Con estos datos, hay que deducir el número de bacterias (por ml) de agua contaminada que dan colonias rosas. Para confirmar si se trata de Salmonella o Morganella, hay que reinocularlas en caldo de urea-indol y en TSI. Sobre caldo de urea la estirpe de Morganella debe generar color azul, y en TSI únicamente la estirpe de Salmonella debe aparecer con precipitados negros (por producción de SH2 que genera sulfuro de hierro), apareciendo el resto de los caracteres siguientes:
*) A indica producción de ácido y G de gas
Transferencia genética entre bacterias gram negativas
I) Conjugación
Uno de los mecanismos más comunes de diseminación de genes en la naturaleza es la conjugación, un fenómeno mediante el cual una cepa portadora de un plásmido, denominado conjugativo, es capaz de transferir una copia de éste a una bacteria receptora casi siempre de la misma especie. No obstante, existen los denominados plásmidos conjugativos promiscuos, esto es capaces de saltar la barrera de especie y, en ciertos casos, la de género. Este mecanismo es el causante primario de la difusión de genes de resistencia a antibióticos y, por tanto, de la pérdida de efectividad de éstos observada durante los últimos años.
Superpuesto sobre la capacidad de transferencia interespecífica de plásmidos se encuentra la movilización de los genes de resistencia a antibióticos promovida por elementos genéticos denominados transposones. Un transposón es un fragmento de DNA con capacidad para cambiar de localización dentro de la misma molécula de DNA o entre moléculas distintas (ej: plásmido a cromosoma o al revés) y que en muchas ocasiones es portador de genes de resistencia a antibióticos, contribuyendo de esta forma a su diseminación.
Objetivos: Vamos a transferir un transposón que confiere resistencia a Kanamicina desde una cepa de E.coli a una cepa de Salmonella typhimurium, utilizando plásmidos derivados del conjugativo y promiscuo RP4. Como medidas de seguridad, tanto las cepas donadoras y receptoras como los plásmidos que vamos a emplear son derivados inocuos de las formas naturales obtenidos en el laboratorio.
Material biológico:
Plásmido: se utilizará el plásmido pUT (5.2 kpb). Este plásmido contiene el origen de replicación de R6K, que sólo funciona en cepas de E.coli que expresen la proteína ? desde un bacteriofago lisogénico ? (?pir), y el origen de transferencia del plásmido conjugativo RP4. El plásmido contiene también el gen de la transposasa (tnp) y un gen de resistencia a Kanamicina entre los extremos I/O de recombinación (transferible mediante la actividad transposasa). Como elemento de selección del plásmido, también lleva un gen de resistencia a Ampicilina (una ?-lactamasa, bla). Para que sea transferido, este plásmido requiere otras funciones propias de RP4, que solo se encuentran en la cepa E. coli S17-1?pir. El mapa de restricción del plásmido se presenta a continuación:
Cepas de E.coli: se emplearán las cepas de E.coli
CC118?pir y S17-1?pir transformadas con el plásmido pUT. Sólo
la cepa S17-1?pir posee la capacidad de transferir el plásmido a otras
cepas, pues contiene en el cromosoma genes de RP4 necesarios para la conjugación.
La cepa CC118?pir será empleada como control negativo en la transferencia.
Cepa de Salmonella. Utilizaremos como receptor la cepa de S. typhimurium LB5010-R2 (resistente a Estreptomicina y a Rifampicina). Esta cepa posee otras características especiales: es restricción menos, permitiendo una mayor frecuencia de transferencia, y carece de la proteína ?, por lo que el plásmido pUT no puede replicarse en ella.
Material no biológico:
Placas de agar común.
Placas de selección: se empleará agar común con Rifampicina (80 ?g/ml), y Kanamicina (10 ?g/ml).
Solución de lavado. Solución estéril de ClNa al 0.9 % (p/v).
Solución de conjugación : SO4Mg 10 mM (estéril).
Procedimiento:
1) Crecimiento de las cepas (lo harán los monitores): Se emplearán cultivos de 24 horas crecidos en caldo común conteniendo, para las dos cepas de E. coli Ampicilina (100 ?g/ml) y Kanamicina (30 ?g/ml), y para la cepa de Salmonella, Rifampicina (80 ?g/ml). Una vez crecidas, las células serán lavadas por centrifugación y resuspendidas en 1/10 del volumen inicial de SO4Mg 10 mM.
2) Sobre una placa de agar común, depositar dos filtros estériles de nitrocelulosa separados (actuarán de soporte sólido para la conjugación). Marcad en las placas debajo de cada filtro CC118 y S17. Añadir 10 ?l de la suspensión de Salmonella en cada uno de ellos, dejar que absorba el líquido y añadir sobre uno de los filtros 10 ?l de la suspensión de E.coli CC118?pir, y sobre el otro 10 ?l de la de S17-1?pir. Incubar toda la noche a 37ºC.
3) Al día siguiente, tomar cada filtro con las pinzas (en condiciones de esterilidad), introducirlo en sendos tubos estériles. Añadir 5 ml de SO4Mg 10 mM, agitar intensamente y extender 100 ?l en dos placas de selección (Rifampicina 80, Kanamicina 10). Dejar crecer a 37ºC durante toda la noche.
