Cultivo de células aplicados a bioinsecticidas

En la actualidad el uso de tecnologías que sean
amigables con el medio ambiente representan una alternativa
importante para mitigar el daño ambiental, en esto es que
el ser humano entra a ser una pieza fundamental en la
implementación y desarrollo de dichas
tecnologías.

Como es de saber muchas de las prácticas humanas
degradan en cierta medida al medio ambiente, ejemplo claro de
esto lo vemos reflejado en la agricultura, donde no solo se da un
impacto a la diversidad si no que también se envenena con
plaguicidas a el ambiente todo gracias a las malas practicas
agrícolas que se acostumbran a utilizar.

Para esto se busca desarrollar técnicas donde se
reemplacen dichos insecticidas químicos los cuales atacan
tanto plagas como animales benéficos para las plantas
(polinizadores), también acaban con la vida del suelo
atacando baterías que se encuentran allí
también, y que pueden de la misma forma causar graves
daños en la salud de los humanos.

Por todo lo anteriormente mencionado se emplea el
estudio y desarrollo de bioinsecticidas para reducir el impacto
al entorno, buscando el control de plagas de forma
biológica para lo cual existe una larga lista de especies
de hongos y bacterias que controlan insectos
plagas. Bacillus thuringiensis es el
microorganismo más conocido y de más trayectoria en
aplicaciones agrícolas, mientras que especies de hongos
como Entomophthora
virulenta y Verticillium
lecanii pertenecen a un grupo de productos comerciales
más recientes pero de rápido crecimiento en los
mercados internacionales. Bacillus
thuringiensis destaca por su alto grado de toxicidad
para los insectos por lo cual sus llamados cry genes que
codifican delta-endotoxinas se han introducido en diversas
plantas genéticamente modificadas. Las nuevas generaciones
de productos biológicos a base de hongos
entomopatógenos infectan los insectos sin la necesidad de
que sean ingeridos como en el caso de Bacillus
thuringiensis.

Microorganismos entomopatógenos sorprenden
a los insectos con nuevas toxinas y maneras de atacar y
matarlos mientras que los insectos adquieren resistencias o
demuestran cambios en el comportamiento para evadir la
acción letal. El resultado de esta carrera evolutiva es
una gran variedad de cepas de hongos y bacterias con propiedades
de control muy específicas. 

Hasta la fecha solamente para Bacillus
thuringiensis se han reportado casos de resistencia
provocados por el uso de bioinsecticidas. Esta es una
razón importante por la cual los microorganismos
entomopatógenos constituyen una alternativa viable para
los insecticidas químicos. Su uso está creciendo
rápidamente dado que los bioinsecticidas
no dañan al agricultor, consumidor o al medio
ambiente.

A continuación se mostraran una serie de estudios
realizados donde se utilizaron cepas de microorganismos
entomopatógenos en distintas condiciones con el fin de
medir su capacidad insecticida.

Cultivos de
células en suspensión de Azadirachta indica para la
producción de bioinsecticidas

A. indica (árbol del neem) es originario
de las zonas áridas de India, Pakistán y
África, donde se ha cultivado por miles de años. Su
actividad bioinsecticida representa un interés particular
para el control de insectos plaga, en este sentido la
azadiractina (Aza) es reconocida como el compuesto activo
más importante. Sin embargo, existen limitaciones
agroclimáticas para su producción tradicional a
partir de semillas, por lo que su producción a partir de
cultivos de células vegetales in vitro surge como
una alternativa promisoria. En el presente documento se presenta
una revisión de los usos del árbol del neem, los
metabolitos secundarios que produce y del estado que guarda el
conocimiento sobre el cultivo de las células de A.
indica. Además se identifican las estrategias usadas
para mejorar el crecimiento y la producción de
Aza.

Las sustancias producidas por el neem afectan algunos
ostráceos y entre 400 y 500 especies de diferentes
órdenes de insectos, entre los cuales se incluyen
Blattodea, Caelifers, Dermaptera, Diptera, Ensifera, Hetroptera,
Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Phasmida, Phthiraptera,
Siphonoptera y Thysanoptera. Estas sustancias tienen un efecto
repelente, antialimentario e insecticida sobre especies
herbívoras, el modo de acción es dependiente de la
dosis y de la especie.

A. indica produce más de 300 metabolitos
secundarios, un tercio de los cuales son tetranortriterpenoides
(limonoides) de interés comercial y científico por
sus efectos biológicos. Muchas de sus aplicaciones se
basan en el conocimiento empírico, es decir, se realizan
sin identificar los ingredientes activos, tal como se
presentó en la sección anterior.

Actualmente existen más de 300 patentes
relacionadas con A. indica.

