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Separación por electroforesis




Enviado por mireya XXX



  1. Resumen
  2. Introducción
  3. Material y Métodos
  4. Desarrollo Experimental
  5. Resultados y
    Discusión
  6. Conclusiones
  7. Referencias
    Bibliográficas

Práctica No. 2

Resumen

La finalidad de esta práctica fue lograr la
separación del DNA a partir de un vegetal
(brócoli), por medio del método de
electroforesis.

Las proteínas tienen la propiedad de ser
anfotéricas; es decir, son aquellas moléculas que
poseen un extremo hidrofílico, o sea, que es soluble en
agua, y otro hidrófobo, o sea que rechaza el
agua.

La electroforesis es un método
empleado para separar de proteínas por medio de su tipo de
carga; basado en su punto isoeléctrico, haciendo migrar
las proteínas a través de un campo
electromagnético regulado por el voltaje del
equipo.

Se combinan con los iones hidrógeno y con otros
iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga
neta de la molécula. A la concentración de iones
hidrógeno, o al pH, para el cual la concentración
del ion híbrido de una proteína es máxima y
el movimiento neto de las moléculas de soluto en un campo
eléctrico es prácticamente nulo se denomina punto
isoeléctrico.

No se pudieron
obtener los resultados deseados ya que no sé mostró
en la cámara de correr de electroforesis ningún
tipo de movimiento hacia el polo positivo,( que era al que se
esperaba el sentido del movimiento); Debido a que la muestra de
brócoli era un poco vieja, lo que interfirió en la
elaboración de la practica para poderse llevar a cabo
correctamente.

Introducción

El gran número de proteínas que existen,
su gran variedad de actividades biológicas y las
diferencias químicas existentes entre las proteínas
homólogas de los distintos organismos determinan que la
extracción, la purificación y la
caracterización de las proteínas constituyan un
punto central en toda investigación
bioquímica.

Los métodos iniciales de aislamiento de las
proteínas fueron empíricos, lentos y muy
laboriosos; sin embargo, con los nuevos métodos asequibles
en la actualidad. No existe un procedimiento único, o un
conjunto de procedimientos mediante los cuales todas y cada una
las proteínas puedan aislarse, sino que normalmente se
sigue una secuencia de etapas de separación para
cualquiera proteína, que dará por resultado un
grado de purificación elevado y un alto
rendimiento.

También es necesario un procedimiento para
liberar las proteínas en forma soluble de la célula
intacta o de la estructura de tejido sin provocar pérdidas
de actividad. Normalmente se emplea la trituración
mecánica u homogenización de los tejidos vegetales
para romper la pared celular y liberar los contenidos celulares,
los cuales pueden ser valorados después para determinar su
contenido en la proteína deseada. A veces la pared celular
puede ser debilitada o lisada por tratamientos con ciertas
enzimas. Si la proteína deseada se halla por casualidad
asociada a una membrana o un orgánulo membranoso, debe ser
extraída de allí en forma soluble, lo cual puede
conseguirse, frecuentemente, por simple extracción con
agua o bien por una ruptura mecánica o sónica de
las membranas, y también mediante el empleo de detergentes
para lograr la desintegración de la estructura
membranosa

La separación de proteínas sobre la base
de su carga eléctrica dependen en último
término de sus propiedades ácido-básicas,
las cuales se hayan determinadas en gran medida por el numero y
el tipo de grupo R ionizables de sus cadenas
polipeptídicas. Puesto que las proteínas difieren
en composición aminoácido y secuencia, cada
proteína posee propiedades ácido-básicas
características. Los principios implicados en la
separación electroforética de las proteínas
son mejor comprendidos si en primer lugar se consideran la curva
de valoración ácido-básica de una
proteína globular de contenido aminoácido
conocido.

Hay varias formas diferentes de electroforesis,
también llamada ionoforesis, útiles para el
análisis y la separación de proteínas. El
prototipo de todos los métodos modernos es la
electroforesis libre o de frente móvil, desarrollada en
primer lugar por A. Tiselius, en Suecia, en los años 1930.
Las proteínas por tanto emigran mucho más
lentamente en un campo eléctrico que los iones
pequeños tales como Na + o Cl-, simplemente debido a que
posee una relación mucho más pequeña de la
carga o masa (1). En la electroforesis, libre, una
disolución tamponada de la mezcla de proteínas se
coloca en una célula de observación de forma de U
mayúscula, depositando una capa de tampón puro
sobre la disolución de proteína. La célula
se mantiene sumergida en un baño a temperatura constante,
aislada de vibraciones, y se establece un campo eléctrico
entre los electrodos; Las proteínas cargadas negativamente
se desplazan hacia el ánodo y las que poseen carga
positiva hacia el cátodo. (2)

Objetivo General

Lograr llevar a cabo la electroforesis con el DNA de la
muestra de brócoli.

Objetivos Específicos

  • Conseguir la extracción del DNA del
    brócoli.

  • Observar si la muestra se movió al polo
    negativo de los electrodos (que en este caso es lo que se
    espera).

  • Aprender a usar el equipo de
    electroforesis.

Material y
Métodos

A) Materias Primas

Espinacas (1/2 taza), cebolla o
brócoli.

Agua de la llave (la necesaria).

B) Material De Laboratorio

1 licuadora.

1 colador.

1 cuchara.

1 matraz Erlenmeyer.

1 micropipeta.

3 tubos de 50 ml.

1 palito de madera.

Sustancia

Alcohol (etanol 96% o isopropanol
96%)

Detergente (30 ml).

Enzimas (pizca de ablandador de
carne).

