PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA BADH DE P. aeruginosa POR CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO Y ENSAYO DE SU ACTIVIDAD

1179 palabras 5 páginas
INTRODUCCIÓN

La purificación de las enzimas requiere técnicas y tratamientos bioquímicos y suele realizarse en varios pasos combinando la centrifugación y ultracentrífuga, la precipitación de las proteínas con sales o calor, la separación en columna mediante cromatografías de exclusión molecular, de intercambio iónico o de afinidad, o la separación en geles de electroforesis. Lo ideal es poder purificar la enzima con un alto rendimiento empleando el menor número de pasos posibles.( Castillo,2005)
La Betaína Aldehído Deshidrogenasa (BADH) pertenece a la familia de las aldehído deshidrogenasas, enzimas que catalizan la oxidación irreversible, de los aldehídos a sus correspondientes ácidos carboxílicos, con la concomitante reducción del
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La velocidad a la cuál una proteína se mueve a través del gel depende del tamaño del poro del gel y de la fuerza del campo eléctrico. En la técnica más poderosa para separar mezclas de proteínas, estas son expuestas al detergente iónico SDS antes y durante la electroforesis en gel. El SDS desnaturaliza las proteínas, haciendo que las proteínas multiméricas se disocien en subunidades y todas las cadenas polipeptídicas son forzadas a adoptar conformaciones extendidas con relaciones carga: masa similares.(Harvey,2005)

OBJETIVOS
Purificar a homogeneidad en un solo paso cromatográfico la enzima betaína aldehído deshidrogenasa (BADH) de P. aeruginosa.
Determinar la pureza de la BADH, por medio de electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE).
Conocer el peso molecular de esta enzima a través del mismo método electroforético (SDS-PAGE). MATERIAL Y MÉTODOS

Se retiró de la columna los tapones inferior y superior y se depositó con la jeringa 1 mL de Amortiguador I sobre la resina Q-FastSefarosa. Posteriormente se colocó el tapón superior sobre la columna y se agregaron 9 mL más del mismo amortiguador. Para equilibrar la resina se hizo pasar el líquido a una velocidad de 1 gota/2 seg.
Después se agregaron 2 mL del extracto celular sobre la resina y se retiró el tapón inferior,recolectando el líquido en un frasco limpio. Cuando toda la muestra ingreso a la resina, se

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