La Aza es uno de los metabolitos principales utilizado
especialmente para el control de insectos. Además de la
Aza, se reporta que el meliantrol y el salanin hacen que los
insectos dejen de alimentarse. El nimbin y nimbidin poseen
actividad antiviral. El deactilazadiractinol, se encuentra en
menor concentración, funciona como antihormona y paraliza
el sistema digestivo del insecto. El 3-deacetilsalanin y el
salanol, están relacionados químicamente con el
salanin y también son antialimentarios.

La Aza es efectiva contra cerca de 200 especies de
insectos, no afecta a los mamíferos o a los animales que
consumen estos insectos, ni tampoco a los insectos útiles
para la polinización o que son benéficos para la
planta.

En este trabajo, se presenta el estado del conocimiento
del desarrollo del cultivo de células de A.
indica y se analizan las estrategias usadas para mejorar el
crecimiento y la producción de Aza. Se destacan los
estudios del uso de agentes permeabilizantes de la membrana
celular para liberar la Aza intracelular, la adición de
precursores biosintéticos, los efectos del régimen
de luz, la temperatura y la formulación de medios. A nivel
de biorreactores, el tanque agitado se destaca como la
configuración más reportada y los estudios abordan
la evaluación de impulsores y la posibilidad de
operación en un régimen por lote alimentado. Las
productividades calculadas de los reportes, muestran una
transferencia de los cultivos de matraces a biorreactor
satisfactoria tecnológicamente y permiten vislumbrar el
escalamiento futuro de los cultivos de células de A.
indica para la producción de un
bioinsecticida.

El uso de agua de
mar como fuente de sales en los medios de cultivo a base
almidón de soja y frijol, para la producción de
bioinsecticidas Bacillus thuringiensis

Con el fin de reducir el costo de producción de
Bacillus thuringiensis bioinsecticida, un nuevo medio
único compuesto de almidón, soja y agua de mar
diluida, sobre todo proporcionando 7,5 g / l de NaCl, se ha
optimizado. Los resultados obtenidos con los cultivos realizados
en 1000 matraces agitados ml mostraron un 7% de mejora de la
producción de delta-endotoxina en el medio barato, en
comparación con la que contiene una mezcla de minerales
puros en lugar de agua de mar. Curiosamente, este nuevo medio
formulado ha demostrado ser eficiente para la producción
de delta-endotoxina por varias cepas de B. thuringiensis
mostrando las diversas actividades larvicida hacia
dípteros o lepidópteros. Por otra parte, el uso de
tal medio para la producción a gran escala de
bioinsecticidas se evidenció también en un sistema
automatizado completo fermentador controlado. Para lo que se
demostró que el agua de mar no afecta tales requisitos y
tienen un efecto positivo sobre el crecimiento, la
esporulación y la síntesis de la delta-endotoxina.
Esto debería contribuir a una reducción
significativa de la costo de B. thuringiensis
bioinsecticida producción y utilización.

Se demostró que esta cepa podría crecer
fácilmente en grandes amplia gama de sustratos, gracias a
sus enzimas hidrolíticas propias. Por lo tanto, para
formular nuevas bioinsecticidas de producción barata los
medios de cultivo que podrían ser utilizados en todo el
mundo, la glucosa y la papilla es eficiente sustituido por el
almidón de la calidad comercial en el medio complejo
previamente optimizado. Por otra parte, el pescado fue sustituido
por la soja que tiene origen vegetal. En cada
concentración de almidón, se debe tomar en cuenta
el mejor equilibrio entre la producción delta-endotoxina y
el rendimiento de la síntesis de la toxina en
relación con las células en esporulación. De
hecho, con altas concentraciones de soja, en relación con
el rendimiento de la síntesis de la toxina se redujo
debido a la alta producción de biomasa. La principal
limitación de la producción de bioinsecticida que
es la regulación represiva de síntesis
delta-endotoxina, causada por una mayor concentración de
fuentes de carbono, fue significativamente menor expuesto en base
de almidón medio que en la glucosa o de los medios de
comunicación basada en papilla. Esta es, probablemente,
debido a las diferencias en las tasas de asimilación de
almidón por la creciente de células. Por otro lado,
el agua de mar que contiene la mayoría de los minerales
(NaCl, MgSO4, MnSO4, FeSO4, etc), sumado a B.
thuringiensis producción de bioinsecticida-medios de
cultivo, sustituido perfectamente la oferta individual de todos
los minerales en el medio de cultivo. Curiosamente, con el uso de
agua de mar actividad proteolítica producida
concomitantemente con delta-endotoxina, se reduce
considerablemente. Esto mejoraría la calidad de
bioinsecticidas, ya que las proteasas pueden afectar la
estabilidad de las proteínas de cristal de
insecticidas.

