Técnicas diagnósticas de referencia para el análisis de marcadores de virulencia del virus pseudorrabia, cepa RC/79: ensayos preliminares (página 2)

Los anticuerpos secundarios
empleados en las reacciones fueron adquiridos comercialmente. Se utilizó suero
anti y globulina de cerdo marcada con peroxidasa, producido en cabra (Dako
Corporation) y suero anti g globulina de
cerdo, producido en conejo marcado con isotiocianato de fluoresceína (Dako
Corporation).

Detección del antígeno
viral. A las 4, 16,
24 y 36 horas luego de la inoculación de los cultivos celulares, los mismos
fueron lavados con solución salina bufferada (PBS) fijados con acetona fría,
secados al aire y cubiertos con suero antivirus Aujeszky diluido 1:20. Los
cultivos fueron incubados en cámara húmeda a 37º C por 60 minutos, lavados con
3 cambios de PBS + 1% de albúmina sérica bovina por 15 minutos y luego tratados
con el anticuerpo secundario.

Inmunoperoxidasa
indirecta (IPI).
Previo al desarrollo de la reacción las laminillas con células infectadas
fueron tratadas con H2O2 al 1% en PBS durante 30 minutos
a 37º C para remover la peroxidasa endógena celular.

El suero anti g globulina de cerdo marcado con peroxidasa se utilizó
diluido 1:200. Luego de 60 minutos de incubación a 37º C, las laminillas fueron
lavadas con PBS como se describió y se secaron. La actividad enzimática se
demostró tratando los cultivos durante 10 minutos con una solución al 0.05% de
3.3'-diaminobenzidina tetrahydrochloride (Fluka AG, Buchs SG) en buffer
tris-HCl, 0.05 M (pH 7.6) conteniendo 0.01% de H2O2. Las
laminillas fueron lavadas con agua destilada, deshidratadas y montadas con
bálsamo de Canadá. Las observaciones morfológicas fueron realizadas en
microscopio de luz. Los controles incluyeron cultivos celulares sin infectar
tratados de idéntica manera, cultivos infectados tratados con suero normal de
cerdo y cultivos infectados tratados solamente con la antiglobulina de cerdo
marcada con peroxidasa.

Inmunofluorescencia
indirecta (IFI).
Para esta reacción se siguieron pasos similares a los descritos en la técnica
anterior, sólo que el anticuerpo secundario estuvo marcado con el fluorocromo
indicado y la lectura se realizó montando las laminillas sobre portaobjetos con
glicerina al 10% en PBS. Se empleó para la lectura un microscopio de luz U.V.
(Carl Zeiss, Axiophot).

RESULTADOS

Infección experimental en
conejos. En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos de las pruebas de
inoculación en conejos. Los mismos fueron infectados con distintas
concentraciones de virus, las que variaron de 102 a 105
UFP/ml, no registrándose modificaciones en la respuesta clínica en esos rangos
ya que todos los animales murieron.

En cada uno de ellos se
observaron períodos de excitación nerviosa, durante los cuales se movían
violentamente dentro de las jaulas, seguidos de períodos de tranquilidad.
También se observó en cada animal un marcado prurito en el sitio de inoculación
que ocurrió entre las 6 y 24 horas previas a la muerte. Como consecuencia del
prurito se mordisquearon salvajemente en la zona de inyección, llevando a una
automutilación y haciendo que esa zona mostrara un contorno completamente
depilado, con abrasión cutánea y con un exudado serosanguinolento (figura 1).

Figura 1. Conejo inoculado subcutáneamente
con la cepa RC/79 del virus de pseudorrabia, que muestra depilación y abrasión
de la piel en el sitio de la inoculación. White rabbit subcutaneously
inoculated with pseudorabies virus RC/79 strain showing skin depilation and
abrasion at the inoculation site.

Los conejos que recibieron
menor dosis de virus tardaron en morir 120 horas p.i. en promedio, su tiempo
medio de muerte fue de 1.9 veces mayor que los 5 animales que recibieron 105
UFP y que murieron entre las 54 y 66 horas p.i.

