MATERIAL DE MICROBIOLOGIA ACANGI- 2.008
Microbiología – para llevar información No
todas las bacterias son malas. De hecho, solamente un porcentaje
muy pequeño es perjudicial a los seres humanos.
Microbiología – para llevar información La
prueba bacteriana no es difícil, sino que es consumidora
de tiempo. La mayoría de las pruebas consisten en un
proceso de dos etapas: Paso presuntivo Paso de la
confirmación
CITOLOGÍA Y MORFOLOGÍA DE BACTERIAS Las bacterias,
junto con los protozoarios, algas microscópicas, hongos
microscópicos (incluyendo levaduras) y virus, constituyen
los llamados microorganismos. El término microorganismo no
tiene un significado taxonómico preciso sino que agrupa a
todos los organismos de dimensiones microscópicas (<
0.1 mm) aunque presenten grandes diferencias entre si. Por
ejemplo incluye organismos procariotas (bacterias), eucariotas
(hongos, protozoarios, algas) y virus. También difieren
notablemente en el tamaño aunque sean todos
microscópicos. En una escala comparativa tenemos:
Protozoarios > levaduras > bacterias > virus Aunque
existen miles de especies de bacterias diferentes, los organismos
individuales presentan una de las tres formas generales
siguientes: elipsoidal o esférica cilíndrica o en
forma de bastón espiral o helicoidal.
Observación y examen microscópica La
observación y examen de las bacterias se puede realizar de
dos maneras fundamentales: observando los microorganismos vivos
sin teñir. observando las células fijadas,
teñidas con colorantes Las bacterias vivas en
suspensión acuosa tienen propiedades ópticas
similares a las del agua y, por lo tanto, son difíciles de
observar con el microscopio de campo claro debido a la falta de
contraste con el medio que las rodea. Este contraste aumenta
cuando se las tiñen con un colorante adecuado. Sin
embargo, para muchos fines es preferible evitar la
coloración debido a que puede alterar la forma y
además mata a las células. En los casos en
los que se quieren observar los microorganismos vivos es
conveniente usar un microscopio de campo de contraste de fases o
en su defecto un microscopio de campo claro en iluminación
mínima. Ésta se logra bajando el condensador,
minimizando la iluminación.
Movimiento El movimiento de traslación de algunas
bacterias puede observarse en preparaciones húmedas del
material, es decir con los microorganismos vivos. Debe
distinguirse claramente el movimiento independiente de las
bacterias móviles del movimiento por arrastre con
corrientes de convección y el movimiento browniano. Cuando
el movimiento se realice por propulsión flagelar, el tipo
de movimiento variará con la disposición de los
flagelos en el cuerpo celular. La coloración de las
bacterias tiene como fines: poder visualizarlas para determinar
morfología y tamaño. diferenciar grupos bacterianos
por su reacción frente a determinados colorantes. revelar
la presencia de distintas estructuras internas. Los colorantes
utilizados son sales en las que el anión o el
catión es el responsable del color; en el primer caso se
trata de un colorante ácido o aniónico y en el
segundo, básico o catiónico. La célula
bacteriana tiene una débil carga negativa cuando el medio
externo tiene un pH cercano a la neutralidad. Como la diferencia
de carga eléctrica es lo que determina la afinidad entre
el colorante y la célula, las bacterias tendrán
afinidad por los colorantes básicos (ej.: cristal violeta
y azul de metileno).
coloraciones Cuando se utiliza un solo colorante básico,
el método se denomina coloración simple, mientras
que cuando se usan dos o más se llama coloración
compuesta. La coloración diferencial es un caso particular
de coloración compuesta. Cuando a una preparación
bacteriana se le aplica un colorante ácido tal como
eosina, éste no se une a las células cargadas
negativamente, pero si se deposita alrededor de ellas, quedando
así un fondo coloreado donde contrastan las células
incoloras. No es, por lo tanto, una verdadera tinción y se
denomina tinción negativa o indirecta. En algunas
ocasiones es necesario utilizar un mordiente, es decir, alguna
sustancia que contribuya a la fijación del colorante a la
célula, por ejemplo: ácido tánico, sales de
Al, Fe, etc.
Coloración simple Consiste en la aplicación de un
colorante luego de fijada la preparación. Pueden emplearse
los siguientes colorantes básicos: azul de metileno,
cristal violeta o fucsina fenicada. Estos presentan diferente
afinidad por las bacterias y por ello los tiempos de
aplicación serán distintos.
Preparación de un frotis Comprende las siguientes
etapas: extendido del material en un portaobjetos secado
fijación El propósito de la fijación es
matar los microorganismos, coagular el protoplasma de la
célula y adherir la preparación al portaobjetos.