Caracterización molecular de una cepa
Colombiana de Bacillus thuringiensis con actividad frente a Tecia
solanivora (Lepidoptera: Gelechiidae)

La polilla guatemalteca de patata (Tecia
solanivora)(Lepidoptera: Gelechiidae), fue descrito por
primera vez en América Central y es el agente
entomológico mas importante de plagas que afectan a la
papa (Solanum tuberosum) en América Central y el
norte de América del Sur. El ataque de sus larvas a los
tubérculos, tanto en el campo y en el almacenamiento causa
perdidas que van desde 50 a 100%.

El control de plagas se hace generalmente por el uso
intensivo de productos químicos insecticidas, lo que puede
generar resistencia a los insectos y causar problemas asociados
con el medio ambiente.

Bacillus thuringiensis, es una alternativa
útil y un enfoque complementario en aplicaciones de
plaguicidas químicos en la agricultura
comercial.

Durante la esporulación, las células de
B. thuringiensis producen inclusiones cristalinas
herbáceas proteina-integrado por d-endotoxinas (llamados
cristales de proteína o proteínas Cry), que
específicamente matan las larvas de insectos. Cuando los
insectos ingieren los cristales proteicos,
el pH alcalino de su tracto
digestivo activa la toxina Cry, la cual se inserta en
el epitelio del intestino del insecto,
provocando poros en el epitelio. El poro causa una
lisis celular y la posterior muerte del insecto.

Cada tipo de toxina Cry tiene un único espectro
de actividad y se centra sólo en una pequeña gama
de especies de insectos. Dentro de este rango pequeño de
hospederos blanco, hay grandes diferencias en la potencia entre
las especies que suelen estar estrechamente
relacionados.

Con el fin de tener las mejores proteínas Cry
para el control de insectos y para prevenir o reducir la
aparición de resistencia de insectos a las actuales
d-endotoxinas disponibles, es importante identificar nuevas cepas
de B. thuringiensis que contienen proteínas Cry
con alta toxicidad frente a T. solanivora. Aunque, se ha
informado que la toxina Cry1Ac de B. thuringiensis
subsp. kurstaki es activo frente a este insecto, no se
sabe que proteína tóxica que es la más
específica y cual presenta mejor actividad frente a T.
solanivora.

En este estudio se reporta la identificación de
un nativo de B.thuringiensis cepa aislada en Colombia,
con actividad tóxica alta contra T. solanivora.
La cepa se caracterizó por secuenciación de los
genes y la inmunolocalización de la las proteínas
Cry en el insecto estado infectado. La disponibilidad de esta
cepa y los genes proporciona nuevas alternativas para el control
de este insecto y su uso como agentes de control de otras
plagas.

Para esto se toman once cepas de B.
thuringiensis aisladas en Colombia, con genotipos conocidos
anteriormente. El serotipo de B. thuringiensis kurstaki
cepa HD-1 se utilizó como control positivo. Las cepas
fueron suministradas por la Unidad de Biotecnología y
Control Biológico de la CIB. Las cepas fueron cultivadas
en medio M1 a 30 º C durante 48 h. Para solubilizar el
protoxinas esta cultura se centrifuga a 6000 rpm en una
centrífuga Sorvall-Kendro, durante 10 minutos, el
precipitado se resuspendió en 50 mM de NaOH, 10 mM EDTA y
se incuba a 30 º C durante 2 h. Esta solución se
centrifugó a 6000 rpm durante 15 min a 4º C y el
sobrenadante se recogió. La concentraciónde
proteínas totales de la protoxinas solubilizadas se
determinó por ensayo de Bradford usando albúmina de
suero bovino como estándar.

Entre los más importante de este trabajo se
destaca la presencia de dos genes de codificación nativa
para Cry1Ac24 y proteínas Cry2Aa13 que se han aislado y
caracterizado de la cepa de B. thuringiensis con elevada
actividad frente a uno de los más importantes plagas de
papa en el norte de América del Sur (T.
solanivora). Algunos cambios en los aminoácidos
podrían ser responsables de la elevada actividad frente a
T. solanivora. El aislamiento y la secuencia
análisis de estos genes representan un nuevo hallazgo para
aumentar el desarrollo del uso de proteínas Cry en
insecticidas biológicos. Este nuevo aislamiento de
B.thuringiensis en el futuro será esencial para
de encontrar alternativas óptimas para el control de este
insecto, disminuyendo así los problemas asociados con los
insecticidas químicos.

