Caracterizacion cinetica de la beta glucosidasa de almendra dulce

7195 palabras 29 páginas
Caracterización cinética del mecanismo catalítico de la β- glucosidasa de almendra Pagina I. Introducción……………………………………………………………………………………………………………….2 * Objetivos experimentales…………………………………………………………………………………….2 II. Materiales y métodos………………………………………………………………………………………………..3 * Materiales…………………………………………………………………………………………………………..3 * Métodos……………………………………………………………………………………………………………..3 * Valoración de la actividad enzimática…………………………………………………….3 * Determinación de los parámetros cinéticos de la β-glucosidasa…………….4 * Determinación del pH óptimo…………………………………………………………………5 * Determinación de la temperatura optima………………………………………………5 * Cinéticas con sustratos …ver más…
Observar el efecto inhibidor de la D-glucono-1,5-lactona como análogo del estado de transición. * Cálculo de los parámetros cinéticos de la ß-glucosidasa para sustratos alternativos, salicina y celobiosa * Modificación química de la ß-glucosidasa.

II. Materiales y métodos
Materiales
* Como material biológico se utilizará una preparación comercial de β- Glucosidasa de almendra dulce (Prunus dulcis) aislada a partir de emulsina de almendra. La enzima es un homodímero (Mr = 67,000 Da por subunidad) * Reactivos: * Tampón citrato sódico 100 mM, pH 5.0 (pKa3 = 5.4) * NaOH 0.2 N * El resto de los reactivos están preparados en el tampón citrato 100 mM, pH 5.0: * ß-glucosidasa, solución 170 nM (50 μg sólido/ml) * ß-glucosidasa, solución 3.4 μM (1 mg sólido/ml) * pNP (p-nitrofenol) 25 mM [Inf. Seguridad– pNP: R20 R21 R22 R33; S28 (MSDS10)] * pNPG (p-nitrofenil-ß-D-glucósido) 50 mM * Salicina 100 mM - Celobiosa 200 mM * Glucosa 2.0 M * δ-gluconolactona 20 mM [Información de Seguridad – δGL: S24 S25 (MSDS 15)] * Kit comercial Liquichem® GOD-POD * Tampón ácido cítrico –Na2HPO4 (0,1-0,2M) en el intervalo de pH 3,0-7,2
Métodos
En todos los métodos utilizados, el procedimiento de ensayo es el mismo (excepto cuando se indique lo contrario). El procedimiento a seguir es el siguiente: se toman 0,9 mL tampón citrato en los que se encuentra el sustrato y se atemperan 5 minutos a

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