Isquemia cerebral, modelos experimentales y agentes neuroprotectores

Las enfermedades cerebrovasculares (ECV) se catalogan como la primera causa de incapacidad permanente en distintos países principalmente industrializados, generando altos costos financieros y sociales, ya que buscan la prevención, el control y el incremento de los recursos terapéuticos para disminuir la morbilidad y mortalidad asociada a estas enfermedades las cuales se posicionan como la tercera causa de muerte en el mundo (Asplund et al 1995). Cada año aproximadamente 795.000 personas presentan un ataque cerebrovascular nuevo o recurrente, el cual produce limitaciones de gran relevancia a personas que logran sobrevivir al daño (Leiva et al 2013). Dentro de las ECV, la isquemia es la patología con mayor frecuencia, presentando una prevalencia entre el 85-90%; esta es clasificada en varios subgrupos de acuerdo con el mecanismo y las categorías clínicas. Debido a la gravedad, la acción rápida de la enfermedad y la limitada accesibilidad al cerebro humano se hace necesario la utilización de modelos experimentales que permitan conocer y estudiar la patogénesis de la isquemia a partir de los mecanismos celulares y moleculares implicados (Montaner 2008).

La Isquemia cerebral es ocasionada por la disminución del flujo sanguíneo a tal nivel que interfiere en la función normal del SNC. Esta depleción se produce por el desequilibrio de diversos factores hemodinámicos, los cuales desencadenan una serie de alteraciones metabólicas y bioquímicas que tienen lugar tanto en las neuronas como en la glía, y que como consecuencia final llevan a la necrosis celular (Siesjö 1984). Entre los principales factores que pueden condicionar a la aparición del infarto, encontramos la hipoxia y la hipoglucemia. La primera trae consecuencias dependiendo su grado de exposición, cuando la presión de oxígeno disminuye moderadamente ocasiona un leve aumento del flujo cerebral, a cifras menores de 40 mmHg origina confusión, y por debajo de los 20 mmHg trae un estado de coma. Los efectos de la hipoxia son potenciados por la presencia simultánea de hipotensión arterial como sucede durante el shock o en el paro cardiorrespiratorio cuando estas condiciones persisten unos minutos ocasionan daño cerebral irreversible, afectando principalmente la sustancia gris, zonas vasculares fronterizas y de los territorios arteriales más distales (Siesjö et al 1995; Pulsinelli et al 1995; Shiraishi 1985; Back et al 1995). Por otra parte, la hipoglucemia a concentraciones inferiores de 20 mg/dL origina confusión y coma por debajo de los 10 mg/dL. Cuando los depósitos de glucosa se agotan completamente, el cerebro comienza a metabolizar otras sustancias las cuales generan lesiones estructurales, que consisten en una necrosis neuronal cortical selectiva, con preservación del tejido glial (Shiraishi 1985). El término ""isquemia cerebral"" suele evocar un enmarañado algoritmo en el que múltiples cascadas de eventos celulares se activan secuencialmente en el parénquima cerebral expuesto a un flujo sanguíneo reducido. Todos los procesos de daño celular iniciados por el déficit en el aporte de oxígeno y glucosa al tejido nervioso confluyen en la despolarización masiva de las neuronas, la liberación incontrolada o ""excitotóxica"" de neurotransmisores excitatorios y la consiguiente activación incontrolada de enzimas calcio-dependiente como fosfolipasas y proteasas que degradan irreversiblemente las proteínas y fosfolípidos de las membranas celulares determinando finalmente la muerte celular (Back et al 1995).

En la experimentación realizada para el estudio de la isquemia cerebral humana, se ha recurrido a la necesidad de trabajar con modelos experimentales debido a la relevancia del carácter agudo de esta enfermedad. Los modelos experimentales de isquemia cerebral han permitido el estudio de la enfermedad en condiciones controladas y reproducibles, estos estudios han sido de vital importancia ya que han establecido nuevos conceptos sobre los mecanismos subyacentes al daño cerebral isquémico tales como la zona de penumbra, el daño por reperfusión, los mecanismos de muerte celular, el daño ocasionado a las mitocondrias, células gliales y la sustancia blanca, entre otros. Como tal estos modelos hacen que obtengamos conocimientos preliminares sobre los procesos patobiológicos asociados al daño isquémico (Prieto et al 2011). Entre los modelos experimentales trabajados en isquemia cerebral encontramos los siguientes:

Modelos in vivo

Los modelos animales para isquemia cerebral tienen como propósito el evitar que la glucosa llegue al cerebro y que el oxígeno ingrese al tejido cerebral, con el fin de intentar reproducir el daño cerebral. Debido al parecido anatómico y fisiológico del cerebro humano con el de algunos vertebrados mayores se ha podido desarrollar multitud de modelos in vivo, entre los cuales son más comunes las ratas y ratones debido a su fácil manejo, menor costo de manutención y mayor aceptación ética. Existen ciertas consideraciones que se deben tener en cuenta a la hora de escoger el modelo adecuado para poder cumplir los objetivos de la investigación. Entre los cuales encontramos:

Modelo espontáneo, inducido o transgénico.