Establecimiento
de cultivo in vitro de Ipomoea intrapilosa y evaluación de
su actividad insecticida contra Trialeurodes vaporariorum
(Homóptera, Aleyrodidae)

Trialeurodes vaporariorum, conocida vulgarmente
como mosca blanca o mosca blanca de los
invernaderos, es una especie de insecto  que
habita en las regiones cálidas. Puede llegar a convertirse
en una plaga en muchos cultivos agrícolas de frutas,
hortalizas y plantas ornamentales, se encuentra frecuentemente en
invernaderos y en otras estructuras agrarias de protección
de los cultivos. 

Los extractos de semillas de Ipomoea
intrapilosa presentan actividad insecticida contra insectos
plaga de importancia en la agricultura. Como una alternativa
biotecnológica, en este trabajo se estableció el
cultivo de callos y células en suspensión de l.
intrapilosa y se evaluó la actividad insecticida de
los extractos orgánicos obtenidos de semilla y de los
cultivos in vitro contra mosquita blanca de los invernaderos
Trialeurodes vaporariorum (Homóptera,
Aleyrodidae).

El cultivo de callos se inició a partir de
explantes de hipocotilos y fue inducido en medio Murashige y
Skoog suplementado con ácido ocnaftalenacético
(ANA, 13.57 IJM) Y sacarosa (30 9 L-1), bajo fotoperiodo de 16 h
(iluminación de 32 W/m2) y a 25ºC. El cultivo de
células en suspensión se inició a partir de
la transferencia de tejido calloso a matraces, utilizando la
misma composición del medio de cultivo, a 25ºC en
agitación orbital (100 rpm), bajo iluminación
constante (32 W/m2). Se realizaron cinéticas de
crecimiento de los callos y de los cultivos en suspensión;
para los callos, se determinó que alcanzan la fase
estacionaria a los 37 días y tienen un índice de
crecimiento de 7.21; en tanto que las células en
suspensión requieren solamente 15 d, pero presentan
índice de crecimiento 6 veces menores. En los cultivos en
suspensión se evaluaron concentraciones de 60 y 150 9 PF
L-1• Al final, tanto índice de crecimiento como la
velocidad de crecimiento fueron superiores cuando el
inóculo fue de 60 9 PF L-1. Se caracterizó el
tamaño de las células individuales y de los
agregados celulares obteniéndose un valor de la mediana de
0.014 y 0.016mm2 respectivamente.

Respecto a las pruebas de toxicidad de los extractos, se
observó que la mayor mortalidad de T.
vaporariorum se presenta con los extractos hexánicos
y clorofórmicos de las semillas (72 y 70%
respectivamente). Además, los cultivos in vitro mantienen
la actividad insecticida registrándose el efecto
más alto con los extractos metanólicos de los
callos (68%). Particularmente, resulta importante que los tres
extractos evaluados de las células en suspensión,
mantuvieran un nivel de mortalidad alrededor del 40%.

Establecimiento
de cultivos in vitro de Ipomoea intrapilosa en luz y oscuridad
para la producción de sustancias con actividad insecticida
contra Spodoptera frugiperda, (Lepidóptera, Noctuidae),
plaga de interés agrícola

En el presente trabajo se reporta el efecto insecticida
de los extractos hexánicos, clorofórmicos y
metanólicos obtenidos de callos, generados a partir de
explantes de hipocotilo de Ipomoea intrapilosa, sobre larvas
neonatas de Spodoptera frugiperda (plaga de interés
agrícola). A partir de plántulas asépticas
provenientes de semillas se obtuvieron los callos en medio MS
adicionado con ANA 13.57 + cinetina 1.1 &µM y ANA 18.09
&µM, en condiciones de luz y oscuridad constante. En
condiciones de luz constante se obtuvieron callos de consistencia
compacta, mientras que los callos mantenidos en oscuridad fueron
blancos y de consistencia friable. Con relación a los
extractos, para callos obtenidos en luz y oscuridad constantes,
se encontró que la concentración de los
sólidos totales fue mayor en los metanólicos; sin
embargo, los hexánicos y clorofórmicos fueron los
que mostraron mayor actividad insecticida. En los callos
compactos, crecidos en luz constante, se observaron
células parenquimatosas isodiamétricas, sin
espacios celulares, elementos traqueales en formación,
restos de haces vasculares del explante original y segmentos de
pared secundaria. En el caso de los callos friables crecidos en
condiciones de oscuridad, se observaron de manera similar
células parenquimáticas, pero con abundantes
espacios intercelulares y con incipiente crecimiento de elementos
traqueales. Se concluye de manera general, que la actividad
bioinsecticida que presenta I. intrapilosa se mantuvo en los
callos obtenidos in vitro, bajo condiciones de luz y oscuridad.
No hubo diferencias notables en la estructura general de los
tejidos, la morfología celular permitió reconocer
que no hubo una rediferenciación clara de las
células, aunque con ANA 13.57 &µM se observaron
elementos traqueales de novo.

