1.0 Generalidades El microscopio hizo posible conocer los mundos
de dimensiones ínfimas, entre ellos la célula, base
de la vida. Los microscopios son aparatos que, en virtud de las
leyes de formación de imágenes ópticas
aumentadas a través de lentes convergentes, permiten la
observación de pequeños detalles de una muestra
dada que a simple vista no se percibirían. Surge en el
siglo XVII los microscopios compuestos, utilizados por el
holandés Antonie van Leewenhock en el estudio de la
microfauna de los estanques y charcas, unidas a las de Robert
Hooke, establecieron la microscopia como poderosa herramienta
científica. Zacharias y Hans Janssen construyeron en los
años 1590's el primer microscopio registrado.
2.0 Tipos de Microscopios Optico Confocal Electrónico de
Transmisión Electrónico de Barrido
Microscopía de campo próximo – De barrido efecto
túnel – De fuerzas atómicas Microscopio
estereoscópico
Campo claro :La muestra se observa más oscura que el campo
que la rodea. Campo oscuro: Posee un condensador paraboloide,
hace que los rayos luminosos no penetren directamente en el
objetivo, sino que iluminan oblicuamente la preparación.
De contraste de fase: Se basa en modificaciones de la trayectoria
de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en
la preparación. De fluorescencia: La fluorescencia es la
propiedad que tienen algunas sustancias de emitir luz propia
cuando inciden sobre ellas radiaciones energéticas, tratar
el material biológico con flurocromos facilita la
observación al microscopio . Tipos de Micoscropio
óptico
La muestra se observa más oscura que el campo que lo
rodea. Microscopio de campo claro
La muestra se observa brillantemente iluminada sobre un fondo
oscuro. Microscopio de campo oscuro
Microscopio de contraste de fases Se observa una imagen con
diferentes grados de brillo y oscuridad. El material denso
aparece brillante, mientras que las partes de la célula
que tienen una densidad cercana al agua (citoplasma) aparecen
oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin
necesidad de usar colorantes o matar microorganismos.
Microscopio óptico de fluorescencia Una molécula
que fluorece emite luz de longitud de onda que se encuentra
dentro del espectro visible, cuando es expuesta a una fuente de
luz ultravioleta. Microscopio compuesto modificado con una fuente
de radiaciones ultravioletas y un filtro. Se usan colorantes que
emiten luz visible cuando se bombardean con rayos UV.
Microscopio confocal Se usa para estudiar la estructura de los
materiales biológicos. Emplea un sistema de
iluminación con rayo láser que es muy convergente
y, en consecuencia produce un punto de barrido muy poco profundo.
Se utiliza un sistema de espejos para mover el rayo láser
a través del espécimen, iluminando un solo punto
por vez. Se registran los datos de cada punto de la muestra
recorrida con este rayo móvil y se guardan en una
computadora. Luego se puede llevar la imagen a un monitor de alta
resolución. Este método tiene la ventaja de que se
pueden tomar imágenes de la muestra en cortes muy finos.
Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante un
programa para dar una definición máxima a la
imagen. Es posible también crear imágenes
múltiples a diferentes profundidades dentro del
espécimen y realizar reconstrucciones
tridimensionales.
En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio
electrónico a base de lentes electrostáticas, ese
mismo año Knoll y Ruska dan a conocer los primeros
resultados obtenidos con un microscopio electrónico
Siemens, construido con lentes magnéticas. Así nace
el microscopio electrónico, en 1936 ya se ha perfeccionado
y se fabrican microscopios electrónicos que superan en
resolución al microscopio óptico. Utiliza un flujo
de electrones en lugar de luz. Consta fundamentalmente de un tubo
de rayos catódicos, en el cual debe mantenerse el vacio.
Microscopio Electrónico
Permiten estudiar la estrutura celular. La resolución y el
aumento son mayores. Los virus, y los objetos más
pequeños, como las macromoléculas solamente pueden
verse a través del microscopio eléctronico. El
Microscopio electrónico consta de: * Un filamento de
tungsteno (cátodo) que emite electrones. * Condensador o
lente electromagnética, que concentra el haz de
electrones. * Objetivo o lente electromagnética, que
amplía el cono de proyección del haz de luz.
