Caracterização imunoquímica da ACC (ácido 1-carboxílico-1-aminociclopropano) oxidase em frutos clima (página 2)

A combinação de técnicas de Biologia Molecular, de Bioquímica, de cultura in vitro e de fisiologia pós-colheita permitiu a obtenção de plantas transgênicas, produtoras de frutos com baixa produção de etileno e maturação retardada. Este material, praticamente desprovido de atividade ACC oxidase, tem servido de modelo vegetal para o estudo dos efeitos específicos do etileno sobre as principais alterações detectadas durante o amadurecimento de frutos: bioconversão de açúcares, síntese de pigmentos, metabolismo de ácidos orgânicos, degradação da parede celular, insuficiências do sistema endomembranário, formação de zona de abscisão, dentre outras (01, 13, 14, 16).

Os estudos da fisiologia de pós-colheita de frutos climatéricos carece, no entanto, de metodologias com boa sensibilidade e rapidez para a detecção direta da enzima ACC oxidase, já que a medida de sua atividade exige, para cada espécie, a calibração das condições de extração e dosagem. A produção de etileno, nem sempre está correlacionada com os níveis de ACC oxidase.

Dentro deste contexto, o presente trabalho objetiva estudar a expressão da ACC oxidase em frutos climatéricos por via imunoquímica. Será apresentado o sistema de preparo do antígeno, a caracterização dos anticorpos anti-ACC oxidase e sua utilidade na detecção de uma das enzimas chaves da via de biossíntese do etileno.

Para a produção da proteína recombinante, uma colônia de Escherichia coli k₃₈pGP_1-2, contendo o plasmídeo pT7-7A4 (cepa transformada), foi inoculada em meio LB líquido contendo os antibióticos de seleção e mantida em agitação a 200 rpm, a 30°C, até que a suspensão atingisse uma DO₆₀₀ em torno de 0,4. Em seguida, a suspensão foi aquecida a 42°C durante 30 minutos; resfriada para 37°C, e, após, foi mantida sob agitação durante 2 horas. Estas três etapas correspondem, respectivamente, à multiplicação celular, à indução do gene da T7-polimerase presente no vetor de expressão e à tradução da proteína recombinante ACC oxidase propriamente dita (18). Como controle do processo, utilizou-se uma suspensão celular de Escherichia coli k₃₈pGP_1-2 não transformada com o plasmídeo pT7-7A4.

A separação da biomassa da suspensão celular foi efetuada por centrifugação a 5000g a 4°C, durante l0 minutos. Para a extração das proteínas, o material foi, na ordem, incubado em uma solução aquosa de lisozima a 1% (m/v) durante 10 minutos; com DNAse I a 10 µg/ml^-1 durante 1 hora, e, finalmente, suplementado com 2 volumes de uma solução aquosa de uréia a 3,0M. O material não dissolvido foi separado por centrifugação a 15000g durante 20 minutos a 4°C e em seguida, dissolvido em tampão LAEMMLI (11) para migração eletroforética.

A separação eletroforética das proteínas foi realizada em condições desnaturantes, do tipo SDS-PAGE ("Sodium Dodecylsulfate- Polyacrylamide Gel") utilizando um sistema descontínuo de dois géis: um denominado gel de concentração, constituído de Tris-HCl 125 mM com pH 6,8, 0,l% (m/v) de SDS, 4% (m/v) de acrilamida, 0,03% (m/v) de persulfato de amônio e 0,04% de N’,N’,N’- Tetrametil etilenodiamina, e outro, denominado de separação, onde a concentração de acrilamida foi aumentada para 12% (m/v), o tampão utilizado foi Tris-HCl 375 mM com pH 8,9. A migração foi realizada a 150V durante 90 minutos num tampão contendo 25 mM de Tris, 192 mM de glicina e 0,1% (m/v) de SDS. A coloração do gel foi efetuada a 40^oC, numa solução contendo 0,5% (m/v) de azul de Comassie R-250, 15% (m/v) de ácido tricloroacético e 20% (v/v) de metanol. Para a descoloração, utilizou-se uma solução contendo 10% (v/v) de ácido acético, 15% (v/v) de metanol e 10% (m/v) de glicerol.

O peso molecular dos diferentes polipeptídeos foi determinado a partir de uma curva padrão preparada com as proteínas fosforilase B (97,4 kDa), albumina do soro bovino (66,2 kDa), ovoalbumina (43,0 kDa), anidrase carbônica (31,5 kDa), inibidor de tripsina (21,5 kDa) e lisozima (14,0 kDa). A dosagem de proteínas foi realizada de acordo com método descrito por BRADFORD (04).

