Genética bacteriana (página 2)

Como control se
plaquearon las bacterias
utilizadas inicialmente con el mismo medio con
antibióticos utilizados para la selección.

Mutagénesis por
transposición

A partir de un cultivo silvestre de A.
tumefaciens, cepa A348 resistente a Cloramfenicol, se
realizó una conjugación biparental con la cepa de
E. Coli S17λpir, la cual porta el
vector suicida pUTminiTn5Km. Al no poder
replicarse autσnomamente excepto en
presencia del gen pir, este vector no puede replicarse
en A. tumefaciens por lo que se pierde en las sucesivas
divisiones de la bacteria.

Aunque el vector que porta el transposón
miniTn5 se pierde, el evento de transposición se
efectúa antes de que esto ocurra, y se puede evidenciar
ya que este transposón posee un gen que le confiere
resistencia a
la Kanamicina.

Para la realización de la conjugación
biparental se partió de dos cultivos en medio
líquido de S17λpir(pUTKm) y A348. Se
tomσ una alícuota de 500 ul del
cultivo de S17λpir(pUTKm) y se
centrνfugo eliminando posteriormente el
sobrenadante. Al pellet obtenido se le agregó 500 ul del
cultivo de A348, y se procedió a centrifugar nuevamente
con la posterior eliminación del sobrenadante. A este
pellet ahora proveniente de los dos cultivos, se le
realizó un lavado con LB. Esto se realiza con el fin de
eliminar los antibióticos presentes en los distintos
medios de
cultivo. Luego se volvió a centrifugar, se
eliminó el sobrenadante y se resuspendió el
pellet en 25 ul de LB.

Posteriormente se tomó el material resuspendido
y se lo colocó en el centro de una placa conteniendo LB.
Se incubó a 28 °C toda la noche. Se levanto el
botón y se resuspendió suavemente en 250
m l de LB. Luego se tomaron 100
m l de la resuspensión y se la
coloco con 900 m l de LB. Se
plaqueó la resuspensión y la
dilución.

A modo de seleccionar aquellas A. tumefaciens
que incorporaron el transposón, se realizó un
plaqueo en medio LB con los antibióticos Kanamicina y
Cloramfenicol. Se utilizó calcofluor 0,2%, con el fin de
visualizar si el evento de transposición ocurrió
sobre el gen pgm al exponer las placas bajo luz
UV.

Transformación

A partir de un cultivo de células
competentes de Escherichia coli, se realizó una
transformación con un plásmido recombinante, el
cual porta la resistencia para el antibiótico
Ampicilina.

Se tomaron 100 ul de las células competentes y
se agregó 2 ul de plásmido. Se dejó
reposar 30 minutos en hielo y luego se aplicó un
baño de agua a 42
°C durante 40 minutos con el fin de favorecer la
transformación. Una vez terminado el baño, se
mantuvo en hielo durante 2 minutos, para luego diluir la
muestra en 900
ul de LB.

Luego se dejó a 37 °C durante 1 h y se
plaqueó 100 ul de la dilución en medio LB con el
antibiótico Ampicilina.

RESULTADOS y DISCUSIONES:

Complementación funcional

Los controles realizados para la
complementación arrojaron resultados esperados, no
encontrándose crecimiento
bacteriano.

En la placa que contenía medio LB con los
antibióticos Kanamicina y Tetraciclina y calcofluor al
2%, se observó crecimiento.

Esto indica que el evento de conjugación fue
exitoso. Se observaron las colonias bajo luz UV,
encontrándose bacterias con fenotipo Bright. Esto revela
una complementación funcional satifactoria del gen
pgm. Tambien se visualizaron colonias con fenotipo Dark.
Esto puede ser debido a una posible contaminación de las placas.

En los controles de la comisión A se
encontraron colonias de E. coli, por lo que se supone que
ésta es la cepa contaminante encontrada en las placas de
la comisión B.

Mutagénesis por
transposición

No se observó crecimeinto bacteriano en las
placas de control. En la placa utilizada para seleccionar
aquellas A. tumefaciens que incorporaron el
transposón, se observó crecimiento. Se
utilizó calcofluor 0,2%, con el fin de visualizar si el
evento de transposición ocurrió sobre el gen
pgm.

Bajo la luz UV se observaron colonias de fenotipo
Brigth exceptuando una sola que mostó un fenotipo Dark.
Este resultado no garantiza que el transposón haya
caído en la secuencia del gen pgm. Para confirmar esta
mutación deberían realizarse pruebas como
PCR, FISH o Southern Blotting.

Transformación

Se pudo observar crecimiento en las 2 comisiones. En
la placa de la comisión A se encontraron cepas aisladas
mientras que en la de la comisión B se visualizaron
colonias en forma de césped. Esto puede deberse a que
las bacterias utilizadas en ambas comisiones poseían
diferentes eficiencias en cuanto a la competencia,
siendo las B mas competentes. En ambos casos se utilizó
la misma cantidad de DNA plasmidico

Al no poder observarse colonias aisladas en las placas
de la comisión B los cálculos necesarios para
obtener la eficiencia de
la transformación fueron obtenidos a partir de las
placas de la comisión A. Para ello se utilizó la
siguiente ecuación, en donde se debe tener en cuenta la
cantidad de ADN utilizado y
si se realizó alguna dilución:

Como estas 240 UFC fueron encontradas en una
dilución de 1 en 10, para encontrar la eficiencia real
debe multiplicarse el valor
encontrado por el factor de dilución. Dicho valor se
expresa a continuación

BIBLIOGRAFÍA:

Prescott L.M., Harley J.P. y Klein D.A. (2003)
Microbiología – 4ta Edición –
ISBN:84-486-0261-7

Olivera Ramiro,

Pitkowski Martín

Shalóm Fabián

Cátedra de Microbiología – Escuela de
Ciencia y
Tecnología – Universidad
Nac. De San Martín