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Figura 2:
Atividade inibitória de 300 mg de 0.53 contra 6,0 UI de a-amilases de pâncreas de porco (PPA),
C. maculatus (CMA), Z. subfasciatus (ZSA), A. obtectus (AOA) e B. amyloliquefasciens (BTA).
Cada UI equivale ao incremeto de 0,1 de absorbância a 530nm.
Para melhor compreender a especificidade da interação entre as a- amilases e os inibidores, estudos das estruturas moleculares vêm sendo realizados por diferentes grupos. Utilizando-se dos dados de cristalografia do complexo aAI-1/PPA (Bompard-Gilles et al., 1996) e da a-amilase de Tenebrio molitor (TMA), através de técnicas de modelagem molecular, foi possível a obtenção de modelos estruturais que simulam a formação dos complexos encontrados na natureza, tais como o inibidor a-AI2 a a-amilase de Z. subfasciatus (aAI2/ZSA) (Figura 3). Estruturas de complexos imaginários, tais como aAI2-PPA e aAI1-ZSA, também foram modeladas para possibilitar análises comparativas quanto às diferenças de especificidade. A conclusão dessas análises apontou alguns aminoácidos que podem ser responsáveis por determinadas especificidades (Da Silva et al., 1999). Nosso grupo tem trabalhado na obtenção e expressão de inibidores mutantes com função inseticida.
Figura 3
Complexo entre a-amilase de Zabrotes subfasciatus (ZSA) e inibidor 2 (AI-2).
Os círculos preenchidos (cor azul e cor verde) representam os resíduos envolvidos na interação entre ambas as moléculas.
Os círculos cor-de-rosa representam as moléculas de água envolvidas na interface da interação.
As proteinases são denominadas endopeptidases quando hidrolizam ligações peptídicas internas, e exopeptidases quando hidrolizam ligações N-terminais ou C-terminais. As endopeptidases são também conhecidas como proteinases. As proteinases são classificadas, de acordo com a União Internacional de Bioquímica, em quatro grandes classes: proteinases serínicas; cisteínicas; aspárticas e metalo- proteinases. O sistema de classificação baseou-se numa comparação entre sítios ativos, mecanismos de ação e estrutura tridimensional das proteinases (Neurath, 1996). Os insetos obtêm muitos dos aminoácidos essenciais utilizando proteinases extracelulares que atuam no lúmem do intestino deles. As mais bem estudadas são as proteinase serínicas, muito freqüentes em várias classes de insetos e que se assemelham à tripsina e à quimotripsina de mamíferos (Applebaum et al., 1985). As proteinases cisteínicas também são enzimas digestivas importantes para os insetos, como os Coleópteros C. maculatus e A. obtectus (Xavier- Filho et al., 1992).
Muitas famílias de plantas possuem inibidores de proteinases encontradas em seus órgãos reprodutivos, órgãos de reserva e tecidos vegetativos. A maioria desses inibidores são moléculas pequenas, estáveis, abundantes e fáceis de purificar, podendo atuar como proteínas de reserva, como reguladores de enzimas endógenas e podem também estar envolvidos nos processos de defesa de plantas contra o ataque de pragas e/ou patógenos (Walker et al., 1997). O mecanismo pelo qual os inibidores de proteinases interferem no processo digestivo dos insetos se deve à diminuição da assimilação de nutrientes. Quando insetos são submetidos a uma dieta artificial que contenha inibidores específicos para a principal classe de proteinases de seus intestinos, estes têm seu crescimento e desenvolvimento retardados, bem como podem apresentar índices de mortalidade bastante significantes (McManus & Burgess 1995). O número de inibidores de proteinases de plantas identificados e isolados é grande, sendo os inibidores de proteinases serínicas e cisteínicas os que apresentam melhor caracterização. Os inibidores de proteinases serínicas foram encontrados inicialmente em órgãos de reserva de plantas, tais como sementes e tubérculos, mas, posteriormente, foram detectados em folhas e frutos (Xavier-Filho, 1992). A maioria dos inibidores de proteinases serínicas reagem com suas enzimas cognatas através de um mecanismo semelhante ao que ocorre na ligação entre enzima e substrato (Grutter et al., 1990). Esse grupo de inibidores "canônicos" compreendem, geralmente, proteínas pequenas com 29 a 190 resíduos de aminoácidos e todas elas possuem uma alça ligante exposta (Bode & Huber, 1992). A formação do complexo enzima-inibidor ocorre rapidamente, mas a sua dissociação é lenta e resulta na enzima livre e em um inibidor clivado, o qual sofre desnaturação. Os elementos envolvidos nas interações entre as cadeias do inibidor e as da proteinase são pontes de hidrogênio, forças de Van der Waals e pontes dissulfeto, entre outras. A formação do complexo enzima-inibidor envolve ainda a formação de uma ligação peptídica (sítio reativo, P1) no inibidor e a presença de alguns elementos essenciais no sítio ativo da enzima. O mecanismo da catálise é comum para as proteinases em geral e a estrutura foi bastante estudada por meio de técnicas de Difração de Raios-X.
