- Presentación
- Recomendaciones generales
- Reconocimiento de materiales y equipos de
laboratorio - Manejo
del microscopio y el mundo microbiano - Coloraciones bacterianas: coloración de
Gram - Coloración ácido-alcohol
resistente - Medios
de cultivo - Estudio de hongos
- Aislamiento de bacterias patógenas de
heridas y secreciones - Aislamiento de patógenos en
infección urinaria - Control de los microorganismos: el
antibiograma - Estudio serológico: antígenos
febriles - El
shock anafiláctico - Estudio
parasitológico - Estudio parasitológico: protozoarios
intestinales - Estudio parasitológico: protozoarios
hemáticos, tisulares y urogenitales - Estudio parasitológico: los
trematodos - Estudio parasitológico: los
cestodos - Estudio parasitológico: los
nematodos - Bibliografía
Presentación
El Manual de Microbiología –
Parasitología, se elaboró con la finalidad de
proporcionar un material ordenado y de fácil acceso al
trabajo académico, el cual se complementa con la actividad
científica en el laboratorio.
Actualmente, toda carrera profesional que esté
relacionada con el campo de la salud humana, debe contar con un
Manual de Prácticas de Microbiología, tal como los
estudiantes de Biología, Enfermería, Farmacia y
Bioquímica, Odontología, etc. Es por esta
razón que me di a la tarea de elaborar un manual que
satisfaga las necesidades del estudiantado, quienes deben
complementar el aspecto teórico, llevado en el aula, con
la actividad científica desarrollada en el laboratorio de
tal forma que se facilite el trabajo ordenado y uniforme en todos
los niveles de pre grado.
El Manual consta de dieciocho prácticas y fue
elaborado tomando en cuenta las referencias bibliográficas
que se mencionan en los diferentes currículos
académicos de la Universidad Nacional de "San Luís
Gonzaga" de Ica, para la asignatura de
Microbiología.
La elaboración del Manual se realizó en
varias etapas mediante la recopilación de
prácticas. Cada práctica inicia con el
título en la parte central el cual se seleccionó de
acuerdo a la dosificación del programa por semana. El
objetivo hace referencia al aspecto significativo que se pretende
que los alumnos logren al final del experimento. La
introducción es la parte teórica de cada una de las
prácticas, fue tomada de diversas referencias
bibliográficas. En la parte experimental el procedimiento
se tomó de diversos manuales de otras Universidades y de
la misma Universidad de Ica. El cuestionario en el que el alumno
demuestra su aprovechamiento logrado al final de la secuencia de
aprendizaje se elaboró basado en el aspecto introductorio
y resultados experimentales que se esperan de cada
práctica. Así mismo, se complementa con
observaciones que el alumno realizará mediante dibujos o
esquemas y finalizará con conclusiones personales del
mismo.Los autores
Recomendaciones
generales
1. La hora de entrada al laboratorio tendrá 10
minutos de tolerancia, después de este tiempo, no se te
permitirá el acceso a dicho ambiente.
2. Al entrar al laboratorio, deberás ponerte la
bata y abotonarla completamente, sólo podrás
quitártela al salir de éste.
3. Las mesas deberán estar siempre limpias y
desocupadas, tu mochila debe ser colocada en el lugar indicado
por el profesor.
4. Terminantemente prohibido comer ni fumar en el
laboratorio, no debes introducirte ningún objeto a la
boca.
5. Para las señoritas, recógete el pelo
para efectuar el trabajo de laboratorio.
6. Limpia y desinfecta el área de trabajo antes y
después de usarlo.
7. No pasees entre las mesas del laboratorio, el trabajo
debes efectuarlo sentado y en tu equipo de trabajo.
8. Días antes de iniciar la práctica lee
cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiendes
pregunta al profesor.
9. Si hay necesidad de llevar material biológico
para la realización de la práctica, es necesario
que lo consigas, de lo contrario la práctica se
suspenderá para todo el equipo.
10. Informa al profesor de cualquier accidente que
ocurra.
11. En caso de derramar material que contenga
microorganismos, cúbrelo con fenol y deja actuar diez
minutos. Avisa al profesor.
12. Todo el material que vas a incubar o desechar, debes
colocarlo en el sitio indicado por el profesor.