Perspectivas para
alterar rango de hospederos de baculovirus

Bioinsecticidas desarrollados a partir de los
patógenos de insectos específicos son alternativas
prometedoras a los insecticidas químicos, pero actualmente
sólo representan una pequeña parte del plaguicida
del mercado. Entre los más utilizados son insectos
específicos las toxinas de Bacillus turingiensis
(Bt), pero cada vez hay más interés en insecticidas
baculovirus. Una de las principales ventajas de bioinsecticidas
es su especificidad de huésped. Por el contrario a los
insecticidas convencionales que puedan dañar los
vertebrados o matar indiscriminadamente a los artrópodos,
que objetivo específico poblaciones de plagas de insectos.
Esta característica los hace compatible con el
clásico control biológico en la gestión
integrada estrategias de manejo de plagas y los hace
particularmente útil para controlar las plagas de insectos
en zonas sensibles áreas. A pesar de bioinsecticidas son
atractivos desde una perspectiva ambiental,
paradójicamente, su limitada especificidad de
huésped hace menos atractiva
económicamente.

Debido a los diferentes productos pueden ser necesarios
para controlar complejos de plagas de insectos, los costos para
los productores se aumento. Este problema podría ser
aliviado mediante el desarrollo de bioinsecticidas que el
objetivo específico complejos de plagas. La gama de
huéspedes de los virus es determinada por su capacidad
para entrar en las células y los tejidos de un organismo
huésped, se replican y den la liberación de nuevas
partículas de virus infeccioso.

Los baculovirus son un excelente recurso para el
desarrollo bioplaguicidas altamente específica. Se han
realizado progresos considerables para mejorar sus propiedades
insecticidas. Su velocidad de muerte ha aumentado
considerablemente, aunque son necesarias más odifiaiones.
Adicionalmente la tarea es elaborar insecticidas baculovirus
específicos para especies de plagas. Varios genes han sido
identificados en su especificidad de huéspedes.

Otro paso fundamental en este esfuerzo fue la
identificación de genes esenciales necesarios para la
expresión génica tardía y la
replicación del ADN baculovirus. La determinación
de las funciones de estos factores y sus interacciones con los
componentes celulares para apoyar la replicación del virus
proporcionará el marco para la comprensión de
especificidad de acogida del baculovirus. La capacidad de
baculovirus para superar las defensas del huésped es
también un factor importante de la amplia acogida como lo
demuestran las funciones de la apoptosis supresores. El desarme
de las defensas de insectos, tanto en el celular y los niveles de
organismos puede proporcionar un medio para modificar rango de
hospederos del baculovirus.

Para lograr su considerable potencial como
bioinsecticidas, es necesario, por lo menos no la
reducción de los costos de producción.

También es una necesidad aislar y estudiar las
especies de baculovirus con la especificidad de diferente
hospedador para su uso del desarrollo como cepa insecticida y
como un recurso adicional para estudios de rango de hospederos
del baculovirus y patogenia.

Crecimiento,
metabolismo y producción de baculovirus en cultivos en
suspensión de una línea celular del insecto
lepidóptero Anticarsia gemmatalis

Anticarsia gemmatalis Hübner (Lepidoptera:
Noctuidae) es una de las principales plagas defoliadoras
de los cultivos de soja en Latinoamérica. Este insecto es
efectivamente controlado con un baculovirus, el virus de la
poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia
gemmatalis (AgMNPV). Actualmente, la producción
comercial de AgMNPV está basada en la propagación
viral in vivo sobre larvas del insecto. Esta
tecnología ha demostrado ser robusta y
económicamente competitiva como para satisfacer los
requerimientos de este bioinsecticida hasta el presente. Sin
embargo, previsiones de una creciente demanda, y la posibilidad
de introducir baculovirus genéticamente modificados que no
se propaguen eficientemente en larvas, han estimulado el
interés por desarrollar procesos alternativos de
producción basados en la propagación viral in
vitro en cultivos de células de insecto. Una
característica relevante de estos procesos es que su
rendimiento económico mejora a medida que aumenta en
escala, haciéndolos atractivos para la producción
industrial de baculovirus. Además, un mejor control de
proceso y una calidad superior del producto son atractivos
adicionales de los procesos de producción de baculovirus
en cultivos celulares.