*Ocular o lente electromagnética, que aumenta la imagen.
*Proyector o lente proyectora. que amplía la imagen. *
Pantalla fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible
al ojo humano. Aplicaciones
Microscopio Electrónico de Transmisión Utiliza un
chorro de electrones en lugar de luz visible para definir el
objeto. Requiere que se aumente el contraste por sombreado
metálico utilizando un metal pesado. Pasos para la
preparación de rutina de los especimenes en la microscopia
electrónica de transmisión Fijación con
glutaraldehído. Lavado con un buffer. Fijación con
tetróxido de osmio. Fijar piezas de tejidos no mayores de
1mm 3 Microfotografía electrónica de
Transmisión de paredes celulares.
Microscopio electrónico analítico de
transmisión de alta resolución JEOL-2000 FXII
Permite observaciones de hasta 0,28 nm. de resolución.
Puede focalizar el haz de electrones hasta 2 nm. de
diámetro y trabaja con voltajes de aceleración
variables de 20 a 200 kV. Lleva acoplado un sistema computerizado
de análisis de energía de rayos X dispersados
eXL-10 de LINK ANALYTICAL que permite determinar la
composición química de la microregión sobre
la que se focaliza el haz electrónico. Aumentos entre 5
000X y 1 000 000X
Microscopio Electrónico de Barrido Bombardea la superficie
del espécimen con un rayo de electrones. Produce
imágenes con una profundidad aparentemente tridimensional.
Técnica versátile para la visualización y el
análisis de las características microestructurales
de muestras sólidas(elevada resolución es 2nm y
campo de resolución) . Técnica de interés en
campos como :Medicina, Biología, Ciencias de Materiales,
Metalurgia, Arqueología, etc. Microfotografía
electrónica de Barrido de paredes celulares.
Microscopio de fuerzas atómicas Instrumento
mecánico- óptico que detecta fuerzas a nivel
atómico (del orden de los nanoNewton) a través de
la medición óptica del movimiento sobre la
superficie. Obtiene imágenes tridimensionales de la
superficie de muestras (Sin preparación especial de las
muestras). Lleva acoplado un microscopio óptico( permite
la visualización del conjunto punta-muestra y poder situar
la punta sobre una zona determinada de la muestra). Distingue
detalles en la superficie de la muestra con una
amplificación de varios millones( Resolución de
menos de 1nm). Aplicaciones Análisis de: Cristales de
aminoácidos. ADN y ARN Complejos Proteína –
ácidos nucleicos. Cromosomas. Membranas celulares.
Proteínas y pépticos Cristales moleculares.
Polímeros y biomateriales Componentes de las membranas de
la célula.
Microscopio de barrido efecto túnel Forma parte de los
instrumentos llamados 'nanoscopios‘( visualiza objetos del
tamaño de nanómetros (10 a la menos nueve metros).
Inventado en 1981 por G. Binning y H. Röhrer, (IBM, Zurich)
(galardonados con el Premio Nobel de Física en 1986 por su
invención). Dispone de una aguja tan afilada que en su
extremo sólo hay un átomo. La punta se sitúa
sobre el material y se acerca hasta la distancia de 1
nanómetro (10 a la menos 9 metros). Una corriente
eléctrica débil genera una diferencia de potencial
de 1 voltio. Al recorrer la superficie de la muestra, la aguja
reproduce la topografía atómica de la muestra.
Aplicaciones Imágenes atómicas de moléculas
de ADN. Mover átomos individuales. Mapas precisos de
superficies de metales o de semiconductores, cada átomo
puede distinguirse de su vecino.
Microscopio estereoscópico Visión tridimensional de
los objetos, para observaciones que requieren pequeños
aumentos
3.0 Partes del micoscropio óptico
Partes del microscopio óptico. SISTEMA MECANICO Píe
Brazo Tubo Lugar donde se deposita la preparación. Platina
Base sobre la que se apoya el microscopio. Sostiene el tubo en su
porción superior y por el extremo inferior se adapta al
pie. Forma cilíndrica En su extremidad superior se colocan
los oculares. (Es ennegracido internamnete para evitar los
reflejos de luz).
