ELISA de avidez (página 2)

Métodos indirectos

Se basan en la aplicación de un anticuerpo
primario sobre el tejido que es reconocido por un segundo
anticuerpo, secundario, contra la región Fc del primario,
unido a un marcador. El anticuerpo secundario se aplica a una
concentración en exceso. Estos métodos
son mucho más sensibles que los directos pues al
anticuerpo primario se pueden unir más de un anticuerpo
secundario, incrementando la señal. Otra ventaja de estos
métodos es que basta con disponer de unos pocos
secundarios marcados para poder
reconocer un gran número de anticuerpos primarios
diferentes.

El marcaje del anticuerpo secundario es más
fácil pues al obtenerse contra las inmunoglobulinas de una
especie se dispone de gran cantidad de antígeno puro y se suelen inmunizar
animales
grandes (cabra, oveja, caballo, etcétera) con lo que se
dispone de gran cantidad de anticuerpo para la reacción.
El límite en el número de antígenos que es
posible detectar se encuentra en el número de anticuerpo
secundarios distintos de que se dispone acomplejados con
marcadores diferentes.

Objetivos

Determinar la avidez de anticuerpos provenientes de
suero de ratón infectado con T. cruzi, obtenidos a
distintos tiempos post-infección (evaluando la evolución de su avidez), mediante un ELISA
de avidez. En esta se desafiará la unión
antígeno-anticuerpo con urea 6M, por el principio de
elución.

Procedimientos

Los sueros diluidos 1/50 se incubaron por sextuplicado,
realizando el tratamiento con urea 6M en 3 de los pocillos (como
se indica en la figura 1). Se utilizaron 1 suero correspondiente
a un ratón sin infectar (fila A de la placa en la figura
1) y 6 sueros de ratones infectados (filas B, C, D, E, F Y G). En
la fila H se incluyen los controles sin suero (solo diluyente),
en las columnas 1, 2 y 3 sin anticuerpo anti-IgG ratón
infectado y en las columnas 4, 5 y 6 con anticuerpo anti-IgG
ratón infectado.

Se sensibilizaron las placas a 4ºC "overnight", y
se realizó un primer tratamiento caotrópico con
urea 6M (en todos los pocillos) 30 minutos a 37ºC. Este
tratamiento es necesario para eliminar aquellos antígenos
que pudieren pegarse a la placa con baja avidez. Después
se bloqueó con PBS-leche
descremada al 5% 1 hora a 37ºC, y se incubó con los
sueros diluidos 1/50 en PBS-leche descremada al 1% 1 hora a
37ºC. Se lavó la placa 5 veces con buffer de lavado
(PBS-Tween 20 al 5%). A partir de aquí se siguieron 2
tratamientos: en los pocillos 4, 5 y 6 se incubó con
PBS-urea 6M 30 minutos a 37ºC, y en los pocillos 1, 2 y 3 se
incubó con PBS 30 minutos a 37 ºC. Volvieron a
lavarse las placas 5 veces en buffer de lavado, y luego se
incubó 1 hora a 37ºC con el anticuerpo anti-IgG de
ratón conjugado a peroxidasa y diluido en PBS-leche
descremada al 1%. Se lavaron los pocillos 5 veces más con
buffer de lavado y se reveló la placa con
H2O2 y TMB (tetrametilbencidina), dejando
incubar por 15 minutos. Se cortó la reacción con
H2SO4 2N y se lee a 450 nm en el
espectrofotómetro.

Figura 1: Esquema de la
placa del ELISA de avidez

Por último, se calcularon los índices de
avidez dividiendo el valor medio de
la densidad óptica
obtenido en los pocillos tratados con urea
6M (4, 5 y 6, filas Bà G)
por el valor medio de la densidad óptica de los pocillos
no tratados (1, 2 y 3, filas Bà G), y multiplicando este valor por
100.

Resultados

En la Figura 2 se puede observar la placa del ELISA de
avidez. En los pocillos 1 a 3 se realizó el tratamiento
con PBS y en los pocillos 4 a 6 se realizó el tratamiento
con PBS y Urea 6M. Las distintas filas corresponden a los sueros
de ratón obtenidos a distintos tiempos post
infección. En la última fila se realizó el
control sin
suero.

Figura 2: Placa del
ELISA de avidez.

La reacción de la peroxidasa fue interrumpida con
H2SO4 y se midió la absorbancia a
450 nm en un espectrofotómetro de ELISA (Figura
3).

Figura 3: Placa de ELISA
de avidez con H2SO4.

Con los datos obtenidos
del espectrofotómetro de ELISA se realizó una tabla
(Tabla 1) y se procedió a calcular los índices de
avidez (Av).

Tabla 1:
Tabla correspondiente a los valores
obtenidos del espectrofotómetro del ELISA.

El Ratón 1 es un ratón control no
infectado, por lo cuál el índice de avidez da alto
(debería dar 100%, ya que no deberían pegarse
anticuerpos tanto en el tratamiento con PBS como con el
tratamiento con Urea 6M), y se utilizó como blanco del
resto de los sueros. El control sin suero da 100%, lo cuál
es esperable ya que no hay anticuerpos.

Con estos datos se procedió a graficar como
varía la respuesta inmune (aumento de la avidez) en
función
al tiempo post
infección (Figura 4).

Figura 4:
Evolución de la respuesta inmune en el
tiempo.

Conclusiones

Podemos concluir que a medida que madura la respuesta
inmune los anticuerpos generados son más ávidos
(con mayor afinidad), y que el ensayo de
ELISA de avidez nos permite comparar distintos sueros contra un
antígeno específico y determinar cual de ellos
tiene mayor avidez por el mismo.

Autor:

Sebastián Ferraro

Guz Lucas

Melli Luciano

Rapoport Ayelén

Shalóm Fabián

Universidad Nacional de General San
Martín

Inmunología Molecular