Técnicas diagnósticas de referencia para el análisis de marcadores de virulencia del virus pseudorrabia, cepa RC/79: ensayos preliminares

• Introducción
• Material y métodos
• Resultados
• Discusión
• Bibliografía

RESUMEN: En nuestro laboratorio hemos
estandarizado los métodos de inmunoperoxidasa e inmunofluores-cencia indirecta
para la detección del virus de la enfermedad de Aujeszky en cultivos de células
Vero, utilizando como modelo la cepa viral RC/79. Hubo una fuerte correlación
entre los resultados logrados por ambas técnicas, las que evidenciaron ser
altamente específicas para la identificación del virus y permitieron una
precisa localización de los antígenos virales en las células infectadas. La
aparición de células multinucleadas o sincitios con marcada reacción en la
región nuclear a las 16 horas p.i. indicó que la cepa RC/79 es fuertemente
virulenta. Esta aseveración fue corroborada por los ensayos de infección
experimental en conejos. El carácter virulento de la cepa se evidenció por un
intenso prurito en la zona de inoculación, con la aparición de una lesión rezumante
serosanguinolenta entre las 6 y 24 horas previas a la muerte. La misma
aconteció en tiempo promedio, a las 62 y 120 horas p.i., dependiendo de la
dosis viral inyectada. En todos los casos la tasa de mortalidad fue del 100%,
aun trabajando con cantidades menores de virus (102 UFP), indicando
ausencia de dosis-respuesta.

Los métodos empleados
fueron útiles como marcadores de virulencia para la cepa RC/79 y se constituyen
en herramientas indispensables para el diagnóstico de la enfermedad de
Aujeszky, disponibles en nuestro laboratorio y posibles de contemplar por las
autoridades nacionales cuando establezcan un plan sanitario para esta
patología.

Palabras claves: Virus Aujeszky, cepa RC/79,
marcadores de virulencia, inmunohistoquímica.

SUMMARY: Referential
diagnostic techniques to analyze virulence markers of pseudorabies virus RC/79
strain: preliminary assays"

The indirect
immunoperoxidase and immunofluorescence methods were standardized for the
detection of Aujeszky's disease virus in Vero cell cultures, using as a model
the RC/79 strain virus."

There was a strong
correlation in the results obtained by both methods. The results proved to be
highly specific for the identification of the virus and allowed a precise
localization of the viral antigen in infected cells. The presence of syncytia
with a strong reaction in the nuclear region 16 hours p.i. indicated that RC/79
strain is strongly virulent. This conclusion was supported by the results
obtained from experimental rabbit infection. The animals were inoculated with
different doses of the virus (102-105 PFU). In all the
cases the mortality rate was 100%, even when animals received minor doses of
the virus, indicating no dose response. The mean death time was 62 and 120
hours p.i. for the different doses used. Between 6 and 24 hours prior to death,
all rabbits presented an exudative lesion in the inoculation area and extensive
pruritus.

The methods employed were
useful as virulence markers of the RC/79 strain virus and on the other hand,
they constitute essential tools in the diagnosis of Aujeszky's disease virus.

Key words: Aujeszky's virus, RC/79 strain,
virulence markers, immunohistochemistry.

INTRODUCCION

La enfermedad de Aujeszky
(EA) o su sinónimo, pseudorrabia, es una enfermedad infecciosa de etiología
viral que con muy pocas excepciones es aguda, caracterizándose por producir
alteraciones en el SNC y trastornos reproductivos y respiratorios. En la
naturaleza la infección ocurre más a menudo en el cerdo, su huésped natural, así
como en ganado vacuno, ovejas, perros y gatos (Baskerville y col., 1973). Todas
las especies son huéspedes terminales en la cadena epidemiológica ya que
siempre mueren, a excepción del cerdo, donde la tasa de mortalidad varía
dependiendo de la edad (Akkermans, 1963). El cerdo es el eje fundamental en la
epizootiología de la EA, ya que si se recupera de esta afección, permanece
latentemente infectado y es el principal reservorio y diseminador del virus
(Beran y col., 1980).

Desde el primer diagnóstico
de pseudorrabia en Argentina en 1978 (Ambrogi y col. 1981), se ha mostrado una
incrementada incidencia de la enfermedad en las principales cuencas de
producción porcina nacional (Echeverría y col., 1989, Pereyra y col., 1989;
Zanon y col., 1991).

Ante esta realidad y no
habiéndose establecido aún, a nivel oficial, un plan de lucha apropiado contra
la enfermedad, se hace necesario realizar investigaciones epidemiológicas. Las
mismas son parte integral de los programas de control que pudieran
implementarse y que requieren de medios efectivos para la identificación de
cepas de virus de la pseudorrabia que pudieran aislarse. Por otra parte,
cualquier laboratorio que forme parte de la estructura de un programa de
control de la enfermedad necesitar· contar con herramientas diagnósticas
estandarizadas.

En este estudio hemos
intentado poner a punto los métodos diagnósticos referenciales (técnicas
inmunohistoquímicas indirectas: inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia y la
inoculación de conejos) para la identificación del virus de la EA y hemos
evaluado la utilidad de las mismas como marcadores de virulencia para la cepa
RC/79 del virus de la pseudorrabia.

MATERIAL Y METODOS

Virus. La cepa viral RC/79 de la EA
aislada por primera vez en la Argentina (Ambrogi y col., 1981) fue utilizada
para la inoculación en conejos y sirvió como antígeno para las técnicas
inmunohistoquímicas. El título del stock viral fue de 109 UFP/ml determinado
sobre monocapas de células Vero por el método de placas de lisis
(Dulbecco,1962).

Animales de
experimentación. Se
utilizaron 8 conejos hembras New Zealand blancos (Oryctolagus cuniculus) de 1.4
a 2.3 kg de peso y 1.5 a 2.5 meses de vida, provistos por el Bioterio Central
de la Universidad Nacional de Río Cuarto.

Ensayos de
patogenicidad. Para
determinar la virulencia de la cepa RC/79 en conejos los mismos fueron
inoculados con 1 ml de la suspensión viral en medio de mantenimiento (medio
esencial mínimo de Eagle, suplementado con 2% de suero fetal bovino, 30 µg/ml
de gentamicina y 1% de glutamina, pH 7.2-7.4) (MEM). La inoculación se realizó
por vía subcutánea en el flanco dorsal inferior.

Para analizar la influencia
de la dosis viral sobre la respuesta clínica, tres de los animales recibieron
102 UFP/ml, los cinco restantes fueron inoculados con 105
UFP. La observación de los síntomas se extendió todo el tiempo que el ensayo lo
permitió, no superando las 120 postinoculación (p.i.) en promedio.

Todos los animales fueron
mantenidos en las salas del bioterio a temperatura ambiente en jaulas individuales.

Cultivos celulares. Para las técnicas
inmunohistoquímicas fue utilizada la línea celular Vero, pasaje 35, procedente
del ABAC (Asociación Banco Argentino de Células, ciudad de Pergamino). Las
monocapas celulares fueron desarrolladas con MEM suplementado con 8% de suero
fetal bovino, en policubetas de 24 orificios sobre laminillas de vidrio y
recibieron una dosis viral de 103 UFP/ml.

Antisueros. El suero específico antivirus Aujeszky
cepa RC/79 fue obtenido de cerdos naturalmente infectados, provenientes de
un establecimiento porcino con antecedentes de infección por dicha cepa y
con alto título de anticuerpos neutralizantes, determinado por microseroneutralización
(Hill y col., 1977).