La selección de una línea celular
susceptible a la infección viral y capaz de producir
elevados rendimientos volumétricos de poliedros, el
fenotipo viral con propiedades insecticidas, es el primer
requisito para desarrollar un proceso factible para la
producción de un baculovirus insecticida en cultivos de
células de insecto. La replicación de AgMNPV ha
sido evaluada en diferentes líneas celulares. Del
análisis de esta información parece evidente que la
línea celular homóloga UFL-AG-286 exhibe una mayor
susceptibilidad a la infección y mayores niveles de
producción viral que el resto de las líneas
celulares evaluadas. Por lo tanto, la línea celular
UFL-AG-286 podría constituir un sustrato promisorio para
desarrollar un proceso industrial de producción
de

AgMNPV in vitro.

Con el objetivo de caracterizar las propiedades
tecnológicas de esta línea celular, y evaluar la
factibilidad de su uso para la producción industrial de
AgMNPV, las células UFL-AG-286 fueron adaptadas al cultivo
en suspensión agitada. En medio TC-100 suplementado con
10% de suero fetal bovino, los cultivos adaptados crecieron con
un tiempo de duplicación de 28,9 horas, y alcanzaron una
densidad celular máxima de 3,70 x 106 células.ml-1.
La glucosa del medio de cultivo fue consumida casi totalmente,
pero sin producción de lactato. Los aminoácidos,
con la excepción de glutamina, asparagina, metionina y
leucina, fueron consumidos en una muy baja proporción
respecto a sus respectivas concentraciones iniciales en el medio
de cultivo, o bien incrementaron su
concentración.

Por otro lado, las células UFL-AG-286 parecen no
producir alanina como una vía metabólica para la
eliminación de amonio, que se acumula en el sobrenadante
de cultivo. La infección sincrónica de los cultivos
en suspensión de UFL-AG-286 con AgMNPV durante la fase de
crecimiento temprano, que generó altos rendimientos
específicos de las dos progenies virales (virus brotados y
poliedros), redujo las demandas nutricionales celulares
específicas con respecto a los cultivos no
infectados.

Se logro en entrar que la línea celular
UFL-AG-286 pudo ser adaptada al cultivo en suspensión a
través de la selección de una subpoblación
de células con capacidad para proliferar sin formar
agrupaciones (saUFL-AG-286). Los cultivos adaptados crecieron con
una cinética similar a otras líneas de
células de insecto, pero exhibieron un perfil nutricional
y metabólico característico.

Los rendimientos de AgMNPV en los cultivos de
saUFL-AG-286 resultaron suficientemente elevados como para
sostener la factibilidad del uso de esta línea celular en
el desarrollo de un proceso industrial de producción del
bioinsecticida. El desarrollo de este proceso sólo
será posible luego de optimizar la producción viral
en un medio de cultivo libre de suero de bajo costo.

Actividad
Bioinsecticida de conidios y micelio secos en la
preparación de dos cepas de Beauveria bassiana contra el
barrenador de caña de azúcar Diatraea
saccharalis

Beauveria bassiana es un hongo ampliamente
distribuido en la naturaleza, cuyo potencial para controlar
más de 70 plagas de insectos aumentó
considerablemente su interés en la producción a
gran escala para la aplicación en el campo. Por otra
parte, este hongo también parece ser inocuo para la
mayoría de los organismos no objetivo. La
producción en masa de hongos patógenos de insectos
es una requisito previo necesario para cualquier campo a gran
escala aplicación de estos hongos. Sin embargo, muy poco
información está disponible en la
biotecnología de hongos entomopatógenos y su
producción industrial sigue siendo relativamente poco
sofisticada.

Está bien documentado que hay muchas alternativas
para producir hongos entomopatógenos. La técnica
más común y tradicional implica ya sea un estado
sólido de bioprocesamiento o una etapa de cultivo. En este
último caso, el hongo es crecido en un cultivo
líquido y luego se deja esporular como un cultivo de la
superficie en calma-líquidos o medio semisólido.
Aunque muchos trabajos de investigación sugieren que el
cultivo sumergido es el preferido, hongos imperfectos no producen
conidios en estas condiciones, a pesar de que crecen mucho y
producen micelio y blastoesporas en abundancia. Una nueva
alternativa que se han desarrollado recientemente considera la
posibilidad de producción de micelio seco, que es
fácil y rápida producidos en serie y sigue siendo
viables cuando son correctamente seca.

El objetivo de este trabajo fue evaluar el
desempeño de dos aislamientos de B. bassiana para
el control del barrenador de la caña de D.
saccharalis. La importancia económica de este insecto
plaga en

Argentina se centra en las importantes pérdidas
que produce fundamentalmente a los cultivos de maíz. Dos
diferentes tipos de medios de cultivo SSC y SBC fueron
utilizados, y sus actividades bioinsecticidas se compararon a
nivel de laboratorio.