Técnicas
inmunohistoquímicas indirectas. En la reacción de IPI, las monocapas teñidas 4 h p.i. no
mostraron cambios cuando se las comparó con los cultivos controles. Después de
8 h, un depósito marrón difuso indicando la presencia del antígeno viral
apareció en el núcleo de algunas células infectadas. En los estadios posteriores
el número de esas células se incrementó considerablemente y a las 16 h p.i. la
reacción positiva ocurrió también en el citoplasma (figura 2).

Figura 2. Cultivo celular infectado
examinado a las 16 h p.i. El antígeno viral determinado por inmunoperoxidasa
aparece en núcleo y en citoplasma (40 X). Tissue culture infected and examined
16 hours after infection. The viral antigen determined by immunoperoxidase
assay appears in the nucleus and cytoplasm of infected cells. X 40.

A las 24 h p.i. el antígeno
viral fue localizado principalmente en el citoplasma y muy pocas células
mostraron el antígeno en núcleo (figura 3).

Figura 3. Cultivo celular infectado
examinado 24 h p.i. El antígeno viral determinado por inmunoperoxidasa aparece
principalmente en citoplasma (20 X). Tissue culture infected and examined 24
hours after inoculation. The viral antigen, determined by immunoperoxidase
assay, appears mainly in the cytoplasm. X 20.

Los cultivos controles sin
infectar no mostraron tinción de fondo inespecífica, indicando que la
eliminación de la peroxidasa endógena fue efectiva (figura 4). Los controles de
células infectadas tratadas con el suero normal de cerdo mostraron un fondo de
tinción inespecífica que fue fácil de distinguir de lo observado en las células
infectadas (figura 5).

Figura 4. Cultivo celular sin infectar. No
se detectó producto de reacción (40 X). Uninfected cell culture. No reaction
product is detected. X 40.

Figura 5. Cultivo celular infectado tratado
con suero normal de cerdo. No se detectó producto de reacción (20 X). Infected
cell culture treated with normal pig serum. No reaction product is detected. X
20.

Un análisis comparativo de
los resultados logrados entre la IPI y la IFI permitió observar una fuerte
correlación entre ambas técnicas. La figura 6A muestra la presencia del
antígeno viral a las 16 h p.i.; la fluorescencia fue detectada tanto en núcleo
como en citoplasma; en esa imagen es posible ver la presencia de células
multinucleadas o sincitios con marcada tinción intranuclear. El examen de
antígenos virales a las 24 h p.i. en los cultivos infectados, permitió
detectarlos principalmente en citoplasma , como puede verse en la figura 6B.

Figura 6. A) Cultivo celular infectado
examinado 16 h p.i. El antígeno viral, detectado por inmunofluorescencia,
aparece en núcleo y en citoplasma (20 X). Nótese la presencia de células
multinucleadas (sincitios). B) Cultivo celular infectado examinado 24 h p.i. El
angíteno viral, detectado por inmunofluorescencia, aparece principalmente en
citoplasma (20 X). A) Tissue culture infected and examined 16 hours after
infection. The viral antigen detected by immunofluorescence assay appears in
the nucleus and cytoplasm. X 20. Note syncytia, resulting from cell fusion. B)
Tissue culture infected and examined 24 hours after infection. The viral
antigen detected by immunofluorescence assay appears mainly in the cytoplasm. X
20.

Los cultivos controles sin
infectar no dieron muestra de reacción específica. Idénticos resultados se
lograron cuando los cultivos infectados fueron tratados con suero normal de
cerdo.

DISCUSION

Pruebas de inoculación
en conejos. Si se
observa con precisión el proceso clínico de la enfermedad y las circunstancias
enzoóticas, junto con el examen detallado de las lesiones anatómicas e
histopatológicas, puede ya establecerse el diagnóstico de la EA en la mayoría
de los casos. En los exámenes de rutina, la identificación histológica de los
cuerpos de inclusión intranuclea-es patognomónicos insume demasiado tiempo, puesto
que hace necesario la obtención de cortes por inclusión en parafina. La
identificación directa del agente etiológico por medio de la
inmunofluorescencia directa es también posible en la EA, pero exige un
contenido vírico de aproximadamente 103-104 DI50/g
de tejido (Albrecht y col., 1963; Sabó y Rajcani, 1970). Ante estas
circunstancias, en el intento de diagnóstico en el menor tiempo posible, se
utilizan como ideales las inoculaciones experimentales en conejos. Ciertamente
la inyección de conejos por vóa subcutánea con una suspensión de tejido animal,
sospechoso de contener virus Aujeszky, fue descrita por los primeros
investigadores de esta enfermedad de una manera muy empírica (Aujeszky, 1902;
Hutyra, 1910; Koves y Hirt, 1934; Shope, 1934), informándose la elevada
receptividad de estos animales al virus de la EA, con manifestación de prurito
característico y la aparición de una lesión rezumante en el flanco, tras la
inoculación.