13. Etiqueta todo el material que vas a incubar con los
siguientes datos: equipo, grupo, fecha y nombre del
material
14. Después de la incubación es necesario
la esterilización del material para eliminar
microorganismos que pudieran hacernos daño a nuestra
salud.
15. Lávate las manos con agua y jabón
antes de salir del laboratorio.
16. Es obligación de cada equipo entregar todo el
material limpio.
PRACTICA N°
01
Reconocimiento de
materiales y equipos de laboratorio
OBJETIVO
Cada estudiante del curso de Microbiología debe
identificar y reconocer los materiales de laboratorio.
MATERIALES:
1. TUBOS DE ENSAYO: Son de vidrio, es empleado
para conservar microorganismos en medios de cultivo
líquido o sólido. Hay de diferentes formas y
capacidades, con borde o sin borde pero, lo que más
importa es su calidad termo resistente, es decir, su resistencia
al calentamiento y a los cambios bruscos de
temperatura.
2. PLACAS PETRI: Son materiales de vidrio que se
utiliza para aislar microorganismos provenientes de diversas
fuentes infecciosas.
3. PIPETAS: Son materiales de vidrio destinados a
medir volúmenes pequeños de medios de cultivo
líquidos u otras sustancias. Hay graduadas de 0.1 ml hasta
10 ml.
Pipetas graduadas con jeringa herméticamente
esmerilada
4. MATRAZ DE ERLENMEYER: Son recipientes de
vidrio en forma cónica que disponen una escala graduada y
permiten estimar o aproximar volúmenes de líquidos.
Se emplea para disolver medios de cultivos y conservarlos; los
hay de varias capacidades de 25 ml hasta 5 litros.
5. BALONES: Son recipientes de vidrio de fondo
plano (matraz Florencia), que sirve mayormente como contenedor,
tiene similar función que el matraz de
Erlenmeyer
6. MATRAZ DE KITASATO: Son recipientes de vidrio,
de forma cónica, similar al Erlenmeyer, con la diferencia
que en la parte del cuello posee un orificio lateral de salida.
Se emplea para realizar filtraciones al vacío.
7. PROBETAS: Son recipientes cilíndricos
graduados de vidrio grueso, con pico y con base para poderlos
parar. Se emplean para medir volúmenes de líquidos.
Hay de diferentes volúmenes, de 5 ml a 2 litros
8. BAGUETA: Llamadas también agitadores.
Son varillas sólidas de vidrio. El largo del agitador
está determinado por el tamaño y la forma del
recipiente en que se emplea, así en vasos de precipitados.
Sirven para homogenizar muestras y transportar pequeñas
cantidades de ella; agitar y trasvasar líquidos;
desprender partículas de precipitados adheridos al
recipiente que no se pueden sacar.
9. BEAKER: Son vasos de vidrio que se utilizan
para efectuar mezclas y titulaciones. Hay de diferentes
volúmenes, de 25 ml a 500 ml
10. JERINGAS Y AGUJAS HIPODERMICAS: son
materiales peligrosos que necesitan manejarse con
precaución para evitar la inyección accidental o a
generación de aerosoles durante las inoculaciones.
Generalmente, la utilización de las mismas debe
restringirse a los procedimientos para los que no existe una
alternativa. Las agujas no deben doblarse, romperse, guardarse en
la funda, o quitarlas de la jeringa después de su
uso.
11. PORTA Y CUBRE OBJETOS: Son de vidrio. El
porta objetos sirve para montar muestras de microorganismos, es
más grande y más grueso que el cubre objetos, ya
que éste sirve para cubrir las muestras montadas y
permitir una mejor visualización.
12. PIPETAS PARA RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS: Es
graduada a una dilución de 1/200. Es de vidrio con una
cápsula en la parte sub terminal que permite almacenar el
líquido diluyente en la sangre para una mezcla
adecuada.
13. CAMPANA DE BREWER: Son de vidrio pirex,
grueso y tienen mayor resistencia mecánica y
térmica. Se usa para mantener una ambiente carente de
oxígeno cuando se trabajan con bacterias exigentes. El
borde esmerilado debe estar ligeramente cubierto con vaselina
blanca o alguna grasa blanca especial, para conseguir un cierre
hermético al aire.
14. ASA DE KOLLE: Consiste de dos piezas: el
mango de Kolle y el asa, de bronce cromado y mango con bakelita.
