Purificación lisozima de huevo

2517 palabras 11 páginas
Práctica 3
Purificación de una enzima: La lisozima de huevo

Introducción
El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos β(1→4) de los polisacáridos de pared celular bacteriana. Son proteínas globulares constituidas por una sola cadena polipeptídica (129 aminoácidos para la lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 kDa. Estas proteínas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad. La lisozima fue la primera proteína secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso un modelo tridimensional (usando cristalografía de rayos X) y la primera para la que se propuso un mecanismo
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REACTIVOS
• Tampón fosfato sódico 100 mM, pH 6,2
• Suspensión de la bacteria Micrococcus lysodeikticus 20 mg en 100 ml de tampón fosfato.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. En una cubeta de espectrofotómetro, añadir 3 ml de suspensión de pared bacteriana. Meterla en el espectrofotómetro y anotar la densidad óptica. Esta media constituye la absorbancia a tiempo cero y hay que hacerlo para cada fracción. Previamente ajustamos el espectrofotómetro con la cubeta vacía para establecer el cero.
2. tomado el dato a t=0, añadir 25 μl de la fracción correspondiente a ensayar en esa misma cubeta, tomar el tiempo con el reloj, e introducir la cubeta en el espectrofotómetro. Anotar la medida observada al primer minuto y al segundo minuto. Calcular la variación de absorbancia al primer minuto (ΔA1/min) y al segundo minuto (ΔA2/min). Hacer la media de las dos medidas.
Anotar los resultados en la tabla siguiente:

| Volúmenes(ml) | Absorbancia a t=0´ | Absorbancia a t=1´ | Absorbancia a t=2´ | A1min | A2min | ATmin | Actividad(U) |
F0 | 10ml | 0,9810 | 0,8160 | 0,7550 | 0,1650 | 0,0610 | 0,1130 | 45,20 |
F1 | 13ml | 1,0740 | 1,0279 | 0,9346 | 0,0461 | 0,0933 | 0,0697 | 36,24 |
F2 | 10ml | 0,9780 | 0,8950 | 0,8100 | 0,0830 | 0,0850 | 0,0840 | 33,60 |
F3 | 4ml | 0,6680 | 0,5330 | 0,3980 | 0,1350…

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