En un intento de
caracterizar al virus de la pseudorrabia (VPR), Platt y col. (1979) trabajaron
con 11 cepas americanas aisladas a campo y 2 cepas vacunales europeas, basando
el análisis en la sensibilidad térmica de las mismas y en la virulencia en
conejos. Las cepas virales fueron subsecuentemente categorizadas en uno de 3 grupos
de acuerdo a su termoestabilidad (resistentes al calor, moderadamente
resistentes al calor y termosensibles); y en 3 grupos de acuerdo a su habilidad
para infectar clínicamente a conejos, su habilidad para producir prurito y el
tiempo requerido para matarlos. En esta última categoría las cepas podían ser
de tipo I cuando la tasa de infección clínica fue menor del 25%, de tipo II
cuando no producían prurito y el tiempo medio de muerte (TMM) fue mayor de las
78 horas p.i. y de tipo III o fuertemente virulentas, cuando producían prurito
y el TMM fue menor a las 66 horas p.i. Estos autores demostraron que la
cinética de inactivación térmica y los parámetros usados para comparar VPR en
conejos pueden ser usados para diferenciar efectivamente cepas atenuadas de
aislados de VPR a campo, facilitando las investigaciones epidemiológicas. Entre
los virus estudiados se encontraban las cepas atenuadas K y BUK, las que
mostraron ser altamente resistentes al calor y en relación a su capacidad para
infectar clínicamente a conejos, cayeron en las categorías I y II,
respectivamente. Estos resultados fueron contrapuestos a los que lograron con
la cepa virulenta Be (entre otras de las cepas virulentas estudiadas) que
evidenció una tasa de 100% de mortalidad en conejos y mostró ser termosensible.
De los ensayos de Platt y col. (1979) se desprende que cuando una cepa es
fuertemente virulenta genera todos los síntomas clínicos descritos en los
conejos y muestra a su vez ser sensible a la acción del calor.

En este estudio hemos
mostrado que la cepa RC/79 generó el 100% de mortalidad en conejos confirmando
su carácter de cepa virulenta, tal como fue considerada desde su primer
aislamiento avalado por los antecedentes de haber generado el 80% de mortalidad
en lechones (Ambrogi y col., 1981). El carácter virulento de la cepa RC/79 está
apoyado a su vez por la ausencia de dosis respuesta cuando los animales fueron
inoculados con 102 a 105 UFP, ya que trabajando con dosis
menores de virus lo único que se modificó fue el tiempo medio de muerte, pero
en todos los casos la letalidad en conejos fue del 100% (tabla 1).

Por otra parte, en estudios
previos realizados con la cepa RC/79, hemos demostrado que la mis-ma es
sensible a la acción del calor y la tripsina (Sabini y col., 1995). Por la
asociación de esos datos con los obtenidos en este ensayo de infección en
conejos, se puede aseverar que la cepa RC/79 es fuertemente virulenta y
concordarían con los resultados obtenidos por Platt y col. (1979).

El marcador
"conejo" puede servir en estudios epidemiológicos facilitando el
diagnóstico de la pseudorrabia, permitiendo distinguir cepas virulentas de
atenuadas, constituyéndose en una herramienta útil para analizar aislados
virales naturalmente atenuados que se puedan usar como agentes vacunales y/o
para monitorear el grado de atenuación de cepas virales que sufran
modificaciones de laboratorio.

Hay que destacar que
ciertos autores (Gordon y Luke 1955; Christov y col., 1966) han descrito que
puede haber cepas del virus de la EA que ocasionaron alta mortalidad a campo,
pero que no producen prurito en conejos cuando son inoculados
intracerebralmente o subcutáneamente a menos que hayan sufrido 2 ó3 pasajes.
Esta aseveración reafirma el hecho de que la cepa RC/79, al generar los
síntomas de prurito y muerte con sólo un pasaje subcutáneo en conejo y con
dosis menores de virus (102 UFP), es fuertemente virulenta.