Son de un material inoxidable. Sirve para tomar muestras y poder
realizar el cultivo en las placas petri.
15. MECHERO DE BUNSEN: Son aparatos para mantener
un ambiente de esterilidad cuando se trabajan con siembra de
microorganismos.
16. TRIPODE: Es de metal, construido de un anillo
circular apoyado en tres patas equidistantes, que son varilla
delgadas. Se utilizan para colocar sobre el la malla de asbesto
en una operación de calentamiento de cualquier matraces
con medios de cultivo.
17. GRADILLA: Es de metal o de madera. Es una
especie de escalerilla portátil y sencilla. Sirve para
portar a los tubos de ensayo durante un trabajo con
éstos.
18. GOTERO: Son tubos de vidrio cortos y
delgados, donde en uno de los extremos se adapta una perilla o
bombilla de goma y en el otro extremo se encuentra estrangulado.
Se emplea para la adición de pequeños
volúmenes (gotas) de colorantes en tinciones.
EQUIPOS
1. AUTOCLAVE: Es un equipo cuyo uso se destina a
la esterilización de material para laboratorio. En la
parte superior hay un termómetro y un barómetro que
funciona: esterilización por aumento de la temperatura a
altas presiones.
2. INCUBADORA: Sirve para mantener en la
temperatura adecuada al cultivo de bacterias. Mantiene a una
temperatura de 37 a 34 °C
PRACTICA Nº
02
Manejo del
microscopio y el mundo microbiano
OBJETIVO
El alumno reconocerá el microscopio compuesto,
identificará cada una de sus partes y lo manejará
correctamente observando la presencia de microorganismos en
muestras biológicas
MATERIAL
Microscopio compuesto
Porta y cubre objetos
Palillo
Hisopo
Agua estancada
INTRODUCCION
El microscopio es el instrumento más
frecuentemente utilizado y el más útil en un
laboratorio de Microbiología, proporciona la
amplificación o agrandamiento que nos permite ver
organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los
microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones, desde
cien veces a cientos de miles de veces.
Las dos categorías de microscopios disponibles
son los microscopios ópticos y los microscopios
electrónicos. Los microscopios ópticos utilizan un
sistema de lentes ópticas y comprenden los microscopios de
campo claro, campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases.
Los microscopios electrónicos emplean haces de electrones
en lugar de ondas de luz para producir una imagen
ampliada.
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO
ÓPTICO
Colocar el objetivo de menor aumento en
posición de empleo y bajar la platina completamente.
Si el microscopio se recogió correctamente en el uso
anterior, ya debería estar en esas
condiciones.Colocar la preparación sobre la platina
sujetándola con las pinzas
metálicas.Comenzar la observación con el objetivo de 4x
(ya está en posición) o colocar el de 10
aumentos (10x) si la preparación es de
bacterias.Para realizar el enfoque:
Acercar al máximo la lente del objetivo a la
preparación, empleando el tornillo
macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y
no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de
incrustar el objetivo en la preparación
pudiéndose dañar alguno de ellos o
ambos.Mirando, ahora sí, a través de los
oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
preparación con el macrométrico y, cuando se
observe algo nítido la muestra, girar el
micrométrico hasta obtener un enfoque fino.
Pasar al siguiente objetivo. La imagen
debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente
con mover un poco el micrométrico para lograr el
enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por
completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el
objetivo anterior y repetir la operación desde el paso
3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la
preparación y por ello es fácil que ocurran dos
tipos de percances: incrustarlo en la preparación si
se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con
aceite de inmersión si se observa una
preparación que ya se enfocó con el objetivo de
inmersión.
PROCEDIMIENTO
Técnicas de montaje
húmedo
La gota pendiente o las preparaciones húmedas
permiten examinar organismos vivos suspendidos en un fluido. Las
preparaciones húmedas se hacen colocando una gota del
fluido que contiene el organismo sobre una lámina de
vidrio y cubriéndola con una fina pieza de vidrio
(cubreobjetos): para reducir la tasa de evaporación y
eliminar corrientes de aire, generalmente se rodea la gota con
vaselina.
