bandas en
las fracciones 29 y <29 kDa puede deberse a dos razones: es posible que
cuando las diferentes proteínas nativas constitutivas de las fracciones se
someten a condiciones denaturantes, ellas originen moléculas de igual peso, que
se sobreponen en una misma banda. O bien que al estar cada "peak"
medianamente resuelto por un efecto de traslape de curvas y arrastre aparezcan
las mismas proteínas en alguna fracción pero en menor concentración. Por lo
anterior, conviene destacar que resultaron más concentradas las bandas de 29 y
14 kDa en la fracción cromatográfica llamada 29 (fig 4).

Figura 4. SDS-PAGE de la fracción
cromatográfica denominada 29, de antígenos E-S de F. hepatica, teñida con azul
de Coomassie.
SDS-PAGE of the 29 kDa chromatographic fraction of F. hepatica E-S antigens
stained with Coomassie blue.

Las bandas reconocidas por
los "pools" de sueros de las diferentes especies animales estudiadas
y analizadas por WB se distribuyeron en los rangos de pesos moleculares de
polipéptidos ya identificados por otros autores (fig. 3).

Nuestra fracción
cromatográfica de 29 kDa, por su peso y origen, podría ser o estar muy
relacionada con polipéptidos que se han logrado purificar, caracterizar e
incluso clonar y secuenciar el DNA de algunos de ellos. Tal es el caso de una
cisteína proteinasa (CP) de 27 kDa que fue purificada de un homogeneizado de
fasciolas adultas y que ha sido clonada, secuenciada, evaluada y reconocida
mediante ELISA usando sueros de humanos con fasciolosis (Yamasaki y Aoki, 1993;
Heussler y Dobbelaere, 1994). Otro polipéptido descrito con reacción protectiva
cruzada entre los géneros parasitarios Fasciola y Schistosoma, que
determina una respuesta inmune variada según la especie animal afectada, es la
glutatión S-transferasa (GST) de 28 kDa, también proveniente de fasciolas
adultas (Sexton y col., 1990; Hillyer y col., 1992a; Panaccio y col., 1992).

Otro polipéptido que podría
relacionarse con el de 14 kDa reconocido, en este estudio, en forma específica
mediante WB con los sueros de animales con fasciolosis fue aislado por Hillyer
y col. (1988), también de parásitos adultos, demostrando reacción cruzada,
diagnóstica y protectiva frente a otro tremátodo no existente en Chile, Schistosoma
mansoni
. Este ha sido caracterizado como una proteína unida a ácido graso
("fatty acid binding pro-tein") de 12 kDa (Fh 12) de la cual incluso
se ha llegado a producir la proteína recombinante designada rFh 15, por ser de
15 kDa (Hillyer, 1995).

Los estudios de Espino y
col. (1987) y los de Santiago y Hillyer (1988) ya habían demostrado la eficacia
inmunodiagnóstica de la prueba de ELISA en la fasciolosis humana y animal,
utilizando los productos de excreción-secreción de F. hepatica adulta como
antígeno. Así también, evaluando diversos métodos diagnósticos para la
fasciolosis animal, entre ellos ELISA, empleando un macerado total del parásito
adulto, hemos logrado además detectar respuesta inmune en corderos infectados
muy precozmente, al mes y medio p.i.

Sin embargo la sensibilidad
por especie fue inferior a 65%. En cambio, la sensibilidad promedio de 94.5%,
que ahora describimos al emplear ELISA con las fracciones mencionadas, sería
muy similar a los encontrados por Hillyer y col. (1992b), quienes llegaron a un
nivel óptimo de sensibilidad de un 95%, usando FAST-ELISA en humanos. No
obstante, cabe hacer notar que en la especie humana la respuesta no es tan
compleja, pues por lo general no se encuentran poliparasitados como los
animales, por lo que nuestros resultados en ellos cobran mayor importancia aún,
ya que siendo portadores de otras parasitosis y sin fasciolosis no presentaron
respuesta inmune cruzada.