Resultados: Confirmar la aparición de colonias únicamente en la conjugación entre E. coli S17-?pir y Salmonella. Contar las colonias. Explicad los resultados obtenidos en el cuaderno de prácticas.
II) Transformación
La transformación es un proceso a través del cual el DNA es introducido dentro de un microorganismo. En algunas bacterias la transformación es un proceso natural e inducible que les permite la adquisición de manera activa de DNA exógeno. En otros muchos la transformación puede producirse de forma artificial mediante tratamientos químicos o físicos. En esta práctica vamos a proceder a introducir plásmidos de clonaje en una cepa de E. coli mediante el tratamiento químico de éstas.
Materiales:
Cepa de E. coli JM83. Se trata de una cepa carente de actividad ?-galactosidasa, aunque dispone de las permeasas específicas de lactosa. En ausencia de plásmidos esta cepa es sensible a ampicilina e incapaz de fermentar la lactosa, por lo que genera colonias blancas en agar lactosado de McConkey. Cuando esta cepa es transformada con un plásmido que porta un fragmento del gen de la ?-galactosidasa (fragmento alfa) la actividad enzimática es funcional y se obtienen bacterias fermentadoras de lactosa (colonias rojas en este medio). Cuando el gen de la ?-galactosidasa portado por el plásmido es interrumpido artificialmente mediante la introducción de un fragmento de DNA exógeno, este gen deja de funcionar dando lugar a colonias blancas, una propiedad muy utilizada en como indicador de clonaje.
Plásmidos: cada pareja dispondrá de una mezcla de los plásmidos pUC119 y pUC119-X.
Material no biológico:
Soluciones frías de Cl2Ca y Cl2Mg a 100 mM
Dos placas de agar lactosado de McConkey con 100 ?g/ml de ampicilina (Agar Mc de selección)
Caldo común estéril
Procedimiento:
3) Observar la cantidad y tipo de colonias que aparecen sobre cada una de las placas.
III) Transducción (Ver la práctica de titulación)
Titulación de un virus bacteriano y transducción
Titular una suspensión de virus consiste en determinar el número de unidades infectivas por ml presente en la misma. En el caso de los virus bacterianos líticos, la titulación se realiza asumiendo que cada unidad infectiva es capaz de producir una placa de lisis sobre un césped bacteriano, lo que es cierto para bajas multiplicidades de infección. Así, determinando el número de placas de lisis producidas al infectar con distintas diluciones de la suspensión de virus, podremos calcular el número de unidades infectivas presentes en la muestra original.
Como medios para el cultivo e infección se puede utilizar directamente caldo y agar común a los que se añade siempre Cl2Mg a una concentración final de 10mM, al objeto de evitar la disgregación de los componentes de la cápsida del virus. También se utilizará agar blando, que se obtiene añadiendo 0.6% (p/v) de agar al caldo común (con el Cl2Mg presente), y que tiene como función el permitir una difusión limitada de la progenie vírica tras la lisis de la bacteria. Para el ensayo de transducción emplearemos placas de agar de McConkey con el antibiótico kanamicina
Procedimiento:
1) Se prepara un inóculo de la cepa de E. coli a infectar (ojo! NO es la misma que se emplea en la colección) en un medio que contiene 10 mM de Cl2Mg y maltosa al 0.2%, y se deja incubando a 37ºC y con agitación durante la noche anterior (Esto lo hacen los monitores para todo el grupo).
2) Se funden los matraces con el agar blando (con 10mM de Cl2Mg) y se mantienen en estado líquido en los baños a 50ºC (Los monitores hacen esto).
3) Preparar diluciones decimales (tantas como indiquen los monitores) de la suspensión de virus utilizando el caldo común con el magnesio.
4) Disponer 0.2 ml del cultivo de bacterias ya crecido en cinco tubos estériles, y añadir a cada uno 0.1 ml de tres diluciones consecutivas del virus, siguiendo las indicaciones de los monitores. Homogeneizar suavemente e incubar a 37ºC durante 15 minutos con el fin de permitir la adsorción del virus a la superficie de las bacterias.
5) Añadir también 0,1 ml de la dilución 10-1a otro tubo con 0,1 ml de la bacteria para la práctica de transducción. Incubar en la estufa como en el punto 4. Hacer un control paralelo con igual cantidad de bacterias, pero sin virus.
6) Añadir 3-4 ml del agar blando (a 45-50ºC) sobre los tres tubos más diluídos, homogeneizar y extender sobre placas de agar común procurando que no queden burbujas. Dejar que se solidifique este agar manteniendo las placas sobre la mesa durante 5-10 minutos.
7) Extender directamente los tubos para la transducción sobre placas de selección de McConkey con kanamicina, empleando para ello bolitas de cristal estériles.
8) Incubar a 37ºC en posición invertida durante toda la noche.