Cuando se examinan las preparaciones húmedas por
microscopía de campo claro, es importante ajustar la
fuente de luz de forma adecuada. Es posible disminuir la
intensidad de la luz mediante la utilización de filtros
especiales.
Utilizada para estudiar la movilidad de los
microorganismos
En el centro de un portaobjetos coloca una gota de
agua estancadaCon una laminilla cubre cuidadosamente dicha gota,
sin formar burbujas de aireExamina con objetivos de 10X y 40X.
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué es poder de
resolución?
____________________________________________________________________________________
2. ¿Con qué finalidad se utiliza el
microscopio compuesto?
__________________________________________
3. ¿Cual es la importancia que tiene el diafragma
en el microscopio?
__________________________________________________________
4. ¿Qué diferencias hay entre el
microscopio óptico y electrónico?
________________________________________________________
5. ¿Que importancia tiene el estudiar y observar
los microorganismos en muestras biológicas
frescas?
__________________________________________________________
6. Escribe el nombre de cada una de las partes del
microscopio compuesto
OBSERVACIONES
Dibuja lo observado en los diferentes objetivos para
cada muestra que preparaste durante el experimento.
CONCLUSIONES:
_______________________________________________________________
Práctica Nº 02
Nombre del Alumno:______________________________
Grupo___________
Prof. de Laboratorio ______________________________
Calif:___________
PRÁCTICA
Nº 03
Coloraciones
bacterianas: coloración de Gram
OBJETIVO
El alumno aplicará una técnica de
coloración diferencial para la identificación de
bacterias Gram positivas y Gram negativas.
MATERIAL
Asa de Kolle
Microscopio
Porta objetos
Cultivo de Staphylococcus aureus
Cultivos de Escherichia coli
Cultivo de Candida albicans
Aceite de inmersión
Colorante cristal violeta
Solución decolorante alcohol
acetonaColorante safranina
Lugol para Gram
INTRODUCCIÓN
TINCION DE GRAM
Tinción empleada en microbiología para la
visualización de bacterias en muestras clínicas.
También se emplea como primer paso en la
diferenciación bacteriana. El examen con microscopio
óptico de preparación con tinción de Gram se
emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las
formas comunes son cocos, bacilos y formas espiraladas
Las bacterias pueden diferenciarse con esta
tinción en dos grupos. Los microorganismos Gram positivos
se tiñen de azul, mientras que aproximadamente un tercio
de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos
espiralados se tiñen de rojo y se dice que son Gram
negativos.
Las aplicaciones más comunes de la
coloración de Gram son las siguientes:
La presencia de cocos Gram positivos agrupados
sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en
forma de lanceta a los diplococosLa presencia de diplococos Gram negativos son
características de especies de NeisseriaLos bacilos Gram positivos grandes sugieren especies
de Bacillus o Clostridium, los bacilos Gram positivos
pequeños sugieren especies de Listeria o una de las
corineiformes (difteroides)Los bacilos Gram negativos son las bacterias
más comunes halladas en los laboratorios
clínicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no
fermentados y especies de Haemophilus.
El valor diagnóstico de esta tinción es
variable; normalmente permite una buena orientación al
microbiólogo para seleccionar las técnicas de
cultivo más adecuadas y también tiene valor en
orientar hacia un diagnóstico etiológico, en
especial para instaurar un tratamiento inicial.
PROCEDIMIENTO
REALIZACIÓN DEL FROTIS
Coloca una pequeña gota de agua en el centro
de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de
agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en
el extremo curvo de su filamento queda retenida una
mínima gota de agua, que resulta
suficiente.Flamea el asa de siembra y toma en condiciones
asépticas una pequeña cantidad del cultivo
bacteriano y transfiérelo a la gota de agua. Remueve
la mezcla con el asa de siembra hasta formar una
suspensión homogénea que quede bastante
extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de
un cultivo en medio líquido, no es necesario que
realices los dos primeros pasos ya que basta con colocar y
extender una gota de la suspensión bacteriana, que se
toma con el asa de siembra, directamente sobre el
portaobjetos.
FIJACIÓN
Acerca la lámina a la llama del mechero para
que la muestra se seque en forma paulatina. En este caso hay
que tener mucha precaución de no calentar demasiado la
lámina, pues las células pueden deformarse o
romperse.
COLORACIÓN
Tiñe con cristal violeta, 1minuto.
