Cuantificación de proteínas por espectroscopia de absorción método de bradford

1631 palabras 7 páginas
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA METROPOLITANA Departamento de Biotecnología

Laboratorio de Bioquímica

Cuantificación de proteínas por espectroscopia de absorción Método de Bradford

Introducción Los métodos espectroscópicos permiten estudiar la estructura tridimensional de moléculas biológicas y los cambios conformacionales que ellas experimentan
Por otra parte, durante los procedimientos de separación de una muestra y obtención de una proteína pura es a menudo necesario conocer la concentración de proteínas en las sucesivas etapas del proceso. Esto es de particular importancia cuando se está estudiando una proteína con algún tipo de actividad, como por ejemplo las enzimas, para determinar la actividad específica y el
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Agitar por 1 minuto y dejar reposar en hielo por 3 minutos. 3. Repetir esta operación dos veces más. 4. Luego centrifugar a 10.000 rpm por 10 minutos a 4º C. El sobrenadante contiene la fracción de albúminas 5. Guardar las fracciones obtenidas para el práctico 3 (electroforesis)

II. Determinación de la concentración de proteínas de la fracción de albúminas

1. Preparar soluciones de concentración conocida de BSA según tabla (1-3) 2. Diluir las fracciones 1/20 (250 l de fracción en 4,75 ml de buffer de extracción) 3. Medir absorbancia de estas soluciones y de las fracciones de albúminas diluidas. Blanco para curva: agua más reactivo de Bradford; blanco para fracciones: solución de extracción más reactivo de Bradford 4. Hacer una curva estándar con estas soluciones según tabla (1-3) 5. Determinar concentración de las fracciones
Método 1 (ensayo en cubetas)

1. Colocar en una gradilla 9 tubos de ensayo y 9 tubos eppendorf y rotular 2. Preparar un conjunto de 9 soluciones estándar (1 ml) en el rango 0 –0,9 mg/ml a partir de una solución stock de BSA de 1 mg/ml en los tubos de ensayo 3. Pipetear 100 l de cada solución en un correspondiente tubo de ensayo 4. Agregar 5 ml de reactivo de Bradford diluido y mezclar inmediatamente 5. Esperar por lo menos 5 minutos para que se desarrolle el color, y leer en espectrofotómetro a 595 nm (en duplicado) 6. Diluir las fracciones de albúmina obtenida en

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