Sin el proceso previo de fijación se lavaría la
capa de células durante el proceso de tinción. El
agente fijador ideal preserva las estructuras de la célula
con su forma y posición sin que aparezcan estructuras que
no existían en la célula original. El calor es en
general el método de fijación mas utilizado para la
observación de la morfología de células
bacterianas. Cuando además de los microorganismos interesa
la observación de células animales, se utiliza un
método químico como la fijación por metanol
y por formol, que altera menos que el calor la morfología
de las células.
Coloracion de estructuras Esporas Ciertas especies bacterianas,
en particular de los géneros Bacillus y Clostridium,
producen elementos de resistencia denominados esporas o
endoesporas debido a que se forman dentro de la célula, a
razón de una por célula. A diferencia de la
célula vegetativa que la produce, la espora es muy
resistente a condiciones adversas tales como alta temperatura,
baja humedad, radiaciones y agentes químicos. Es una forma
de vida latente que puede permanecer largos períodos como
tal y cuando desaparecen las condiciones adversas puede germinar.
También puede inducirse esa germinación mediante,
por ejemplo, un shock térmico, es decir un calentamiento a
80º C. Las esporas son altamente impermeables a los
colorantes, de manera que con las técnicas de
coloración comunes aparecerán como regiones sin
teñir dentro de las células coloreadas. Por lo
tanto, para teñir las esporas específicamente,
deben usarse métodos de coloración
especiales. Los datos importantes que se obtienen como
resultado de esta coloración son: presencia o ausencia de
esporas deformación o no del cuerpo celular
posición dentro del cuerpo celular En base a la
posición de la espora dentro de la célula se las
clasifica en: terminales, centrales y subterminales
(posición intermedia).
Manipulación aséptica de cultivos Tomar el tubo del
cultivo con la mano izquierda, de modo que el fondo del tubo
toque la palma de la mano y probar (con la mano derecha) que el
tapón esté libre, girándolo sin destapar.
Tomar el ansa con la mano derecha, con los dedos pulgar,
índice y mayor, dejando libres el anular y el
meñique. Quemar el ansa introduciendo la punta en el cono
frío de la llama del mechero, en posición vertical
y luego ir levantándola hasta que quede toda al rojo.
Pasar el ansa por la llama en un ángulo de 60º con la
vertical, manteniéndola siempre en posición
paralela al cuerpo. Flamear el metal adyacente al ansa.
Trabajando cerca del mechero, tomar el tapón de
algodón del tubo con los dedos anular y meñique de
la mano derecha y quitarlo girando el tubo; flamear la boca del
tubo.Introducir el ansa tocando la pared fría dentro del
tubo (sin soltar el tapón de algodón) para que se
enfríe el ansa y luego introducirla en el cultivo
líquido o deslizarla sobre la superficie del cultivo
sólido de abajo hacia arriba, para tomar las
células a transferir (inóculo). Sacar el ansa
así cargada del tubo, flamear la boca del tubo y taparlo.
Transferir el inóculo, ya sea a un portaobjetos para hacer
un frotis o a otro medio de cultivo. Quemar nuevamente el ansa.
Siempre que se vaya a tomar una muestra de un cultivo con
cualquier finalidad debe procederse según técnica
aséptica descrita, con el fin de no introducir
contaminación en el cultivo y en la muestra.
Observación de un preparado fresco (para observar
movilidad, forma, etc.) Método de la gota pendiente
Colocar una gota de muestra usando técnica aséptica
en el centro de un cubreobjetos limpio. Invertirlo cuidadosamente
y colocarlo sobre la depresión de una lámina
excavada, de manera que no deslice la gota por el cubreobjeto. La
gota no debe tocar el fondo de la depresión. Aplicar unas
gotas de agua a los bordes del cubre para sellarlo y mantenerlo
en su lugar. Observar con el lente seco de mayor aumento.
Método de lámina-laminilla Colocar una gota de la
muestra usando técnica aséptica sobre un
portaobjetos limpio y cubrir con un cubreobjetos. Para prevenir
las corrientes de convección y el secado de la
preparación, se puede sellar poniendo en los bordes del
cubreobjetos vaselina sólida o esmalte de uñas.
Observar igual que el anterior. En caso de disponer de
microscopio de contraste de fases la visión es mucho
mejor
Las bacterias esféricas o elipsoidales se denominan COCOS.
Muchas bacterias con esta forma presentan modelos de
agrupación que derivan de los diversos planos de
división celular. Así tenemos: cocos en pares
(diplococos), ej. Neisseria cocos en cadena, ej. Streptococcus
cocos en racimo, ej. Staphylococcus cocos en tétradas, ej.