Con estas experiencias,
además de caracterizar la cepa viral en cuestión, hemos puesto a punto una
herramienta diagnóstica valiosa, disponible en nuestro laboratorio y posible de
aplicar en un programa de control y/o erradicación de la EA. Se ha informado
que los conejos no son más sensibles que los cultivos celulares a la presencia
del virus (McFerran y Dow, 1962), pudiéndoselos usar para el aislamiento de
cepas virales a campo, aunque por razones humanitarias debería ser restringido
su uso para aquellos laboratorios carentes de las disponibilidades de los
cultivos de células. Nuestro laboratorio por contar con esta infraestructura,
en este mismo ensayo ha implementado técnicas diagnósticas inmunohistoquímicas.

Reacción de
inmunoperoxidasa.
Como se evidencia en los resultados mostrados, el método de inmunoperoxidasa
indirecta muestra ser una reacción específica para la identificación de
antígenos del virus de la EA en cultivos celulares. Los resultados obtenidos en
este ensayo son similares a los logrados por Albrecht y col. (1963), Roszkowski
y Bartoszcze (1978), cuando desarrollaron las técnicas de inmunoperoxidasa
directa y la de anticuerpos fluorescentes, respectivamente. Sin embargo, el
método de la inmunoperoxidasa indirecta da una reacción más fuerte en la
demostración histoquímica de la enzima, por ser una reacción amplificada y facilita
una localización más precisa del antígeno en las células infectadas cuando se
la compara con el método directo. Por otra parte, nuestros resultados se
condicen exactamente con los logrados por Bartoszcze y Roszkowski (1979), con
la diferencia de que estos autores emplearon en sus ensayos una dilución 1:5
del anticuerpo secundario, mientras que en nuestras experiencias la dilución
elegida fue de 1:200. Esto indicaría que si se aplica la técnica como
herramienta diagnóstica para laboratorios de referencia, le significaría al
mismo un mayor aprovechamiento de los reactivos y un menor costo por
diagnóstico realizado.

Hemos intentado analizar,
por otra parte, la utilidad de las técnicas inmunohistoquímicas como
indicadoras de virulencia para la cepa de VPR RC/79.

Desde un punto de vista
práctico, para diferenciar cepas atenuadas de virulentas, el conocimiento de
los marcadores genéticos de virulencia es muy importante. Sin embargo en
relación a las cepas de VPR muchos de esos marcadores aún hoy no están muy bien
definidos. Así por ejemplo, no se ha encontrado que exista relación entre la
virulencia de las cepas con el tamaño de las placas de lisis o con la habilidad
para reproducirse a altas temperaturas (Zuffa y Grigelov·, 1966). Es conocido,
como se dijo, que las cepas virulentas causan prurito en la zona de inoculación
en los conejos, seguido de muerte (Skoda y col., 1964; Petrovic, 1967) y que
las mismas, puestas en cultivos celulares de variados orígenes, conducen a la
formación de sincitios, esto es células mutinucleadas, a diferencia de las
cepas atenuadas que sólo generan redondeamiento celular (Tokumaru, 1957;
Bartha, 1961; Lomniczi, 1974). En relación a las técnicas inmunohistoquímicas
(Zuffa y col., 1968) establecieron por inmunofluorescencia que en caso de cepas
atenuadas el antígeno viral puede ser visto principalmente en el citoplasma de
las células infectadas, mientras que las cepas virulentas muestran la
fluorescencia a nivel nuclear. En nuestros resultados hemos mostrado que la
presencia del antígeno viral se observa, dependiendo del tiempo p.i., tanto en
núcleo como en citoplasma, y es posible ver la formación de sincitios con
intensa marca fluorescente en la región nuclear (figura 6A). Esto indica una
vez más que la cepa RC/79, según los criterios descritos, es fuertemente
virulenta, permitiéndonos concluir que las técnicas empleadas se constituyen en
herramientas útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Aujeszky, así como
para caracterizar biológicamente cualquier aislado viral a campo.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado
por subsidio otorgado por la Secretaría de Ciencia y Técnica (SECyT) de la
Universidad Nacional de Río Cuarto, partida 477 y por CONICOR. Agradecemos
tambien al coordinador general del Bioterio Central de la Universidad Nacional
de Río Cuarto, Sr. Víctor Saldaño, por su generosa colaboración en el cuidado
de los animales.