Lava con abundante agua el exceso de
colorante.Cubre con Lugol, 1 minuto.
Lava con agua el exceso de Lugol.
Decolora con alcohol-acetona o simplemente con
alcohol hasta que la preparación deje de perder color
(30seg)Lava con abundante agua para eliminar el resto de
disolvente.Tiñe con safranina 1 minuto.
Lava con agua para eliminar el colorante de
contraste.Seca la preparación.
Examina al microscopio con aceite de
inmersión y fijándote sobre todo en el color de
cada preparación.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es un colorante?
________________________________________________________________
2. ¿Con qué finalidad se fija la muestra
de microorganismos en el porta objetos?
________________________________________________________________
3. ¿Qué tipos de coloraciones conoces,
describe brevemente
___________________________________________________________________________________________________________
4.- ¿Por qué es necesario emplear aceite
de inmersión para la observación de los
microorganismos?
_______________________________________________________________________
5. De los reactivos que utilizaste para la
tinción de Gram, ¿El cristal violeta a qué
estructuras de la bacteria colorea?
_____________________________________________________________________________
6. ¿Por qué se dice que la
coloración Gram es de orientación?
__________________________________________________
7. Menciona tres bacterias Gram positivas y escribe la
enfermedad que causa cada una de ellas
___________________________________________________________________________________
8. Menciona tres bacterias Gram negativas y escribe la
enfermedad que causa cada una de ellas
__________________________________________________________________
OBSERVACIONES:
Realiza los dibujos y esquemas correspondientes a las
tinciones realizadas
CONCLUSIONES:
__________________________________________________________________
Práctica Nº 03
Nombre del Alumno:_________________________________
Grupo______
Profesor de Laboratorio_______________________________
Calif:______
PRÁCTICA
Nº 04
Coloración
ácido-alcohol resistente
OBJETIVO:
El alumno aplicará las técnicas de
coloración de microorganismos ácido-resistentes
para diferenciarlos e identificarlos, en base a sus propiedades
morfológicas
MATERIAL:
Esputo de tuberculoso procesado en
autoclave.Fucsina fenicada de Ziehl- Neelsen
Azul de metileno
Alcohol acidulado
Fenol al 5%
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos pertenecientes al género
Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular
completamente diferente a las restantes bacterias. La pared de
las Mycobacterias posee un alto contenido de lípidos
(ácidos micólicos), que la hace impermeable a los
agentes hidrofílicos. Las Mycobacterias son teñidas
adecuadamente por el método de Ziehl-Neelsen
(Tinción Ácido-Rápida o Acid-Fast Stain) que
utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y
ácido clorhídrico. Son bacilos ácido-alcohol
resistentes (BAAR) por lo que la tinción de Ziehl-Neelsen
es útil para la coloración de estos microorganismos
obtenidos de muestras clínicas o de cultivo. Con esta
tinción, los bacilos aparecen de color rojo brillante
sobre un fondo azul. Los bacilos tuberculosos son
difíciles de teñir con la tinción de Gram, y
se observan como bacilos Gram positivos con tinción
irregular. Estos microorganismos una vez coloreados son
resistentes a la decoloración
ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos
Ácido Alcohol Resistentes (BAAR)
El género Mycobacterium incluye
más de 100 especies que pueden clasificarse en seis grupos
desde el punto de vista bacteriológico, pero con fines
didácticos se dividen en tres apartados: Complejo
tuberculosis. Incluye las especies M. tuberculosis,
Mycobacterium bovis y Mycobacterium africanum,
productoras todas ellas de tuberculosis. Se incluye
también Mycobacterium microti, productor de
tuberculosis en rata. Complejo lepra, en el que se incluyen las
especies M. leprae, productor de la lepra humana y
Mycobacterium lepraemurium, que produce lepra en
roedores. El Mycobacterium leprae que es un
parásito intracelular obligado que se multiplica
lentamente en células fagocitarias mononucleares como los
histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los
nervios Otras Micobacterias, no comprendidas en los dos grupos
anteriores, sólo algunas de ellas suelen ser
patógenas, otras pueden ser patógenas oportunistas
y finalmente otras suelen ser saprofitas. Producen las
denominadas micobacteriosis las infecciones producidas por M.
avium, M. kansakii, M. fortuitum y M.
chelonei son consideradas oportunistas y no
tuberculosas
PROCEDIMIENTO
Prepara un frotis del esputo, haciendo un delgado
extendido del material para su estudio y deja que se seque al
aire.Cubre la preparación con fucsina
fenicadaCalienta la preparación en un mechero Bunsen
durante 5 minutos, no debe hervir. Si se evapora,
añade más fucsina para que no se seque en
ningún momento.Lava con agua el resto de colorante.