Pediococcus cocos en cubos, ej. Sarcina cocos sin
distribución especial Las células bacterianas
cilíndricas se denominan BACILOS o BASTONES y presentan
otros modelos de agrupación. Así tenemos: bastones
en cadena, ej. Bacillus bastones en letras chinas o empalizadas,
ej. Corynebacterium bastones sin distribución especial Las
bacterias helicoidales se presentan en general como
células individuales independientes; pero las
células de las distintas especies presentan notables
diferencias de longitud, número y amplitud de las espiras
y rigidez de la pared.
Microbiología – para llevar información La
técnica óptima para recuperar depende de la fuente
de la muestra y del cargamento bacteriano. Los números
tienen solamente importancia basada en su uso. Los números
exactos no indican necesariamente una buena o mala
situación.
microscopio
El Microscopio UTILIZACIÓN DEL MICROSCOPIO Colocar una
preparación . Abrir el diafragma de la fuente de luz al
máximo. Abrir el diafragma del condensador al
máximo y llevar el condensador al máximo de su
trayectoria. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x.
Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad
confortable. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar
y ajustar el foco de cada ocular si el microscopio lo permite.
Enfocar la preparación. Gradualmente cerrar el diafragma
de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal. Bajar el
condensador hasta que los bordes del polígono se vean
nítidos. Ajustar el enfoque. Si la imagen poligonal no
está en el centro, centrarla utilizando los tornillos del
condensador. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la
poligonal apenas salga del campo, no tocarlo mas. No tocar mas la
altura del condensador. Elegir el contraste óptimo
ajustando el diafragma del condensador. Verificar la
iluminación quitando los oculares y mirando por el tubo
hacia los objetivos ajustar el diafragma a 2/3 abierto. (2/3 del
campo iluminado). Para cambiar el contraste regular el diafragma
del condensador y para ajustar el brillo modificar la intensidad
de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia
del condensador. Al cambiar de objetivo solo modificar el
diafragma de la fuente de luz y el diafragma del condensador a la
apertura del objetivo.
Tipos de microscopios
Mantenimiento del microscopio DIARIO (cada vez que se usa)
Limpiar el aceite de inmersión de lentes y otras
superficies del microscopio. El aceite de inmersión debe
conservarse cerrado. Apagar la fuente de luz del microscopio
Cubrir el microscopio con su funda.
Fundamentos de Microbiología ¿Con que seguridad se
determina? Identificación de organismos Microscopia Prueba
de los medios de cultivo
Microbiología Descripción de los Productos Paddles
Membrana de Filtración (MF) Heterotrófico conteo
placa (HPC)
Microbiología Tipos de microorganismos importantes :
Bacteria Levaduras y mohos Virus Protozoario Simples- Celulas
Algas
Microbiología La presencia de ORGANISMOS en una muestra e
indica la contaminación posible con bacterias, levaduras
peligrosas Relativamente fácil detectar, identificar, y
enumerar
Catalasa Introducción La catalasa es una enzima que
descompone el peróxido de hidrógeno en
oxígeno y agua. La catalasa es una hemoproteína de
estructura similar a la de la hemoglobina, excepto que los 4
átomos de hierro de la molécula están en
estado oxidado (Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo
los estreptococos, la mayoría de las bacterias aerobias y
anaerobias facultativas poseen actividad catalasa. Principio El
peróxido de hidrógeno se forma como uno de los
productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de
los carbohidratos. Si se deja acumular, el peróxido de
hidrógeno es letal para las células bacterianas. La
catalasa transforma el peróxido de hidrógeno en
agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente reacción:
H2O2 ? H2O + ½O2 (burbujas de gas) La prueba
de la catalasa, llevada a cabo en portaobjetos o en tubos, es
comúnmente utilizada para diferenciar Streptococcus
(catalasa negativa) de Staphylococcus (catalasa positiva). Medios
y reactivos 1. Cultivo de 24 horas del microorganismo en un medio
no selectivo . 2. Peróxido de hidrógeno al 3%
(diluir la solución de 30% con agua
destilada).
catalasa Procedimiento Transferir una ansada de células
del centro de una colonia bien aislada a la superficie de un
portaobjetos en el que se coloco una pequeña gota de
peróxido de hidrógeno al 3%. Emulsionar
bien. Se recomienda probar previamente las ansas que
contengan hierro, ya que se pueden producir falsos
positivos. Interpretación La rápida
aparición y producción sostenida de burbujas de gas
o efervescencia, indica una prueba positiva. Dado que algunas
bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces
de descomponer el peróxido de hidrógeno, unas pocas
burbujas diminutas, formadas a los 20 a 30 segundos no se
consideran una prueba positiva. Controles
SEGURIDAD 1. Este método entraña el uso de diversas
sustancias biológicas peligrosas y procedimientos que
pueden ocasionar un aumento del riesgo para quien los aplica. En
caso de duda, consultar siempre con el asesor de seguridad
competente. 1.1. Precauciones generales 1.1.1.Se llevara en
todo momento ropas protectoras, incluido guardapolvo abotonado,
gafas y guantes de seguridad, BARBIJO 1.1.2. Los analistas se
conocerán cualesquiera de los riesgos atribuibles a las
sustancias que usan 1.1.3. Se deberán mantener cerca la
hoja de seguridad de los productos utilizados para este uso.