BIBLIOGRAFIA

AKKERMANS, J.P.W. 1963.
Aujeszky's disease in swine in the Netherlands. Rotterdam: Central
Diergeneeskundig Instituit, Abstracted in Vet. Bull 33: 497.

ALBRECHT, P., D.
BLASKOVICH, L. JAKUBIK, J. LESSO. 1963. Desmonstration of pseudorabies virus in
chick embryo cell cultures and infected animals by the fluorescent antibody
technique, Acta Virol. Prague. 7: 289-296.

AMBROGI, A., J.A. GIRAUDO,
J.J. BUSSO, O. BIANCO, E. BAGNAT, M. SEGURA DE ARAM-BURU, B. RAMOS, F.
CERIATTI. 1981. Primer diagnÛstico de Ia enfermedad de Aujeszky en cerdos en la
República Argentina, Gat. Vet. Buenos Aires. Tomo XLII, Nº 357: 58-64.

AUJESZKY, A. 1902. Ueber
eine neue Infektions Krankheit bei Haustieren, Zentr. Bakt. Parasitkde Abt.
I. Orig. 32: 353-357.

BARTHA, A. 1961. Attempts
at attenuating the virulence of Aujeszkyís disease virus (in Hungarian), Magy
Allatorv. Lap. 16: 42-45.

BARTOSZCZE, M., J.
ROSZKOWSKI. 1979. The use of the indirect immunoperoxidase method for the
detection of Aujeszkyís disease virus in cell culture, Zbl. Vet. Med. 26:
253-256.

BASKERVILLE, A., J.B.
MCFERRAN, C. DOW. 1973. Aujeszky's disease in pigs, The Vet. Bull. 43:
465-480.

BERAN, G.W., E.B. DAVIES,
P.V. ARAMBULO. 1980. Persistence of Pseudorabies virus in infected swine, J.
Am. Vet. Med. Assoc. 176: 998-1000.

CHRISTOV, S., N. PAVLOV, I.
KARADJOV, B. BELTCHEV, I. DELTCHEV. 1966. Enzooties d'encéphalomyélite aigu chez
des veaux nouveanu-nés causées par le virus de la maladie d'Aujeszky, Bull.
Off. Int. Epizoot. 65: 1247-1264.

DULBECCO, R. 1962.
Production of plaques in mo-nolayer tissue culture by single particles of an
animal virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 38: 747-752.

ECHEVERRIA, M.G., E.O.
NOSETTO, E.J. GIMENO, C.M. GALOSI, N.B. PEREYRA, R.D. FON-ROUGE, M.E.
ETCHEVERRIGARAY. 1989. Pseudorrabia (enfermedad de Aujeszky) en cerdos:
estudios seroepidemiológicos. V Reunión Anual de la Asociación Argentina de Veterinaria
de Laboratorio de Diagnóstico. Río Cuarto.

GORDON, W.A.M., D. LUKE.
1955. An outbreak of Aujeszkyís disease in swine with heavy mortality in
piglets, illnes in sows, and deaths in utero, Vet. Rec. 67: 591-597.

HILL, H.T., R.A. CRANDELL,
CH.L. KANITZ, J.R. MC ADARAGH, G.E. SEAWRIGHT, R.F. SOLORZANO, W.C. STEWART.
1977. Recommended minimum standards for diagnostic test employed in the
diagnosis of Pseudorabies (Aujeszky's disease). Amer. Assoc. Vet. Lab.
Diag-nos. 20th Annual Proceeding 375: 390.

HUTYRA, F. 1910. Beitrag
zur Atiologie der infektiösen Bulbärparalyse, Bert. Munch. Tierärztl. Wschr.
26: 149-151.

KOVES, J., G. HIRT. 1934.
Über die Aujeszkysche Krankheit der Schweine. Arch. wiss. prakt. Tierheilk.
68: 1-23.

