Objetivos
- Aplicar las técnicas
Inmunodifusión Doble de Ouchterlony e
Inmunoelectroforesis, con el fin de estudiar la interacción Antígeno-Anticuerpo.
Materiales y Métodos
Inmunodifusión Doble de
Ouchterlony
Se partió de placas de petri, las cuales
contenían una capa de gel de agarosa 1% ya solidificado, y
se le realizaron pocillos con una pipeta pasteur de vidrio; en estos
posillos se realizo la siembra de las muestras.
Se sembró en el posillo del centro suero
total de conejo anti-humano, y en los pocillos
laterales:
1 suero humano 1/50
2 precipitado de sulfato de amonio 33% 1/20
3 precipitado de sulfato de amonio 50% 1/20
4 purificación por proteína A
fracción 3 1/20
5 purificación por proteína A
fracción 4 1/20
Análisis Inmunoelectroforetico
Los materiales
utilizados en este ensayo fueron;
un porta objetos, papel de filtro y agarosa.
Se colocaron sobre el portaobjetos dos tiritas de papel
de filtro y se cubrió el porta objetos con una capa
delgada de agarosa de forma tal que los papeles de filtro queden
pegados y en forma de extensión, de esta forma se
mantienen embebidos en el buffer de corrida; se le realizaron en
la agarosa dos incisiones en forma de pocillo y una
incisión central en forma longitudinal paralela al sentido
de la corrida.
Luego se sembraron suero humano y precipitado por
sulfato de amonio 33% en los pocillos y luego de la corrida, en
la incisión central, se sembró suero total de
conejo anti-humano; en todos los casos las siembras fueron
realizadas con bromofenol como indicador de corrida.
Resultados
Inmunodifusión Doble de
Ouchterlony
Nota: los resultados informados para esta técnica
corresponden al grupo cuatro
del turno mañana, debido a que el ensayo
realizado por el grupo dos del turno mañana (Shalom F.,
Rapoport A., Melli L.) no se resolvió según lo
esperado.
Figura 2: Placa de inmunodifusión
correspondiente al grupo 4 del turno mañana.
A Suero de conejo total anti-humano, 1
Precipitado sulfato de amonio 50% ½, 2 Precipitado
sulfato de amonio 50%, 1/10 3 Precipitado sulfato de
amonio 50%, 1/20 4 Precipitado sulfato de amonio 50%, 1/50
5 Precipitado sulfato de amonio 50%, 1/100.
B IgGs de conejo 1 Suero humano 1/50
2 Proteina A (fracc. 4) 1/5 3 Suero humano 1/100
4 Proteina A (fracc. 4) 1/50.
En la Figura 2 se pueden observar los resultados de la
inmunodifusión. Se pueden visualizar las bandas de
precipitación en azul (encerradas en la circunferencia
roja)
En todos los casos se visualiza un patrón de
identidad
total, debido a que en los pocillos se encuentra el mismo
antígeno en distintas concentraciones.
Existe una relación entre la concentración
del antígeno sembrado y la posición de la banda.
Cuanto mas concentrado se encuentre el antígeno mas lejos
del posillo se encontrara la banda.
Es por esto que la banda correspondiente a sulfato de
amonio 50% (1/2) se encuentra mas cerca del pocillo central
(pocillo de siembra de suero de conejo total anti-humano) que las
demás bandas.
En el caso de B (IgGs de conejo) no se pueden
interpretar muy bien los resultados debido a que la banda es muy
tenue.
Análisis Inmunoelectroforetico
En la Figura 3 se puede observar de forma
esquemática el patrón de migración
de las γ,α y β globulinas,
asν como también la Albúmina
(Alb).
Figura 3: Patrón de
migración
En la Figura 4 se pueden observar los resultados
correspondientes a la inmunoelecroforesis. Para los grupos 1, 2 y 3
que sembraron suero de conejo total anti-humano, se pueden
observar los cuatro tipos de globulinas en orden (como se denota
en la Figura 3). En el caso del grupo 4 que sembró
anti-IgG de conejo, solo se pueden observar las gamma
globulinas.
Grupo 1:
Suero de humano total (izquierda): se observa el
patrón de globulinas como se denota en la Figura 3 (gamma,
beta, alfa y albúmina).
Fracción 4 de proteína A (derecha): se
observan solo las gamma globulinas.
Grupo 2:
Suero de humano total (izquierda): se observa el
patrón de globulinas como se denota en la Figura 3 (gamma,
beta, alfa y albúmina).
Precipitado sulfato de amonio 33% (derecha): idem que
para suero humano total.
Grupo 3:
Suero de humano total (izquierda): se observa el
patrón de globulinas como se denota en la Figura 3 (gamma,
beta, alfa y albúmina).
Precipitado sulfato de amonio 50% (derecha): se observan
solo dos bandas
Figura 4: Placas de Inmunoelectroforesis;
turno tarde se denota con T y turno mañana M.
Conclusiones
Se pudieron realizar las técnicas de
Inmunodifusión radial e Inmunoelectroforésis para
estudiar la interacción Antígeno-Anticuerpo,
así como también el marco
teórico de las mismas.
Con respecto a la Inmunodifusión, se pudieron
observar patrones de identidad total en los resultados
según lo esperado. Sin embargo no se pudieron analizar los
resulados de la siembra con IgGs de conejo (B), debido a que las
bandas resultaron muy tenues.
Los resultados de la Inmunoelectroforesis nos
permitieron observar el patron de migracion de las distintas
globulinas.
Rapoport, Ayelen
Shalóm Fabián
Melli, Luciano J.
Laboratorio de Inmunología Molecular – Instituto de
Investigaciones Biotecnológicas –
UNSAM
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