A Figura 4 exemplifica esse mecanismo, usando o modelo estrutural do inibidor de Tripsina e Quimotripsina (PFSI) de sementes de P. vulgaris (Carvalho et al., 1996) complexado com a enzima a-Quimotripsina. O modelo ilustra a orientação do sítio reativo (P1), correspondente ao aminoácido (Fenilalanina) em relação aos demais elementos necessários para a catálise enzimática. Esses elementos são constituídos pela tríade catalítica, a região específica S1 e a fenda oxiânica. A tríade catalítica representa a base para a interação e é formada pelos aminoácidos (Ácido Aspártico, Histidina e Serina). A região específica S1, formada por aminoácidos de enzima que determinam a especificidade e a interação com os demais aminoácidos que estão ao redor de uma fenda oxiânica, que é constituída por resíduos, que podem formar pontes de hidrogênio com o átomo de oxigênio (carregado negativamente) do carbono carbonil (C1) do inibidor. Os inibidores de proteinases cisteínicas, também conhecidos como cistatinas, são um grupo de proteínas que se ligam às proteinases cisteínicas inibindo sua atividade. Em animais, existem três famílias de cistatinas classificadas de acordo com sua massa molecular, número de pontes dissulfeto, localização sub- celular e estrutura primária. São elas: família das cistatinas I, cistatinas II e kininogenios (Ryan et al., 1998). Em plantas as cistatinas de arroz (oryzacistatinas) são as mais bem caracterizadas. As cistatinas de plantas podem ser classificadas dentro da família de fitocistatinas (Abe et al., 1987). Muitas fitocistatinas têm suas seqüências de aminoácidos conhecidas e em todas essas seqüências encontra-se uma região altamente conservada no sítio de ligação (Gln, Val, Val, Ala e Gly). Assim como os inibidores de proteinases serínicas, as cistatinas se ligam reversivelmente às proteinases. Por meio de estudos de cristalografia, foi determinado que as cistatinas são formadas por uma longa a-hélice central envolvida por cinco folhas -antiparalelas. Na extremidade das folhas , uma alça em forma de grampo, formada pela seqüência altamente conservada em todas as cistatinas (QVVAG) é exposta. Essa seqüência corresponde ao sítio de ligação da cistatina à proteinase (papaína). Em regiões paralelas a esta alça, existe outra alça, também em forma de grampo, e uma projeção do segmento N-terminal. Várias pontes de hidrogênio são estabelecidas e a ligação é canônica, ou seja, ocorre de maneira similar à ligação do substrato à proteinase. Entretanto, como a cistatina não se liga diretamente a resíduos do sítio catalítico da proteinase, e a mesma não sofre a clivagem que o substrato natural da enzima sofreria (Bode e Huber, 1992).