En el presente estudio se
estableció que en las tres especies animales la fracción cromatográfica de 29
kDa correspondería, según los valores de sensibilidad, especificidad y valores
predictivos, la de mayor interés según lo detallan los cuadros 3, 4, 5 y 6. Con
ella fue incluso posible identificar a más del 90% de los ovinos infectados,
sin importar en qué etapa de la infección se encontraran (prepatente o
patente). Aún más, cabe destacar que la fracción cromatográfica de 150 kDa
tampoco presentó diferencias diagnósticas significativas, en las especies ovina
y porcina, entre el examen post mortem y ELISA (p<0.05).

Cuadro 3.
Sensibilidad,
especificidad y valor predictivo de cada fracción cromatográfica,
mediante ELISA en el diagnóstico de la fasciolosis ovina en fase patente.
Sensitivity, specificity and predictive value of each chromatographic fraction
in the
diagnosis of patent fasciolosis by ELISA in sheep.

Fracción

Sensibilidad

Especificidad

Valor predictivo

 

%

%

(+)%

()%

 < 29 kDa

80

95

94

83

    29
kDa

95

90

90

95

  150 kDa

85

75

77

83

  400 kDa

18

90

64

52

 

Cuadro 4.
Sensibilidad,
especificidad y valor predictivo de cada fracción cromatográfica,
mediante ELISA en el diagnóstico de la fasciolosis porcina.
Sensitivity, specificity and predictive value of each chromatographic
fraction in the
diagnosis of pig fasciolosis by ELISA.

Fracción

Sensibilidad

Especificidad

Valor predictivo

 

%

%

(+)%

()%

 < 29 kDa

68

  97

  96

69

    29
kDa

93

  97

  97

91

  150 kDa

98

100

100

97

  400 kDa

  0

100

    0

43

 

Cuadro 5
Sensibilidad,
especificidad y valor predictivo de cada fracción cromatográfica,
mediante ELISA en el diagnóstico de la fasciolosis equina.
Sensitivity, specificity and predictive value of each chromatographic
fraction in the
diagnosis of horse fasciolosis by ELISA.

Fracción

Sensibilidad

Especificidad

Valor predictivo

 

%

%

(+)%

()%

 < 29 kDa

  33

100

100

  58

    29
kDa

100

  97

  98

100

  150 kDa

  33

100

100

  58

  400 kDa

   8

100

100

  51

Lo anterior demostraría que
la fracción inmunogénica de 29 kDa sería conservada en el transcurso de la
infección. La mayor eficiencia de esta fracción corrobora que la pureza de los
determinantes antigénicos en el rendimiento de esta prueba es esencial. No así
cuando se emplea un extracto crudo del parásito, el cual presentaría una
infinidad de epitopos, algunos probablemente compartidos con otros vermes y
otros que pueden ofrecer reacciones inespecíficas.

Por otra parte, dado que
los valores predictivos positivos y negativos logrados en este estudio fueron
muy adecuados, se demuestra que la fracción cromatográfica de 150 kDa (en
porcinos) y sobre todo la de 29 kDa en las tres especies animales, son
relevantes en el inmunodiagnóstico de esta parasitosis. Esta conclusión se ve
aún más reforzada al no observar con estas fracciones diferencias diagnósticas
significativas (p <0.05) entre el examen post mortem y ELISA.

Por los resultados
promisorios obtenidos, resulta interesante continuar con esta línea de investigación
para contribuir al desarrollo tecnológico y el control de importantes
enfermedades parasitarias presentes en el país.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean expresar
sus agradecimientos a: los Dres. Patricia Avalos, José Naranjo y Rigofredo
Veneros, Médicos Veterinarios del Servicio Agrícola y Ganadero, por facilitar
los sueros de animales de la XII Región.

Al Departamento de
Post-grado y Post-título de la Universidad de Chile, Beca N° 042-94.
A FONDECYT Proyecto N° 194-0245.

*  Financiado por
Depto. de Post-Grado y Post-Título de la Universidad de Chile, Beca Nº 042-94,
y FONDECYT Proyecto Nº 194-0245.

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F. FREDES, M.V., M.Sc.,;
T. GORMAN, M.V., M.P.V.M.; M. SILVA, T.M.; H. ALCAINO, M.V., Ph.D.
Departamento de
Medicina Preventiva Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias,
Universidad de Chile, Casilla 2, Correo 15, Santiago, Chile. Fax 56-2 5416840.

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