Platina:Presenta un orificio en el eje óptico del tubo que
permite el paso de los rayos luminosos a la
preparación,puede ser fija, en cuyo caso permanece
inmóvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir,
mediante tornillos laterales puede centrarse o producir
movimientos circulares. Escala Pinza
SISTEMA MECANICO Revólver Pieza giratoria en los cuales se
enroscan los objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos
.
SISTEMA DE Mecánico Tornillo micrométrico Tornillo
macrométrico Freno. Aproxima el enfoque,permite un enfoque
rápido de la preparación. Se logra el enfoque
exacto y nítido de la preparación Tornillos de
enfoque
SISTEMA ÓPTICO Oculares: Los oculares están
constituidos generalmente por dos lentes, dispuestas sobre un
tubo corto . Objetivos: Producen aumento de las imágenes
de los objetos y organismos. Partes del microscopio
óptico. Sistema de lentes
SISTEMA ÓPTICO Objetivos Partes del microscopio
óptico. Están colocados en el revolver. Tienen un
sistema de amortiguación. Un anillo coloreado indica los
aumentos. Poseen un aumento de 4x, 10x, 40x y 100x aumentos.
Sistema de lentes:
SISTEMA ÓPTICO Objetivos Partes del microscopio
óptico. Sistema de lentes: Rojo 4x Amarillo 10x Blanco
100x (Inmersión) Azul 40x amortiguación
SISTEMA ÓPTICO Partes del microscopio óptico.
Sistema de lentes: Están colocados en la parte superior
del tubo. Poseen un aumento de 10x, 15x y 20x. Oculares
SISTEMA ÓPTICO Objetivos Partes del microscopio
óptico. ACEITE DE INMERSIÓN Sistema de lentes: Hoy
no son de madera de cedro, sino sintéticos. Los hay de
baja, media y alta viscosidad. Su empleo es imprescindible con el
objetivo de inmersión (100x).
SISTEMA ÓPTICO Sistema de Iluminación: Fuente de
luz Condensador Partes del microscopio óptico. Diafragma
Lente que concentra los rayos luminosos sobre la
preparación. Regula la cantidad de luz que entra en el
condensador. Dirige los rayos luminosos hacia el
condensador.
SISTEMA ÓPTICO Fuente de luz Partes del microscopio
óptico. Suele ser una lámpara halógena de
intensidad graduable. Se enciende y apaga con un interruptor. En
el exterior puede tener un filtro. Sistema de Iluminación:
lámpara Interruptor graduación de la luz
Filtro
SISTEMA ÓPTICO Condensador Partes del microscopio
óptico. Concentra la luz de la lámpara en un punto
de la preparación. Sistema de Iluminación:
condensador Diafragma o iris Dentro del condensador. Al cerrarse
mejora el contraste, pero empeora la resolución.
diafragma
4.0 Pasos a seguir para su uso. Conectar el microscopio a la
corriente eléctrica. Colocar el objetivo de menor aumento
en posición de empleo y bajar la platina completamente.(Si
se recogio correctamente ya debe estar en esas condiciones).
Colocar la preparación sobre la platina sujetándola
con las pinzas metálicas. Encender la fuente de luz con la
intensidad mínima y se va aumentando poco a poco. Comenzar
la observación con el objetivo de 4x (ya está en
posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la
preparación es de bacterias.
Pasos a seguir para su uso. 6. Para realizar el enfoque: Acercar
al máximo la lente del objetivo a la preparación,
empleando el tornillo macrométrico( Mirando directamente y
no a través del ocular, se corre el riesgo de incrustar el
objetivo en la preparación y dañar ambos). Mirando,
a través de los oculares, ir separando lentamente el
objetivo de la preparación con el macrométrico y,
cuando se observe algo nítida la muestra, girar el
micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 7. Pasar al
siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi
enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el
micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de
objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible
volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la
operación desde el paso 5.