LOMNICZI, B. 1974. Biological
properties of Aujeszky's disease (Pseudorabies) virus strains with special
regard to interferon production and interferon sensitivity, Arch. ges.
Virusforsch. 44: 205-214.

MCFERRAN, J.B., C. DOW.
1962. Growth of Aujeszky's disease virus in rabbits and tissue culture, Br.
vet. J. 118: 386-389.

PEREYRA, M.O., N.B.
PEREYRA, F.D. CANE. 1989. Situación de la enfermedad de Aujeszky en Chañar
Ladeado. V Reunión Anual de la Asociación Argentina de Veterinaria de
Laboratorio Diagnóstico. Río Cuarto.

PETROVIC, M. 1967.
Comparative study on biological properties of some field strains and a vaccine
strain of Aujeszky's disease virus (in Srbocroatian), Acta Vet. (Beogr.) 17:
335-343.

PLATT, K.B., C.J. MARE,
P.N. HINZ. 1979. Differen-tiation of vaccine strains and field isolates of
Pseudorabies (Aujeszky's disease) virus: Thermal sensitivity and rabbit
virulence markers. Arch. Virol. 60: 13-23.

ROSZKOWSKI, J., M.
BARTOSZCZE. 1978. Use of immunoenzyme technique for the detection of Aujeszky's
disease virus in cell culture, Vet Rec. 102: 462-463.

SABINI, L.I., F.S.
CERIATTI, B.A. RAMOS, S.M. ZANON. 1996. Sensibilidad al calor y la tripsina del
virus Herpes suis, cepa RC/79. Arch. Med. Vet. 28: 159-163.

SABO, A., J. RAJCANI. 1970.
Rapid diagnosis of Aujeszky's disease by the fluorescent antibody technique, Acta
Virol. Prague 14: 475-484.

SHOPE, R.E. 1934.
Pseudorabies as a contagious disease in swine, Science 80:102-103.

SKODA, R., I. BRAUNER, E.
SADECKY, V. MAYER. 1964. Immunization against Aujeszky's disease with live
vaccine. I. Attenuation of virus and some properties of attenuated strains, Acta
Virol. 8: 1-9.

TOKUMARU, T. 1957.
Pseudorabies virus in tissue culture: differentiation of two distinct strains
of virus by cytopathogenic pattern induced, Proc. Soc. exp. Biol. (N Y.)
96: 55-60.

ZANON, S.M., S.G. BETTERA,
L.I. SABINI, A. AMBROGI, F.S. CERIATTI, H. GABOSI, B.A. RAMOS. 1991. Relevamiento
seroepidemiológico para el virus de la enfermedad de Aujeszky en piaras de la
región de Río Cuarto (provincia de Córdoba, Argentina), Revista de Medicina
Veterinaria del Uruguay 27: 14-16.

ZUFFA, A., K. GRIGELOVA.
1966. Immunisierung gegen die Aujeszkysche Krankheit. II. Studium der
Zytopathogenität und Plaquenmorphologie verschiedener Virusstämme bezüglich
ihrer Virulenz für Schweine, Arch. exp. Vet. Med. 20: 127-140.

ZUFFA, A., J. MATIS, V.
PLEVA. 1968. Studies on several strains of Pseudorabies (Aujeszky) Virus
showing different virulence by means of the immuno- and acridine orange
fluorescence, Arch. ges. Virusforsch. 24: 396-405

L.I. SABINI1,
Dr. Cs. Biol.; F.S. CERIATTI1, Dr. Cs. Biol.; G. BAGNIS2,
M.V.; S.M. ZANON1, Lic. Biol.; V. MARTIN2, M.V.; M.
ROVERA1, Lic. Biol.; B.A. RAMOS1, Dr. Quim. Farm.
1Departamento de Microbiología e Inmunología de la Facultad de
Ciencias Exactas Físico-Químicas y Naturales, Universidad Nacional de Río
Cuarto, Ruta Nacional Nº36, km 601 (5800) Río Cuarto, Córdoba, Argentina. T.E.
(058) 676113. Fax 058-680280.
2Departamento de Patología Animal de la Facultad de Agronomía y
Veterinaria, Universidad Nacional de Río Cuarto.