Arginasa

4443 palabras 18 páginas
Estudios de Purificación y Propiedades Cinéticas de Arginasa de Hígado de Rata

Resumen Arginasa es una enzima implicada en la última etapa del ciclo de la urea, actuando sobre arginina(Arg) para formar ornitina y urea como productos( proceso dependiente de Mn+2). Con el fin de determinar las propiedades de dicha enzima, se extrajo la arginasa desde un macerado de hígado de rata, purificándose con sulfato de amonio y métodos de separación cromatográficos, para luego proceder a analizar parámetros de estabilidad de la enzima, tales como co-factores, interferentes, pH óptimo, entre otros. Además de esto, se efectuó el estudio de parámetros cinéticos de la enzima obteniendo valores para Km y Vmax de ….. mM y ……..
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La cuantificación de arginasa se efectuó por método de Bradford[19],utilizando albúmina sérica de bovino como estándar, en el cual se realizaron 3 diluciones de la enzima, siendo 1:10, 1:100 y 1:300.

Precipitación con Sulfato de Amonio
Se precipitaron 5 mL de extracto de hígado de rata con sulfato de amonio 30% (0,88 g), en frio y en constante agitación por 30 min, y se centrifugó por 20 min a 5000 rpm. El sobrenadante fue separado del precipitado y sometido al mismo proceso de precipitación, pero esta vez al 70% de saturación de (NH4)2 SO4, la Arginasa se localiza en el precipitado final. Aquel se resuspendió en 500 µL de solución TRIS 10 mM pH 7.5 y MnCl2 2 mM. Para extraer el exceso de iones se procedió a dializar la suspensión en una membrana permeable a iones durante toda una noche en 2 litros de solución TRIS 10 mM pH 7.5 y MnCl2 2 mM.

Cromatografía de intercambio iónico Las columnas utilizadas fueron DEAE- y CM -celulosa, éstas se cargaron con 500 µL de dializado obtenido desde hígado de rata y se lavaron con un buffer Tris 10mM pH 7.5 obteniendo de estas las fracciones de lavado. Luego, se lavaron nuevamente pero con Tris 10mM pH 7.5, y NaCl 300 mM, y estas fracciones fueron las del eluido para ambas columnas cromatográficas.
Las fracciones que se recolectaron para cada columna cromatográfica fueron 20 tanto para el lavado como para el eluido, y tuvieron un volumen de 2.5 ml por tubo con goteo lento, a continuación se determinó

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