Pasos a seguir para su uso. 8. Empleo del objetivo de
inmersión: Bajar totalmente la platina. Subir totalmente
el condensador para ver claramente el círculo de luz que
nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá
que echar el aceite. Girar el revólver hacia el objetivo
de inmersión dejándolo a medio camino entre
éste y el de 40x. Colocar una gota mínima de aceite
de inmersión sobre el círculo de luz. Terminar de
girar suavemente el revólver hasta la posición del
objetivo de inmersión. Mirando directamente al objetivo,
subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de
aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se
adosara a la lente. Enfocar cuidadosamente con el
micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de
inmersión y la preparación es mínima, aun
menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy
grande.
Pasos a seguir para su uso. Una vez se haya puesto aceite de
inmersión sobre la preparación, ya no se puede
volver a usar el objetivo. Finalizada la observación de la
preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de
menor aumento girando el revólver. Se puede retirar la
preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el
objetivo de inmersión en posición de
observación. Limpiar el objetivo de inmersión con
cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar
también que el objetivo 40x está perfectamente
limpio. – Apagar el equipo y desconectarlo de la corriente.
Aumento Poder de resolución Límite de
resolución Número de campo Profundidad de campo
Contraste 5.0 Parámetros Ópticos.
Se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento
del ocular. 40 x 10 x 400x 5.1 Aumento
Es la capacidad del instrumento para dar imágenes
distintas de puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto.
Depende de: la long. de onda (?) y de la apertura numérica
(AN). 5.2 Poder de resolución R AN 0.61 ? Es la capacidad
de reunión de la luz de objetivo, también se
encuentra grabada en la manga del lente.
Es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos
para que puedan ser discriminados como tales. El Límite de
Resolución es la inversa del Poder de Resolución,
de manera que cuanto mayor sea éste, menor será el
Límite de Resolución. 5.3 Límite de
resolución Límite de Resolución Poder de
Resolución 1
Es el diámetro de la imagen observada a través del
ocular, expresado en milímetros. 5.4 Número de
campo Espesor de la preparación enfocada en cualquier
momento. 5.5 Profundidad de campo
Diferencia de absorción de luz entre el objeto y el medio
Puede aumentarse con las tinciones. 5.6 Contraste
6.0 Mantenimiento del microscopio El microscopio debe estar
protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran
dañarlo .( Guardado en estuche, campana y otros). Las
partes mecánicas deben limpiarse con un paño
suave.( Humedecer el paño con Xilol si se ha trabajado con
aceite de inmersión). La limpieza de las partes
ópticas requiere precauciones especiales. Nunca deben
tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los
dedos. Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor
aumento sobre la platina y bajado hasta el tope; el condensador
debe estar en su posición más baja, para evitar que
tropiece con alguno de los objetivos . Guardar en lugares secos,
para evitar que la humedad favorezca la formación de
hongos. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio
(macrométrico, micrométrico, platina,
revólver y condensador). El cambio de objetivo se hace
girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la
preparación para prevenir el roce de la lente con la
muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el
tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a
través del ocular. Mantener seca y limpia la platina del
microscopio
7.0 Conclusiones El Microscopio es: un instrumento que se
utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos
minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos.
El microscopio simple o lente de aumento es el más
sencillo de todos y consiste en realidad en una lupa que agranda
la imagen del objeto observado. Dos lentes convexas bastan para
construir un microscopio. Cada lente hace converger los rayos
luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se
sitúa cerca del objeto que se quiere estudiar. La imagen
es observada por la segunda lente, llamada ocular, que
actúa sencillamente como una lupa. Zacharias y Hans
Janssen construyeron en los años 1590's el primer
microscopio registrado. En 1932, Bruche y Johnsson construyen el
primer microscopio electrónico a base de lentes
electrostáticas. Los virus, y los objetos más
pequeños, como las macromoléculas solamente pueden
verse a través del microscopio eléctronico.