Cromatografía De Filtración En Gel

1477 palabras 6 páginas
CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL
1.- FUNDAMENTO TEÓRICO
La cromatografía de exclusión o filtración en gel es una clase de cromatografía sólido-líquido que permite la separación de moléculas en función de su tamaño. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria es un gel, que se introduce en una columna como soporte cromatográfico. El gel está constituido por partículas esféricas que tienen poros de un determinado tamaño. Las moléculas de pequeño tamaño difunden a través de los poros de las partículas del gel y por ello son retardadas en su paso por la columna. Las moléculas grandes no entran en los poros de las partículas del gel y por ello eluyen rapidamente en lo que se denomina “volumen vacio” de la columna, se dicen que
…ver más…
- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
3.1. - Preparación del hemolizado:
Se recoge la sangre de rata en tubos de vidrio graduados con heparina 1% como anticoagulante. Se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 5 minutos, aspirando el plasma con pipeta Pasteur. Se resuspenden los hematíes en 4-5 ml de NaCl 0.9%, se agita y se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones.
Esta operación de lavado se repite dos veces más. Los hematíes se hemolizan añadiendo 4 volúmenes de agua destilada y 0,4 volúmenes de cloroformo, se agita y se centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 20 minutos. Recoger el sobrenadante.
3.2. - Hinchado del gel:
Se añaden 25 ml de tampón fosfato por gramo de gel. Se deja hasta el día siguiente. De este modo, se consigue la estructura de retícula tridimensional que permite la separación de las moléculas de la muestra ya que cada bolita de gel seco absorbe el tampón, aumentando su volumen . Se partirá del gel hinchado. 3.3. - Empaquetado de la columna:
Con la llave de la columna cerrada se comienza a añadir, usando una pipeta Pasteur, aproximadamente
15 ml de suspensión del gel, dejándola resbalar por la pared de la columna para evitar que se formen burbujas de aire en el interior del gel. Con el tiempo, el gel va

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