A proteína ACC oxidase foi isolada por eletroeluição da respectiva banda protéica removida do gel de eletroforese preparativa, corado com uma solução de CuCl₂ a 0,5% (m/v). Os resíduos de CuCl₂ foram eliminados dos fragmentos de gel através de lavagens sucessivas em soluções de EDTA a 0,3M. O isolamento da proteína foi efetuado utilizando um eletroeluidor Bio Rad II, à temperatura ambiente durante 5 horas, num tampão contendo 25 mM de Tris, 192 mM de glicina e 0,1% (m/v) de SDS. As proteínas do eluato, precipitadas com acetona a –20°C, foram utilizadas para a imunização de coelhos New Zeland, visando a produção de anticorpos policlonais, segundo metodologia descrita por HARLOW & LANE (09). A especificidade do soro obtido foi testada, pela técnica de "Western blot", em extratos protéicos de frutos climatéricos.

Foram utilizados frutos de maçã (Malus domestica Borck), cv. Jonagold, em três estágios de maturação: pré-climatérico, climatérico e pós-climatérico, e tomates (Lycopersicum esculentum L), cv. Kadá, nos estágios verde-maduro (pré-climatérico), "breaker" (climatérico) e maduro/senescente (pós-climatérico). Também analisaram-se tomates deste mesmo cultivar transformados geneticamente com um clone "antisense" da ACC oxidase, doravante denominados transgênicos (16). A evolução da maturação foi acompanhada pela evolução da coloração e pelas medidas da produção de etileno e da atividade ACC oxidase in vivo. Para as duas primeiras determinações utilizou-se o protocolo descrito por ROMBALDI et al. (16). A atividade ACC oxidase in vivo foi determinada a partir da incubação, durante 2 horas, de 1g de material vegetal em frascos de 10 ml, em 3 ml de tampão Tris-HCl 0,1M, pH 7,2, 10 µM de cicloheximida, 200 µM de ACC e 10% (m/v) de glicerol. Passado este período, os frascos foram fechados durante 30 minutos e a dosagem do etileno produzido foi efetuada por cromatografia em fase gasosa (07). A atividade ACC oxidase in vivo e a produção de etileno foram expressos em nl de etileno.h^-1.g^-1 de material vegetal.

O "Western blot" foi conduzido segundo metodologia descrita por DUPILLE et al. (07), compreendendo as etapas de extração, separação eletroforética e eletrotransferência das proteínas e imunodetecção com o uso dos anticorpos policlonais. Todas as condições utilizadas foram idênticas àquelas descritas por estes autores (07), excetuando-se a concentração de anticorpo anti-ACC oxidase que foi reduzida de 1:2000 (anticorpo:tampão, v/v) para 1:10000 (anticorpo:tampão, v/v).

A Tabela 1 apresenta a produção de etileno e a atividade ACC oxidase em frutos de maçã, cv. Jonagold, e de tomate não transformados e transgênicos, cv. Kadá, durante a maturação. Em todos eles observou-se um comportamento típico de frutos climatéricos, havendo um importante incremento na produção do fitoregulador etileno (250 vezes para maçã e 70 vezes para tomate) quando os frutos passaram do estágio pré-climatérico para o climatérico, e um decréscimo na fase final, pós-climatérica, quando os frutos já apresentavam sinais evidentes de senescência. Por sua vez, frutos de tomate provenientes de plantas transformadas com um clone "antisense" de DNA da ACC oxidase apresentaram, mesmo no estágio de maturação climatérico, baixa produção de etileno.

As variações na atividade da ACC oxidase da maçã e do tomate, correlacionaram-se diretamente com a variação da produção de etileno. A suplementação do meio de incubação com 200 µM de ACC, substrato da ACC oxidase, permitiu atingir aumentos superiores a 100 nl.h^-1.g^-1 e a 10 nl.h^-1.g^-1, respectivamente, para maçã e tomate, ambos na fase climatérica. Este comportamento indica que a atividade ACC sintetase é insuficiente para atender à ACC oxidase destes frutos, especialmente na fase climatérica. No entanto, em frutos de tomate transgênicos, nenhum aumento de atividade enzimática foi detectado, indicando ser a ACC oxidase a enzima limitante neste caso.

A especificidade dos anticorpos anti-ACC oxidase foi testada utilizando-se a técnica de "Western blot"(09, 17). Assim, quando os anticorpos reagiram com extratos protéicos de frutos pré-climatéricos, produtores de baixas quantidades de etileno (inferior a 1,0 nl.h^-1.g^-1), nenhuma reação foi observada (Figura 2A1 e 2B1). À medida que o processo de maturação evolui, induzido pelo aumento da produção de etileno, uma proteína de aproximadamente 37 kDa foi fortemente reconhecida pelos anticorpos anti-ACC oxidase (Figura 2A2, A3, B2 e B3). Esta proteína continuou presente em extratos protéicos de frutos em fase pós-climatérica, onde já houve um importante decréscimo na produção de etileno. Outros trabalhos (05, 07, 10, 14, 20) também verificaram que a proteína ACC oxidase mantém-se presente em frutas maduras/senescentes, apesar da produção de etileno ser praticamente nula. Estes autores sugeriram que uma deficiência de substrato e/ou uma desintegração da membrana seria a causa deste comportamento. Entretanto, VERVERIDES & JOHN (19), demonstraram que esta enzima pode ter sua atividade preservada in vitro, num sistema acelular, e que, quando extraída de materiais em fases avançadas de maturação/senescência, tem sua atividade reduzida a níveis muito baixos, não podendo ser restaurada, mesmo em presença do substrato e dos cofatores.