Decolora con ácido-alcohol, hasta que
adquiera un tenue color rosa.Lava con agua para que no prosiga la
decoloración.Tiñe con azul de metileno por 1
minuto.Lava con agua el resto de colorante.
Seca la preparación al medio
ambiente.Examina al microscopio con objetivo de
inmersión por 100 X (aceite)La tinción es positiva para bacilos rojos
contra un fondo azul claro
CUESTIONARIO
1. Describe las características
morfológicas del bacilo de la tuberculosis
_______________________________________________________________________________
2. ¿Por qué el bacilo de Koch tiene mucha
resistencia a la desecación?
_____________________________________________________________
3. ¿Cuál es el protocolo de tratamiento
para un paciente con TBC?
_______________________________________________________________________
4. ¿En qué casos el médico solicita
el cultivo de esputo para el diagnóstico de una posible
TBC?
_______________________________________________________________________
5. ¿Cómo se hace el reporte de la
coloración Ziehl – Neelsen?
_____________________________________
OBSERVACIONES:
Haz un esquema de los pasos que realizaste durante la
realización de la práctica, así como el
dibujo de las bacterias bacilares observadas en el
microscopio.
CONCLUSIONES:
___________________________________________________________________
Práctica Nº 04
Nombre del Alumno:_________________________________
Grupo______
Profesor de Laboratorio_______________________________
Calif:______
PRACTICA Nº
05
Medios de
cultivo
OBJETIVO
Conocer los medios de cultivo y la finalidad que
cumplen.Aplicar técnicas de siembre y observar la
variedad de microorganismos presentes en el medio
ambiente.
MATERIAL
Placas con Agar nutritivo
Placas con Agar Mac Conkey
Placas con Agar Manitol Salado
2 Mecheros
caja de hisopos estériles sin
abrirtoallas de papel
cinta adhesiva
marcador permanente o lápiz de
ceraun desinfectante con 70% de solución de
alcohol, 10% de una solución blanqueadora,
jabón líquido Extran o alkox.
INTRODUCCIÓN
Uno de los sistemas más importantes para la
identificación de microorganismos es observar su
crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en
el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los
microorganismos es el Medio de Cultivo. Para que las
bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado
de humedad y presión de oxígeno adecuado,
así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un
medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante. La mayoría de las bacterias patógenas
requieren nutrientes complejos similares en composición a
los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso,
la base de muchos medios de cultivo es una infusión de
extractos de carne y Peptona a la que se añadirán
otros ingredientes. El Agar es un elemento solidificante muy
empleado para la preparación de medios de cultivo. En los
diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales
de enriquecimiento como carbohidratos, suero, sangre completa,
bilis, etc. Los carbohidratos se adicionan por dos motivos
fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y
para detectar reacciones de fermentación de los
microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre
completa se añaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes.
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO:
A) POR SU ASPECTO FISICO
Medios líquidos. Se emplean fundamentalmente
para:
Cultivar los microorganismos y obtener grandes
cantidades de los mismos. La multiplicación bacteriana
en los medios de cultivos líquidos se manifiesta
generalmente por el enturbiamiento de éste;Estimular y promover la selección de
algún o algunos microorganismos e impedir que otros se
multipliquen.Identificar al microorganismo estudiado mediante
pruebas bioquímicas.
Medios semisólidos.- Se utilizan para
identificaciones bioquímicas y averiguar si el germen
estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen
una consistencia blanda. (0.5 gramos de agar por 100
ml)
Medios sólidos.- Se utilizan para obtener
colonias aisladas de microorganismos. En los medios de cultivos
sólidos la multiplicación bacteriana se manifiesta
por una formación macroscópica denominada colonia
bacteriana, que es el resultado de la multiplicación de
una sola célula bacteriana. (2 gramos por 100
ml)
B) POR SU FUNCION
I. Medios de cultivos comunes o básicos.
Se caracterizan por que el material nutritivo, permite el
crecimiento de diferentes especies de bacterias, constituyen la
base para la preparación de otros medios. Como ejemplo
pueden citarse el caldo nutritivo y el agar nutritivo.