Dos cepas de Beauveria bassiana (cepas Bb1 y
Bb5) se cultivaron en estado sólido y en las cultivos
sumergidas (SSC y SBC, respectivamente) con el fin de obtener
preparaciones de conidios y micelios secos. Las muestras
obtenidas en el laboratorio fueron probados como alternativas
para una nueva utilización de micoinsecticides para
controlar el barrenador de la caña de azúcar
Diatraea saccharalis. Los rendimientos de esporas
obtenidas en SSC indicó que la cepa Bb5 fue capaz de
producir alrededor de tres veces más conidios por gramo de
materia seca inicial (3.7 1010) que la cepa Bb1 (1.3 1010) en un
medio sólido compuesto de salvado de trigo y salvado de la
cáscara. En estas condiciones la cultivo, los primeros
mostraron no sólo los rendimientos satisfactorios de
esporas, si no también una mayor actividad bioinsecticida
que el segundo. Laboratorio de bioensayos realizados con conidios
de ambas cepas contra las larvas de D. saccharalis
indicó que la cepa Bb5 promueve una mortalidad de insectos
de 82,5% mientras que sólo el 21,3% de mortalidad se
observó con la cepa Bb1. En cuanto a las muestras
obtenidas en el SBC, en el que fue empleado un medio de cultivo a
base de glucosa y extracto de levadura, es interesante
señalar que, aunque las dos cepas mostraron
comportamientos similares con un rendimiento de aproximadamente
1,50 *1010 conidios por gramo de micelio seco, no lo fue en su
actividad bioinsecticida. A pesar de rendimientos satisfactorios,
la actividad de las cepas bioinsecticidas BB1 y Bb5 fue
disminuyendo drásticamente mostrando una mortalidad de
larvas por debajo del 2%.

Mejora de la
Producción de bioinsecticidas en cepas de Bacillus
thuringiensis en respuesta a las tensiones en varios medios de
bajo costo

El uso de bioinsecticidas, especialmente los producidos
por sporeless cepas de Bacillus thuringiensis, ha
demostrado ser una buena alternativa en el manejo de plagas. Dos
tipos de mutantes sporeless se distinguen. Los mutantes
asporogenicos que carecen por completo de esporas producen una
inclusión regular de cristales bipiramidales. Los mutantes
oligosporogenicos mantiene la capacidad de producir cristales de
proteínas insecticidas. Sin embargo, la
esporulación de los mutantes no era totalmente bloqueado y
muy pocos de ellos aún podría producir esporas. Con
el fin de mejorar la producción de bioinsecticidas, fue
investigada la adaptación de las cepas sporeless al choque
térmico y el estrés osmótico.
Producción del delta-endotoxina en un 78% de los mutantes
sporeless se ha mejorado significativamente por el estrés
osmótico con una sobreproducción de alrededor del
17%, en comparación con el BNS3 cepa salvaje. Sin embargo,
la producción de la toxina fue mejorada por sólo el
21% de los mutantes después de choque térmico, en
un medio de bajo costo. El análisis estadístico
demostró que la producción de delta-endotoxina, el
crecimiento celular y formación de la espora de mutantes
asporogenica y oligosporogenica dependía del tipo de
tensión aplicada. Cada cepa tiene un potencial importante
a la hora de aplicar la tensión adecuada. Por otra parte,
la adaptación de los mutantes sporeless a NaCl puede
permitir la sustitución de todos los minerales del medio
por el agua de mar diluida que parecía ser una buena
alternativa para la producción económica de
bioinsecticidas a escala industrial, que es de gran importancia
desde el punto de vista práctico.

Caracterización novel de Bacillus
thuringiensis fenotipo posesión de varios apéndices
adjuntos a un cuerpo parasporal