Quando os anticorpos policlonais anti-ACC oxidase reagiram com um extrato protéico de tomate transgênico, transformado com um clone "antisense" da ACC oxidase, nenhuma proteína foi reconhecida (Figura 2C1). A ausência de reação cruzada com outras proteínas, indica que os anticorpos utilizados são específicos para a ACC oxidase. Acrescenta-se ainda, o fato de que, quando substituiu-se os anticorpos policlonais anti-ACC oxidase por um soro proveniente dos animais pré-imunes, nenhuma reação positiva foi detectada (Figura 2C2).

Os resultados obtidos permitem concluir que:

(1) AYUB, R.; GUIS, M.; BEN AMOR, M.; GILLOT, L.; ROUSTAN, J.P.; LATCHÉ, A.; BOUZAYEN, M.; & PECH, J-C. Expression of an antisense gene encoding ACC oxidase in Cantaloupe melons and its consequences on fruit ripening on and off de vine. Nature Biotechnology. In press.

(2) BALAGUÉ, C.; WATSON, C.F.; TURNER, A.J.; ROUGE, P; PICTON, S.; PECH, J-C. & GRIERSON, D. Isolation of a ripening and wound-induced cDNA from Cucumis melo L. encoding a protein with homology to the ethylene-forming enzime. Eur. J. Biochem., 212:27-34, 1993.

(3) BARRY, C.S.; BLUME, B.; BOUZAYEN, M.; COOPER, W.; HAMILTON, A.J. & GRIERSON, D. Diferential expression of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase gene family of tomato. Plant J., 9:525-535, 1996.

(5) DONG, D.J.; FERNANDEZ-MACULET, J.C. & YANG, S.F. Purification and characterization of 1-aminocyclopro- pane-1-carboxylate oxidase from apple fruit. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9789-9793. 1992.

(6) DONG, D.J.; OLSON, D.; SILVERSTONE, A. & YANG, S.F. Sequence of a cDNA coding for 1-aminocyclopro- pane-1-carboxylate oxidase homolog from apple fruit. Plant. Physiol. 98:1530-1531, 1992.

(9) HARLOW, E. & LANE, D. Antibodies - A laboratory manual. N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, 1988.

(10) KENDE, H. Ethylene Biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 4:283-307, 1993.

(11) LAEMMLI, K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage T4. Nature, 277:680-685, 1970.

(12) LASSERE, E.; BOUQUIN, T.; HERNANDEZ, J.A.; BULL, J.; PECH, J-C. & BALAGUÉ, C. Structure and expression of three genes encoding ACC oxidase homologs from melon (Cucumis melo L.) Mol. Gen. Genet. 251:81-90. 1996.

(13) LATCHÉ, A.; AYUB, R.; MARTINEZ, G.; GUIS, M.; BEN AMOUR, M.; ROMBALDI, C.; PECH, J.-C. & BOUZAYEN, M. Biosynthèse et mode d’action de l’hormone végétale éthylène. Fruits, 50(5):379-396, 1995.

(14) PECH, J.-C.; LASSERE, E.; AYUB, R.; GUIS, M.; BIDONDE, S.; HERNANDEZ, J.A.; RAMASSAMY, S.; ROMBALDI, C.; BOUZAYEN, M.; BALAGUÉ, C. & LATCHÉ, A. Involvement of ethylene in fruit ripening: expression and control of ACC oxidase gene. In: AUSTRALASIAN POSTHARVEST HORTICULTURE CONFERENCE, Melbourne, 1995. Proceedings... Melbourne, Department of Natural Resources and Environment Institute for Horticultural Development. 1995. p.47-53.

(15) PHARMACIA BIOTECH. Biodirectory ‘97. Uppsala, Sweden. 1997.

(16) ROMBALDI, C.V.; CHAVES, A.L.S.; SILVA, J.A.; LEMOS, M.R.B.; AYUB, R.A.; BALAGUÉ, C. & PECH, J-C. Expressão da enzima ácido 1-carboxílico-1- aminociclopropano oxidase em tomate (Lycopersicon esculentum Mill.), cultivar Kadá. Revista Brasileira de Agrociência, 2(1):5-10, 1996.

(17) SAMBROOK, F.; FRITSC E.F. & MANIATIS, T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2ed. N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, 1989.

(18) TABOR, S. & RICHARDSON, C. A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled expression of specific genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1047-1078, 1985.

(19) VERVERIDIS, P. & JOHN, P. Complete recovery in vitro of ethylene-forming enzyme activity. Phytochemistry, 30:725-727, 1991.

(20) ZAREMBINSKI, T.I. & THEOLOGIS, A. Ethylene biosyntesis and action: a case of conservation. Plant Mol. Biol., 26:1579-1597, 1994.

À Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS) pelo auxílio financeiro, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelas bolsas de estudo concedidas e ao "Laboratoire Éthylène et Maturation de Fruits", Toulouse – França, pelo fornecimento do vetor de expressão.