II. Medios de cultivos especiales. Entre estos se
encuentran:
a) Medios enriquecidos. En general son los mismos medios
básicos a los que se les agrega una sustancia
enriquecedora como sangre, suero, etc. El uso está
orientado especialmente a obtener buen desarrollo de bacterias
exigentes, se utilizan en primera instancia en el aislamiento
bacteriano de productos patológicos. Los medios de este
tipo de uso más frecuente son: Agar sangre, Agar
chocolate.
b) Medios selectivos. Son medios que contienen
sustancias que impiden el crecimiento de algunas especies
microbianas y permiten el desarrollo de otras. Se incluyen en
este grupo el agar cristal violeta para el aislamiento de
bacterias Gram(-) y el agar telurito de potasio para el
aislamiento de bacterias Gram(+).
c) Medios de cultivos diferenciales. Se emplean para
demostrar alguna propiedad bioquímica de la bacteria como
degradación de carbohidratos, proteínas, etc.,
contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias
que detectan cambios en el medio o en las características
típicas de las colonias. Entre los de uso más
corriente se encuentran: Agar fierro-triple-azúcar (TSI
agar) Medio de SIM.
d) Medios de transporte. Estos medios impiden que se
altere la proporción original de la flora microbiana en
los especimenes, es decir, que no permiten la
multiplicación de las bacterias manteniéndolos
viables.
Técnicas de siembra
La población microbiana existente en nuestro
entorno es grande y compleja. Cientos de especies microbianas
habitan normalmente en distintas partes de nuestro cuerpo,
incluidas la boca, el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los
microbios inmediatamente empiezan a colonizar nuestros cuerpos,
así como a casi todos los objetos del mundo. Ellos flotan
alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que
ofrezca comida y resguardo. Se encuentran más
frecuentemente en la oscuridad, en objetos húmedos que a
menudo entran en contacto con la comida, la suciedad o la
vegetación. Las superficies del baño, los cepillos
para el cabello, los refrigeradores, los lavaplatos y las tablas
de cocina tienen a menudo muchos microbios. Las manijas y las
paredes tienen menos porque son pobres en nutrientes y
secos.
Un estudio adecuado de microorganismos que hay en este
hábitat requiere técnicas que permitan conocer y
ordenar la compleja población mixta o cultivo mixto,
separándole en sus distintas especies como cultivos puros.
Un cultivo puro consta de una población de células
derivadas todas ellas de una célula parental. El material
que se inocula sobre el medio se denomina inóculo mediante
alguna técnica. Durante la incubación a 37°C,
las células microbianas individuales se reproducen tan
rápidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen
colonias. Si dos células microbianas procedentes del
inóculo original quedan muy cerca una de otra sobre el
medio de Agar, la masa de células observables no
será un cultivo puro. La mayoría de los microbios
en nuestro cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero
algunos son patógenos o causan enfermedad.
La siembra de microorganismos puede realizarse en medios
líquidos o en medios sólidos. En el primer caso,
para la inoculación se utilizará asa estéril
si el medio de partida es sólido, o pipeta estéril
(Pasteur o graduada) si es líquido. En el segundo caso,
cuando se parte de otro medio sólido, se utiliza el asa de
platino normal para siembra en placa o tubo inclinado y el asa
recta para siembra en picadura en tubos rectos o, en general,
cuando se quiere introducir el microorganismo en el seno del
medio de cultivo sólido; cuando el medio de partida es
líquido, se puede pasar al medio sólido con un asa
de platino calibrada, con la que se extiende la muestra
directamente, o con pipeta, depositando la muestra que luego se
extenderá sobre la placa con un asa de Digralsky o con una
varilla doblada.
PROCEDIMIENTO
En esta actividad escogerás un fomite (cualquier
objeto inanimado que pueda causar enfermedad en los organismos
por contener microorganismos como: la manija, el marco, el
control remoto de la televisión, una moneda). Este fomite
ayudará a confirmar la presencia de microbios y los
efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias
de bacterias en un medio de cultivo en placas de
Petri.