Figura 4
Inibidores de proteinase serínica (PFSI) var. "Fogo na Serra" extraído de P. vulgaris, mostrando elementos essenciais para catálise. Os círculos pontilhados referem-se a representação das forças de Van der Waals. Carvalho et al. (1996).
4. Plantas Transformadas com Genes de Inibidores de a-Amilase e Proteinase.
A transferência de genes pode ser considerado um passo crucial no desenvolvimento de plantas resistentes a insetos. Nesse sentido, os inibidores de a-amilase e de proteinase apresentam grande potencial por reduzirem ou impedirem a atividade das enzimas digestivas dos insetos, causando-lhes desnutrição e redução do desenvolvimento larval. Dependendo dos níveis de expressão, os inibidores podem causar a morte das larvas dos insetos. A proteção eficiente contra insetos em plantas transformadas demanda que os inibidores sejam acumulados em células vegetais em um nível maior do que em plantas não transformadas (Augustyniak et al., 1997). A introdução de genes que codificam inibidores de a-amilase em culturas economicamente importantes tem sido utilizada para aumentar a resistência destas culturas a diferentes insetos (Tabela 1).
Ervilhas transformadas com o gene que codifica o a-AI1 se apresentaram completamente resistentes ao besouro da ervilha Bruchus pisorum, um bruquídeo-praga que se alimenta das ervilhas que estão em crescimento no campo (Shade et al., 1994). De posse desses resultados, Ishimoto et al. (1996), utilizando esse mesmo gene, obteve feijões azuki resistentes contra C. chinensis (Tabela 1).
Em 1987, Hilder e colaboradores obtiveram a primeira planta transgênica que expressava um gene de inibidor de proteinase. Eles construíram plantas de tabaco contendo o gene que codifica para o inibidor de proteinase serínica de feijão-de-corda (Vigna unguiculata). Essas plantas que são susceptíveis ao inseto Heliothis virescens adquiriram altos níveis de resistência ao mesmo, e em estudos subsequentes, plantas resistentes foram obtidas contra os insetos Lacanobia oleracea e Otiorhynchus sulcatu. (Gatehouse e Gatehouse, 1998). Desde estão, muitas outras plantas de interesse comercial foram transformadas com genes de inibidores de proteinases. Algumas delas estão apresentadas na Tabela 2.
Em 1995, Puztai e colaboradores mostraram que ratos, alimentando-se de dietas baseadas em sementes de leguminosas cruas, apresentavam uma diminuição na digestão de amido, proteínas e lipídeos, devido à presença de fatores anti-nutricionais. Em estudos posteriores ervilhas trangênicas expressando a-AI1 foram utilizadas em análises de digestão em ratos, e a redução na digestão e na absorção dos nutrientes causada por estas ervilhas não foi significativa (Puztai et al., 1999). A utilização de genes que codificam inibidores de enzimas digestivas para a obtenção de plantas resistentes contra o ataque de insetos é uma estratégia bastante promissora. Entretanto, estes inibidores devem ser selecionados levando-se em consideração a fisiologia e a bioquímica de sua digestão pelo inseto. É importante também fazer uso de combinações desses inibidores com outras proteínas que induzem estresse ou inibem o crescimento dos insetos a serem controlados. Apesar da polêmica, as leguminosas transgênicas são seguras para a alimentação desde que as sementes sejam cozidas ou processadas antes do consumo por seres humanos. Uma vez desnaturados, estes inibidores não funcionam como anti-nutrientes, mas sim como fonte de aminoácidos após a digestão, assim como as proteínas de armazenamento.
Octávio Luiz Franco (1, 2, 3) Francislete Rodrigues Melo (1, 2) Maria Cristina Mattar da Silva (1, 2) Maria Fátima Grossi de Sá (1)
ocfranco[arroba]pos.ucb.br
1.Cenargen/Embrapa
2. Universidade de Brasília, Depto. de Biologia Celular, Brasília, DF, Brasil.
3. Universidade Católica de Brasília, Brasília, DF, Brasil fatimasa[arroba]cenargen.embrapa.br ocfranco[arroba]pos.ucb.br
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