Sal de mesa

C) Equipo

Equipo de
Electroforesis.
Se uso para
separar las proteínas del DNA.

D) Métodos

Los pasos que realizamos para la elaboración de
electroforesis fueron necesarios en la medida de que eran
estrictamente indispensables, todos y cada uno, por ejemplo; Al
licuar la muestra de brócoli (trituración
mecánica), lo que se pretendió realizar fue un
rompimiento de la pared celular para liberar los contenidos
celulares al medio. Se añadió una pizca de sal, ya
que era necesaria para formar el efecto buffer, cuyo objetivo es
la unión al dominio hidrofílico de las
proteínas, permitiendo la resolubilización al
aumentar la carga de las proteínas, lo que ocasiona un
término de repulsión electrostática
proteína-proteína elevado (3), asi como evitar el
cambio de PH. A continuación se añadió 10 ml
aproximadamente de detergente, el cual precipita las
poteínas (histonas) que estan unidas al DNA. El alcohol es
para desnaturalizar las proteínas. El siguiente paso fue
añadir una pizca de ablandador de carne para separar las
histonas del resto de la cadena de DNA y finalmente se
añadió alcohol a la solución, ayudando a que
las proteínas se precipitaran, dejando en la superficie el
DNA libre.

Desarrollo
Experimental

1.- Cortar en pequeños trozos el
brócoli.

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2.- Licuar a máxima velocidad por 15
segundos:

½ taza de muestra (brócoli).

1 taza de agua fría (200 ml).

Una pizca de sal (media cucharadita).

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3.- Colar la mezcla.

4.- Verificar cuánto volumen se obtuvo y agregar
1/6 de este volumen de detergente (para 150 ml de muestra, 30 ml
de detergente). Revolver la mezcla con la cuchara.

5.- Dejar reposar por 10 min.

6.- Pasar la mezcla a tubos de ensayo (1/3 del volumen
en cada tubo).

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7.- Añadir una pizca de ablandador a cada
tubo.

8.- Agitar suavemente (por inversión 4 o 5
veces).

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9.- Añadir el alcohol lentamente por las paredes
del tubo hasta que se formen dos fases iguales (v/v,
1:1).

10.- El DNA formará una hebra transparente. Usar
un palito de madera para sacar las hebras de DNA del
tubo.

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Diagrama De Flujo Para la
electroforesis

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Procedimiento para electroforesis de DNA en
gel de Agarosa (1%)

1.- Pesar 0.3 g. en matraz Erlenmeyer

2.- Añadir 30 ml de solución amortiguadora
Tris Acetato EDTA (TAE) 1X

3.- Calentar en horno microondas hasta que se disuelva
la agarosa totalmente (solución totalmente
transparente).

4.- Dejar enfriar hasta 50 ºC.

5.- Colocar el peine en la charola y vaciar la agarosa
evitando la formación de burbujas.

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6.- Dejar que el gel se solidifique a temperatura
ambiente (˜ 30 minutos) el gel tomará una apariencia
opaca.

Diagrama De Flujo Para la
electroforesis

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Para cargar el gel:

1.- Colocar el gel dentro de la cámara de correr
la electroforesis.

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2.- Añadir suficiente TAE 1X hasta cubrir
completamente aproximadamente 0.5 cm sobre el gel.

3.- Cargar el equipo de electroforesis. Conectar los
electrodos positivos (rojos) y negativos (negros) a los
terminales correspondientes.

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5.- Prender el equipo, seleccionar el voltaje deseado
(˜ 100 voltios). Si el equipo esta funcionando bien,
entonces se podrá observar burbujas saliendo de los
electrodos. Asegurarse de que las muestras están corriendo
en la dirección correcta, hacia el electrodo
positivo.

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6.- Correr la electroforesis hasta que las muestras se
hayan movido entre la mitad y tres cuartos del plato de
gelatina.

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Diagrama De Flujo Para la
electroforesis

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Resultados y
Discusión

La
extracción del DNA del brócoli se logró
llevar a cabo con éxito, ya que en la muestra se
observaron las hebras de DNA suspendidas en la solución.
De la muestra que se obtuvo de DNA se realizó la
electroforesis dando resultados negativos, donde se
observó que no fue posible la
separación.

Esto se pudo deberse a que la muestra ya
era muy vieja.

Conclusiones

Se pudo decir que el objetivo general no se
cumplió debido a que la muestra de DNA que se uso fue muy
pequeña, por lo cual el traslado de las proteínas
al polo negativo del equipo de electroforesis nunca se
ejecutó. Aunque a pesar de todo se lograron cumplir
algunos objetivos específicos como fueron la
extracción de DNA de la muestra de brócoli,
así como se aprendió a utilizar el equipo y todos
sus componentes, para la separación por medio de
electroforesis.

Referencias
Bibliográficas

  • 1.  T. Flores de L. / C. García de D. I
    / M. García G. / A. Ramírez de D.
    (2001)

"Química"

Editorial Publicaciones Cultural. 56
Pág.

2. Lenhinger

"Principios de Bioquímica"

Ed.Omega. 170 – 180 pags.

3.- Cheftel JC, Cuq JL and Lorient
D.

"Proteinas Alimentarias"

Editorial Acribia S.A. (1989). 147
pag.

 

 

Autor:

Clemente Gonzälez Manuel Isaias

Hurtado Vargas Santiago

Muratalla Salcido Jesús

Salas Torres Mireya

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

TITULAR:

ING. NAHÚM CASTELLANOS
PÉREZ

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"INGENIERÍA DE
BIOSEPARACIONES"

PRÁCTICA II

JIQUILPAN DE JUAREZ MICH. A 19 DE
SEPTIEMBRE DEL 2009.

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