El modelo inducido suele ser el más habitual, ya que las enfermedades no se producen con la frecuencia deseada. Inducir la enfermedad nos permite conocer los parámetros iniciales del modelo además de tener las condiciones controladas. En los modelos espontáneos podemos citar un ejemplo, la cepa de ratas espontáneas hipertensas SHR (spontaneus hipertense rats), desarrollada hace más de 30 años a partir de ratas Wistar Kyoto. Sometiendo a estrés crónico a esta cepa se observó que desarrolla hipertensión arterial de manera espontánea entre las 7 y las 15 semanas de edad y que el 30% se veía afectada por una isquemia cerebral. Las cepas genéticamente modificadas han sido de gran utilidad para estudiar la implicación de un gen o una proteína en los mecanismos que ocurren en la cascada isquémica (Okamoto 1969; Boada et al 2011).

Elegir especie y cepa

Los modelos de isquemia cerebral pueden abarcar diferentes especies entre las cuales se tienen, ratones, ratas, gerbos, conejos, gatos, cerdos, perros, primate no-humanos. Aunque en los animales de mayor tamaño se hace más fácil supervisar variables fisiológicas a lo largo del tiempo y su cerebro es estructural y funcionalmente más similar al cerebro humano, sigue siendo muy costosa su manutención, de mayor dificultad su manejo además de que son éticamente más cuestionable. Los pequeños animales como los roedores aun cuando han presentado diferentes limitaciones, como lo es el hecho de que posean un cerebro sin circunvoluciones, han logrado aportar conclusiones de gran relevancia para el entendimiento de esta patología y siguen siendo los modelos más utilizados. Entre las cepas de roedores más utilizadas para isquemia cerebral se tienen, la New Zealand en conejo, las Sprague-Dawley (SD), Wistar, Fisher, Wistar Kyoto (wky), SHR, en ratas CD1, C57BL/6, BALB/C o C57BL/6 en ratos, entre otras (Guallace & Cuturini 2011).

Género y edad.

Esto dependerá de que cual pueda expresar mejor y con mayor frecuencia la enfermedad, en Isquemia la mayor parte de los estudios son realizados en machos, debido a ciertas condiciones hormonales, las hembras presentan volúmenes inferiores de infarto que los machos. En cuanto a la edad, generalmente se utilizan individuos jóvenes, pero con un tamaño mínimo que permita comodidad en el abordaje quirúrgico principalmente (Siesjö 1984).

Variables fisiológicas.

• El daño Isquémico depende del tiempo de isquemia.

• La T° determina el tamaño de la lesión Isquémica. Mientras el animal se encuentre anestesiado se debe usar mantas que permitan mantenerlo a una T° de 37°C, ya que la hipotermia actúa como neuroprotector reduciendo el tamaño del infarto.

• Presión sanguínea de CO2, de O2 y el pH también determinan el tamaño del infarto.

Anestesia y Eutanasia.

Estos parámetros pueden afectar y modificar los resultados expresados por el modelo. Los anestésicos se pueden administrar de dos formas, inhalados y los de administración intraperitoneal. Los primeros son las más utilizados ya que permiten un control continuo del modelo durante todo el procedimiento quirúrgico, sin embargo, ha presentado varios puntos controversiales ya que puede presentar características neuroprotectoras a corto plazo, es el caso de anestésico isoflurano y halotano. Los anestésicos intraperitoneales como la ketamina-zilamina también pueden presentar efecto neuroprotector, siendo su aplicación menos cómoda y su tiempo de acción limitado, aun así, siguen siendo muy utilizados (Gisberng et al 1990).

Procedimiento quirúrgico.

Es importante tener un grupo control falso o grupo sham. Entre los mecanismos utilizados para lograr la isquemia cerebral encontramos:- Mecanismos de excitotoxicidad. Se activan receptores como el NMDA o el AMPA, los cuales provocan aumento de iones intracelulares, lo cual conduce directamentes a una homeostasis celular grave. También se inyectan sustancias como el ácido Kaínico intoxicando ciertas zonas del cerebro (comúnmente es el hipocampo).