1.1.4. La exclusión de otros compuestos de esta lista no
implica que sean seguros. 1.2. Primeros auxilios. Toda
herida debe notificarse, todos los accidentes e incidencias se
notificaran
Materiales 1.3. introducción Se basa sobre la
propiedad de un agregado un medio de cultivo para desarrollar el
organismo que estamos investigando (levaduras y mohos, bacterias
o recuento total). 1.4. Muestreo. Las muestras serán
enviadas al laboratorio con todos los cuidados
microbiológicos de extracción y en envases
estériles, provisto por nosotros. 1.5. APARATOS
Pizeta con agua destilada Alcohol de 80º Algodón
estéril medio de cultivo especifico 6.5.1 Equipos Monitor
de 100 ml estéril. VER FIGURA Estufa de cultivo.
Cámara de flujo laminar Microscopio
Proceder 1.6. REACTIVOS 1.7. PROCEDIMIENTO
· En un monitor
de 100 ml colocar la muestra extraída del envase
estéril.
· Realizar el
vacío para filtrar la muestra.
· Agregar el
medio de cultivo por la parte trasera del monitor (2 ml) con
jeringa o por medio de la ampolla cuando es plástica
· Colocar la
tapa en la parte inferior y llevar invertido a la estufa (la tapa
superior debe esta hacia abajo).
· Llevar a
estufa de cultivo por 72 h. a 32º C.
· Retirar la
muestra de estufa y observar las colonias desarrolladas de color
blanco amarillenta.
· Si tenemos
duda de lo formado llevar al microscopio.
· Hacer un
raspado y colocar sobre porta objeto junto a una gota de agua
estéril, cubrir con un cubreobjeto y agregar aceite de
inmersión. Ver en el microscopio con 100 x 10 por
inmersión
Brettanomyces INCUBACION 6 días a 25º C. Es
conveniente que la caja sea recubierta por film estéril
para evitar que la evaporación del caldo perjudique el
análisis. Las colonias son pequeñas,
cremosas, casi siempre semiesféricas , puede aparecer un
halo blanco alrededor de las mismas producto de la acidez.
Retirar la muestra de estufa y observar la colonias desarrolladas
de color crema. Si tenemos duda de lo formado, llevar al
microscopio un raspado sobre cubreobjeto, colocar un porta y
aceite de inmersión
Fotos de brettanomyces
MONITOR
Membrana Filtración (MF) Colector de muestra Monitor
instrucciones Tener el monitor con la parte inferior y abrir el
corte conforme a la foto
PROCEDER CON MONITORES Conecte el matraz kitasato de
filtración de la trampa con la tubería para
vacío, ambos matraces pueden ser conectado con un
tapón de neopreno 8 con unión de 3/8 “.
Conecte el matraz de trampa a la bomba de vacío con
tubería de silicón tomando una unidad de
filtración intermedia para proteger la bomba. Conecte la
bomba , conecte la bomba a un contacto ajustándolo.
Coloque un adaptador al tapón que se encuentra en el
matraz de filtración. Retire el monitor de la caja,
colóquelo sobre el adaptador ajustándolo. Retire la
tapa del embudo ( no toque las superficies interna) y vierta la
muestra en el monitor. Encienda la bomba de vacío y filtre
la muestra. Si el volumen de la muestra es mayor al del embudo,
vierta el resto de ella antes que se filtre el tota de la primera
porción y filtre completamente. Apague la bomba y
enjuagué las paredes del embudo con 20 a 30 ml de buffer
estéril ph 7,2. Permita que el buffer se acumule sobre la
membrana. Encienda la bomba totalmente la solución de
enjuague, asegurase que en la superficie de la membrana no
permanezca ningún exceso de liquido Apague la bomba
Filter flask Vacuum trap Vacuum pump
Fit port into adapter
Trabajo con Monitor
Trabajo con monitor 1 Instalación del sistema de
filtración con monitor monitor
Trabajo con monitor 2
TRABAJO CON MONITOR 3
ESTA PRESENTACIÓN CONTIENE MAS DIAPOSITIVAS DISPONIBLES EN
LA VERSIÓN DE DESCARGA