9) Al día siguiente contar las placas de lisis que se han formado en las placas con el agar blando. Puesto que cada una de ellas corresponde a un proceso de infección por un virus único, multiplicando por los factores de dilución correspondientes en cada caso se podrá determinar el TITULO del fago, esto es, el número de unidades infectivas por ml.
10) En las placas de Mc con kanamicina observar si aparecen colonias y el color de éstas. La aparición de colonias rojas indicará que el fago se ha integrado en el cromososoma confiréndo a esta bacteria resistencia al antibiótico de selección y capacidad de utilización de lactosa mediante la introducción de genes procedentes de otras bacterias (Transducción).
Crecimiento bacteriano
En esta práctica, realizada en grupos de 4 personas, seguiremos el crecimiento de un cultivo estático de E.coli y observaremos el efecto producido sobre éste por algunos agentes antibacterianos de uso habitual en medicina como la Ampicilina y la Estreptomicina.
Procedimiento:
A partir de un cultivo crecido que os darán los monitores, inocular en condiciones de esterilidad 5 ml de éste en un matraz que contenga 75 ml de caldo común enriquecido con 0.2% (p/v) de glucosa (añadir 0.75 ml de glucosa al 20% en el matraz en condiciones de esterilidad si no lo hicieron previamente los monitores). A continuación, tomar de la mezcla 5 ml con una pipeta estéril, dejarlos en un tubo de ensayo (que no tiene por qué ser estéril), e introducir inmediatamente el matraz en el baño de incubación (hay que procurar que las bacterias no se enfríen a lo largo del proceso de crecimiento), apuntando la hora a la que se tomó esta muestra que será considerada como tiempo 0.
Con los 5 ml de la muestra hay que efectuar medidas de pH y turbidez. El pH se mide para valorar la producción de ácido como consecuencia del metabolismo bacteriano, y es el parámetro que hay que medir en primer lugar. Después se mide la turbidez o densidad óptica en un colorímetro a una longitud de onda de 550 nm. Este valor refleja un parámetro proporcional a la concentración de masa celular (siguiendo la ley de Lambert-Beer) hasta un valor de 0.5, a partir del cual se pierde esta proporcionalidad. Por esta razón, cuando al medir obtengamos un valor superior a 0.5 se procederá a la dilución (1 ml de cultivo + 4 ml de caldo) con medio de cultivo, de forma que el valor que se obtenga, multiplicado por el factor de dilución (5 x), mantenga la proporcionalidad con la concentración de la masa bacteriana.
A partir del tiempo considerado como 0 se seguirán tomando muestras de 5 ml cada 45 ml en las que se medirá el pH y la turbidez para reflejarlo con posterioridad en una gráfica.
Cuando los cultivos alcancen una DO de 0.4-0.5, las parejas C-D de las mesas añadirán las concentraciones de antibióticos que se indican, continuando la incubación y la toma de muestras cada 45 min.
Resultados:
Los resultados de DO de cada uno de los experimentos se irán apuntando en la pizarra para que sean a continuación representados sobre papel semilogarítmico (en éste, la escala logarítmica transforma directamente los valores obtenidos en las posiciones de sus logaritmos correspondientes), de forma que en el cuadernillo final aparezcan una gráfica del cultivo no tratado y otras tres de los tratados con los antibióticos. De estas gráficas se podrá observar: 1) Fases exponencial y entrada en estacionaria (la fase de latencia no se ve en este medio y condiciones, y la de muerte tarda mucho en llegar); 2) Tiempo de generación, calculable a partir de la pendiente de la gráfica en su fase exponencial.; 3) Efectos de los antibióticos, lítico para Ampicilina y no lítico para Estreptomicina.
Aislamiento de bacterias lácticas y producción de yogur
Las bacterias lácticas están implicadas en una gran variedad de procesos de transformación de alimentos. En esta práctica vamos a aislar bacterias de yogur y las vamos a emplear para inocular leche y comprobar su capacidad fermentativa.
Materiales: Cada pareja se encargará de traer un yogur natural como fuente de lactobacilos. Para el aislamiento, emplearemos el medio MRS (Man, Rogosa y Sharpe). Se trata de de un medio natural muy rico que contiene polisorbato, acetato, magnesio y manganeso que actúan como factores de crecimiento para muchos lactobacilos. El crecimiento se efectuará en medios microaerófilos empleando jarras para el cultivo de organismos anaeróbicos y un sistema comercial para la eliminación del oxígeno. Para la producción de yogur se empleará leche estéril (UHT) y tubos de plástico de 5 ml.
Procedimiento:
2) Observar si las colonias crecidas sobre la placa son homogéneas y calcular su número aproximado. Utilizar varias colonias para inocular con el asa de siembra un tubo conteniendo 5 ml de leche estéril (UHT). Mantener el segundo tubo sin inocular. Incubar ambos tubos a 37ºC hasta el día siguiente.
3) Observar el grado de gelificación del tubo inoculado y compararlo con el no inoculado. Abrir el tubo y proceder como en el paso 1 para obtener una suspensión del contenido del yogur. Hacer un frotis y una tinción simple para observar los organismos que han crecido.
Autor:
Maximo Contreras
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