– Reducción total o parcial del flujo sanguíneo, mediante electrocoagulación, inducción de trombosis fotoquímicamente, por oclusión mecánica o por oclusión embolica con un coágulo o con microesferas. (Kounstantin 2008).- Normalmente para delimitar la zona de la lesión se realiza tinción histológicas clásicas, como la hematoxilina – Eosina, aunque existen otras técnicas de valoración más precisas (Bread et al 2008).

Modelos in vitro

Los modelos experimentales in vitro son aquellos que permiten estudiar la patología fuera de un organismo vivo en los cuales han sido reproducidos parcialmente las condiciones existentes in vivo. Se pueden realizar estudios a nivel celular y tisular, ejerciendo en ambos casos un control total sobre condiciones fisicoquímicas como el pH, temperatura, presión osmótica, presión de O2 y de CO2 (Hernandez 2006).

El estudio de la Isquemia Cerebral a nivel celular y tisular a través de cultivos in vitro facilita la investigación sobre funciones fundamentales como la diferenciación, proliferación y muerte celular; además posibilita el desarrollo de ensayos de toxicidad farmacológica o estudios de la expresión génica y proteica en un ambiente isquémico. Aunque los in vivo resultan más llamativos debido a que con ellos se reproduce la enfermedad de forma bastante exacta en un organismo vivo, los modelos in vitro permiten un estudio más aislado en un contexto muy específico de los procesos biológicos (Beltran et al 2016).

Por tal motivo responden de manera más precisa a las hipótesis planteadas; sin embargo, hay que ser más precavidos al momento de hacer la traslación de los resultados a un contexto in vivo, en especial cuando se busca extrapolar al contexto humano.

Sostenimiento in vitro

La vigilancia de la mayoría de los sistemas de cultivo in vitro debe converger en tres factores que son claves:

• El mantenimiento de la temperatura debe estar ajustada a los 37°C con diminutas fluctuaciones.

• El entorno debe ser ideal, con una atmósfera húmeda que presente una concentración aproximada del 5% de CO2 en el aire.

• El medio de cultivo debe aportar todos los requerimientos nutricionales esenciales para cada uno de los sistemas y contar con un pH ajustado.

La correcta manipulación de estos factores en especial la temperatura y la atmósfera de crecimiento están relacionadas al uso de mecanismo de incubación, los cuales facilitan el sostenimiento de los cultivos y el control exacto de los parámetros.

Cultivos organotípicos

Estos modelos experimentales tienen como base principal obtener el parénquima cerebral y cultivarlo en un sistema experimental ex vivo; se caracteriza por presentar ciertas ventajas frente a cultivos celulares primarios. En este sentido los cultivos organotípicos permiten trabajar el tejido en etapa postnatal entre los días 0 y 20, durante la disgregación del tejido para los cultivos primarios deben realizarse solo en embriones (Siesjö 1984).

Cultivos de células

El modelo in vitro de células puede llevarse a cabo de forma pura o mixta; en la primera el 100% de las células son del mismo del mismo tipo y es un sistema que permite estudiar su implicación o una respuesta concreta, y en la segunda se contienen células de distintos tipos y es un modelo utilizado para estudiar una vía más cercana al fisiológico. Normalmente las células tienen crecimiento en monocapa, lo que significa que estas se adhieren al substrato e inician su proceso de proliferación; por tal motivo algunos tipos o líneas celulares necesitan que el fondo de la placa sea recubierto previamente con el substrato indicado (Montaner 2009).

Cultivos celulares primarios

Los cultivos celulares primarios por excelencia para realizar estudios de I.C son los neuronales en especial las corticales o de hipocampo, provenientes de los embriones de ratas que se encuentren en los días 16 y 18 de su estado embrionario. Las células obtenidas del proceso de disgregación deben mantenerse en un medio de cultivo apropiado, haciendo un recambio de medio cada 3 o 4 días; usualmente no sufren una división, pero si maduran y se trabajan con aquellas que tienen de 10 a 16 días, momento en el cual los receptores NMDA ya se encuentran totalmente madurados (Ginsberg 1990).