Bacillus thuringiensis es una bacteria conocida
por su producción de cuerpos cristal compuesto por una o
más proteínas Cry, que pueden ser tóxicos
para los insectos, nematodos o las células cancerosas. A
pesar de las cepas de B. thuringiensis Ocasionalmente se
han observado con apéndices filamentosos unidos a sus
esporas, los apéndices, en asociación con sus
cuerpos parasporal son extremadamente raros. Este artículo
se presenta la caracterización de Bt1-88, una cepa
bacteriana aislada del Caribe, que produce un complejo
espora-cristal que contiene seis apéndices de largo, cada
una compuesta por numerosos filamentos más delgado de
aproximadamente 10 nm de diámetro y 2,5 micras de
longitud. Cada uno de los apéndices de múltiples
filamentos se adjuntó a un solo cuerpo, pequeñas
parasporal situado en un extremo de la espora bacteriana. Pruebas
bioquímicas, la secuencia del gen 16S ADNr, y la
identificación de dos proteínas Cry de la secuencia
parcial de proteína (supuestamente Cry1A y Cry2A),
identificado inequívocamente Bt1-88 como una cepa de B.
thuringiensis. BT1-88 representa la segunda cepa de B.
thuringiensis informó que posee un cuerpo parasporal
fenotipo apéndice se caracteriza por uno o varios
apéndices de largo, compuesta por numerosos filamentos en
asociación con un organismo parasporal. Este hallazgo
sugiere que Bt1-88 es un miembro de una nueva clase
fenotípica de B.thuringiensis, en los que el
cuerpo parasporal puede desempeñar un papel estructural a
través de su asociación con dispositivos
multi-filamento.

Referencias

• D. GHRIBI, N. ZOUARI, W. TRIGUI, S.
  JAOUA. Use of sea water as salts source in starch- and soya
  bean-based media, for the production of Bacillus
  thuringiensis bioinsecticidas. Laboratoire des Biopesticides,
  Centre de Biotechnologie de Sfax, Tunisia. 2006.

• GIORIA, VERÓNICA VIVIANA;
  BECCARÍA, ALEJANDRO JOSÉ, CLAUS, JUAN DANIEl.
  Crecimiento, metabolismo y producción de baculovirus
  en cultivos en suspensión de una línea celular
  del insecto lepidóptero. Universidad Nacional del
  Litoral, CC 242, (S3000ZAA) Santa Fe, República
  Argentina. 2006.

• DIEGO VILLANUEVA, NUBIA
  VELÁSQUEZ, ESPERANZA RODRÍGUEZ, SERGIO ORDUZ
  and RAFAEL ARANGO. Molecular characterization of a Colombian
  Bacillus thuringiensis strain with activity against
  Tecia solanivora (Lepidoptera: Gelechiidae). Revista
  Colombiana de Entomología 35 (2): 130-137
  (2009).

• JORGE A. ARCAS A, BEATRIZ M. DIAZ B,
  ROBERTO E. LECUONA. Bioinsecticidal activity of conidia and
  dry mycelium preparations of two isolates of Beau6eria
  bassiana against thesugarcane borer Diatraea
  saccharalis. Centro de Investigación y Desarrollo en
  Fermentaciones Industriales. Instituto de
  Microbiología y Zoología Agrícola.
  1999.

• SUZANNE M THIEM. Prospects for altering
  host range for baculovirus. Department of Entomology, 243
  Natural Science, Michigan State University, East
  Lansing,

• F. OROZCO-SÁNCHEZ1 Y M.
  RODRÍGUEZ- MONROY. CELL SUSPENSION CULTURE OF
  Azadirachta indica FOR PRODUCTION OF
  ABIOINSECTICIDE. Universidad Nacional de Colombia –
  Sede Medellín/ Centro de Desarrollo de Productos
  Bióticos. 2007.

• SAOUSSEN BEN KHEDHER, SAMIR
  JAOUA, NABIL ZOUARI. IMPROVEMENT
  OF BIOINSECTICIDES. Production by Sporeless Bacillus
  thuringiensis Strains in Response to Various Stresses in Low
  Cost Medium. Current Microbiology.

• ANTONIO VENTURA-SUÁREZ,
  RAMÓN CRUZ-CAMARILLO, JOANNE
  RAMPERSAD, DAVID RAMMONS, et al. Characterization of
  a Novel Bacillus thuringiensis Phenotype Possessing Multiple
  Appendages Attached to a Parasporal Body.

• YENNY ADRIANA GÓMEZ AGUIRRE.
  ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO in vitro DE Ipomoea intrapilosa
  Y EVALUACiÓN DE SU ACTIVIDAD INSECTICIDA CONTRA
  Tria/eurodes vaporariorum. CENTRO DE DESARROLLO DE
  PRODUCTOS BIÓTICOS. 2005.

• LAURA PATRICIA LINA GARCÍA.
  ESTABLECIMIENTO DE CULTIVOS IN VITRO DE Ipomoea
  intrapilosa EN LUZ Y OSCURIDAD PARA LA PRODUCCIÓN DE
  SUSTANCIAS CON ACTIVIDAD INSECTICIDA CONTRA Spodoptera
  frugiperda SMITH, (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE), PLAGA DE
  INTERÉS AGRÍCOLA. CENTRO DE DESARROLLO DE
  PRODUCTOS BIÓTICOS. 2006.

Autor:

Jhon Jairo Ortiz R.