Otro tipo células que son ampliamente utilizadas son los cultivos celulares de glía consideras de soporte vital para la correcta funcionalidad neuronal; estas se obtienen generalmente de la disgregación del córtex cerebral de cría de roedores que se encuentran entre el 0 y 3 días postnatal. Las células deben mantenerse generalmente suspendidas en un suero DMEM, y ser sembrado en una alta densidad (Siesjö 1984). De esta manera es posible originar una capa de astrocitos ricos en filamentos gliales, oligodendrocitos y microglía en la superficie;

Líneas de células

Estas líneas por lo general se encuentran modificadas genéticamente y por ende pierden algunas de las características de la cepa original, sin embargo, resultan ser muy útiles debido a la capacidad que tienen de extenderse. Algunas de las más utilizadas son aquellas que derivan del neuroblastoma (SH-SY5Y), de una feocromocitoma (PC12) siendo esta de especial interés para estudios de plasticidad neuronal, ya que en presencia del factor NGF frenan su proceso de crecimiento y padecen una diferenciación neuronal, apareciendo dendritas, axones y conexiones. Al igual también son utilizadas los astrocitos humanos (SW1088) o células endoteliales transformadas humanas(BMEC) o de roedores (RBE4).

Modelos de barrera hematoencefálica

Teniendo en cuenta todas las dificultades que conllevan el desarrollo de modelos in vivo y al sistema vascular cerebral que supone la BHE y la significancia de una patología como la I.C, el tratar desarrollar este tipo de modelos resulta de gran interés para la investigación; sin embargo, aunque en la actualidad se han elaborado múltiples ensayos no se con un modelo establecido (Montaner 2008). El cultivo se puede iniciar a partir de los cerebros de ratas y ratones, aunque se considera que es más fácilmente obtenerlos a partir cerebros bovinos, al igual que de células humanas.

Dado que células endoteliales de los capilares cerebrales son los encargados de la formación BHE, estos son considerados como modelos simples de barrera.

Valoración del Modelo In vitro

Después de desarrollar el modelo más adecuado para cada uno de los estudios, se llega al momento de la evaluación para determinar cuál es la respuesta celular de la patología, eficiencia de un tratamiento y el grado de neuroprotección. A su vez identificar la morfología, y que metodologías anexas se van a utilizar (inmunohistoquímica/citoquimica, RT-PCR).

Cuando el ictus isquémico no es mortal deja secuelas con repercusiones eminentemente motoras, cognitivas, comportamentales de afectividad, entre otras (Llorca et al 2015). Los trabajos tanto in vivo como invitro plantean modalidades terapéuticas dirigidas a detener la cascada isquémica cerebral mediante la administración de diversos fármacos neuroprotectores (Ruiz et al 2005; Ruiz et al 2008; Grimaldi et al 2005; Baughman et al 2002). Cada uno de los mecanismos que participan en el daño isquémico es una oportunidad de intervención de la cascada, dado que la isquemia cerebral no es un evento único sino un proceso, y como tal, es posible modificar su curso y alterar su resultado (Grimaldi et al 2005; Perez et al 2006; Fitch 2002).

Entre algunos de los métodos y agentes con potencial papel neuroprotector se conocen, la hipotermia, los captadores de radicales libres, la inhibición de la actividad neuronal, los antagonistas del calcio, los moduladores de las bombas de iones, entre otros (Ginsberg 2009; Traystman 2010; Faden 2001). Se ha prestado preferente atención en los fármacos con potencial neuroprotector de origen natural debido a que presentan menor número de efectos secundarios en los organismos que los consumen. Un ejemplo de esto es La planta Cannabis sativa la cual ha sido utilizada desde hace más de 8000 años, extendiéndose su uso por todo el mundo. Dicha difusión fue causada por sus usos analgésicos, anestésicos, recreativos e incluso textiles (Bruneton et al 2001).

C. sativa es una planta herbácea, cuyo interés farmacológico reside en los cannabinoides, los cuales están presentes en sus flores y en la resina de la planta, posee alrededor de 400 componentes de los cuales 60 pertenecen al grupo de los cannabinoides. Los principales son cannabinol (CBN), cannabidiol (CBD) y tetrahidrocannabinol (THC), siendo este último al que se le atribuyen las propiedades psicoactivas (Bravo et al 2003). Investigaciones han evidenciado que los cannabinoides en conjunto con sus respectivos receptores acoplados a proteína G, presentan actividad de supresión en la producción de variedad de citoquinas pro-inflamatorias en cultivos de células humanas y modelos animales, inhibición de producción de factores de necrosis tumoral como el TNFa y también parecen jugar un papel importante en la regulación de la migración de células de neutrófilos, macrófagos, NK y células B, entre muchas otras funciones (Saito et al 2012).

Aplicaciones terapéuticas de los cannabinoides en las principales enfermedades neurodegenerativas

En la enfermedad de Alzheimer los efectos protectores de algunos cannabinoides están relacionados con la regulación directa del receptor de NMDA, ya que los cannabinoides no psicotrópicos, como HU-211, actúan como un inhibidor estereoselectivo del receptor de NMDA (Campbell & Gowran 2007). Los receptores CB1 de cannabinoides protegen las neuronas de la citotoxicidad, y también inhiben la liberación de glutamato, lo que puede contribuir a una reducción de esta citotoxicidad, además pueden reducir el estrés oxidativo, la neuroinflamación y la apoptosis que es provocada por Aß, promoviendo mecanismos de reparación intrínsecos del cerebro. El ?9 -THC puede aumentar la disponibilidad y reducir ACh amiloidogénesis, aunque se deben estudiar más a fondo los posibles efectos secundarios psicoactivos ya que pueden obstaculizar su implementación clínica (Moreno et al 2012). En la enfermedad de Huntington estudios señalan que ?9 -THC y CBD, protegen las neuronas estríales contra la toxicidad causada por el complejo mitocondrial II inhibidor ácido 3-nitropropiónico (3NP) que produce la lesión oxidativa, alivian los síntomas hipercinéticos, dado sus efectos inhibitorios sobre el movimiento y, en particular, se están estudiando como agentes modificadores de la enfermedad (Valdeolivas et al 2012). Por otra parte, la activación de los receptores cannabinoides puede inhibir la liberación de GABA (Rubio et al 2011).

En la enfermedad de Parkinson y la esclerosis múltiple, entre otras, se ven altamente implicados cannabinoides como agentes neuroprotectores principalmente el ?9-THC.En numerosos modelos experimentales de Parkinson se ha comprobado que actúa como protector de las neuronas de la sustancia negra contra la muerte causada por diferentes estímulos citotóxicos, este actúa a través de mecanismos antioxidantes que parecen ser independientes de receptores (Garcia et al 2015).Otro ejemplo es el fitocannabinoide ?9-tetrahidrocannabivarina (?9-THCV) el cual tiene un perfil farmacológico que parece ser particularmente apropiado para la E.Parkinson (Garcia et al 2011). En la esclerosis lateral amiotrófica gracias a la interacción que tiene las sustancias cannabinoides con sus receptores y los neurotransmisores, especialmente con el GABA, se ha demostrado que asociaciones de ?9 -THC y cannabidiol (CBD) disminuyen los movimientos espásticos en personas con EM e incluso proporciona efectos analgésicos. Estudios realizados con placebo afirman que el suministro de ?9-THC y CBD en conjunto (ya que mejoran la tolerancia y efectividad) mejoran la rigidez apenas 10 min después de la administración intravenosa, y que incluso altas dosis tienen la misma eficacia que otros medicamentos como el baclofeno. En comparación con el placebo, la asociación ?9-THC/CBD y el ?9-THC mejoran significativamente el espasmo muscular y la espasticidad, e incluso la severa (Syed et al 2014).

Se han reportado efectos protectores de los endocanabinoides los cuales parecen ser neuroprotectores en modelos animales de isquemia cerebral principalmente. Recientemente se demostró que el tratamiento con un agonista cannabinoide CB2 (activador de los receptores cannabinoides tipo CB2) fue protector en un modelo de isquemia cerebral en ratón de oclusión de la arteria media cerebral, allí fueron evaluados los efectos de la lesión en el aprendizaje y memoria y el tratamiento con O-1966, fueron evaluados en los días 6 y 7 utilizando una tarea de reconocimiento de un objeto novedoso y un procedimiento de adquisición y retención operante, y concluyeron que la activación de los receptores CB2 protegen contra los déficits cognitivos y daños en los tejidos después de la isquemia permanente (Ronca et a 2015). Se debe tener en cuenta que estos compuestos no solo pueden tener efectos benéficos cuando la lesión ya ha ocurrido, sino que también se pueden implementar en personas propensas a un infarto cerebral como mecanismo de protección preinfarto ya que las investigaciones seguirán sugiriendo que son altamente antioxidantes, inhibidores de excitotoxicidad y que se encuentran disponibles y asequibles para continuar con sus análisis y estudios que permitan impulsarlos como excelentes agentes neuroprotectores.

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Autor:

Dhizzy Cedano Toro

Oscar Diaz Dussan

Universidad del Tolima