1. Si tienes el cabello largo, recógetelo para
mantenerlo lejos de las placas de Petri cuando estés
trabajando. Lava tus manos. Limpia tú área de
trabajo frotando suavemente, con la solución desinfectante
en una toalla de papel. Saca tus placas de Petri pero no las
abras hasta que se te indique.
2. Escoge un objeto del salón de laboratorio (la
manija, el marco, el control remoto de la televisión, una
moneda, etc.). Toma una placa de Petri sin abrir y con
tú lápiz de cera o marcador, divide la base de la
caja en cuatro secciones iguales. Escribe el nombre del objeto al
otro lado y designa las secciones de 1 hasta 4. Abre la caja de
hisopos de algodón y escoge uno con cuidado para no tocar
la punta. Limpia tu objeto escogido con todos los lados de la
punta del hisopo volteándolo y retorciendo el hisopo a
medida que lo mueves por la superficie del objeto.
3. Ahora abre la tapa de la placa y suavemente
haz cuatro siembras sobre la superficie del medio de cultivo como
se muestra en la ilustración, empezando en la
sección designada "1" y continuando en el orden de las
secciones, de manera que la última siembra esté en
la sección 4. Presiona firme pero suavemente y no repitas
las siembras anteriores. Tus siembras sólo deben dejar una
impresión muy ligera en el Agar. Cierra la placa. No
cubras la caja con cinta o no podrás verla
bien.
4. Divide una segunda caja de Petri en 4 secciones
numeradas de 1 hasta 4 y desígnala "Control."
Limpia la mitad del objeto que escogiste anteriormente con
una toalla de papel humedecida con agua, solo
frótala un par de veces; no la restriegues. Con un
nuevo hisopo estéril, toma muestra del área
limpiada. Abre la tapa de la segunda placa y haz SUAVEMENTE 4
siembras en la superficie, siguiendo el orden de las secciones
numeradas como lo hiciste previamente. Cierra la
placa.
5. Divide la tercera placa de Petri en 4 secciones
numeradas y desígnalas con el nombre del
desinfectante que escogiste (por ejemplo "blanqueador").
Usa el desinfectante escogido para limpiar la otra mitad
del objeto que trabajaste antes. Con un nuevo hisopo
estéril, toma muestra del área. Repite el proceso
de sembrar la placa y ciérrala.
6. Esteriliza los hisopos usados con desinfectante y
descártalos. Pon las placas en un lugar apartado e
incúbalas a 37°C por 24 horas. Limpia tu área
de trabajo con la solución desinfectante y lava tus
manos.
7. Repite todo el experimento utilizando placas con
cultivo de Agar sangre sólo que ahora selecciona otro
Fomite que no hayas empleado
8. Después de que hayan pasado 24 horas, mira las
placas de Petri iniciales. No la abras. Crea una tabla que
compare las placas sembradas antes y después de limpiar el
objeto (mira la tabla de ejemplo). Asegúrate de indicar si
los microbios crecieron en cada siembra.
9. Nota: el profesor supervisor debe hacer este paso
preferiblemente Cuidadosamente abre las placas de Petri en un
lavadero e inúndalas con blanqueador o alcohol sin diluir.
Déjalas por una hora y enjuágalas completamente;
colócalas en una bolsa plástica, amárrala y
descártala. Asegúrate de no tocar la superficie de
las placas cuando las abras y lava tus manos cuidadosamente
después de manipularlas. Limpia tú área de
trabajo con la solución desinfectante.
CUESTIONARIO
1. ¿Qué es metabolismo
bacteriano?
_________________________________________________________________
2. ¿Qué finalidad tiene utilizar medios de
cultivo sólidos?
_________________________________________________________________
3. Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que se
emplean en el laboratorio de microbiología
_________________________________________________________________
4. ¿Por qué la base de muchos medios de
cultivo es una infusión de extractos de carne y
peptona?
_________________________________________________________________
5. ¿Qué medios de cultivo se emplean para
aislar bacterias causantes de meningitis, tifoidea y
neumonía?
_________________________________________________________________
6. ¿Cómo podemos controlar la
contaminación microbiana?
_________________________________________________________________
7. Completa en la siguiente tabla anotando X en
los espacios correspondientes a las divisiones realizadas en
donde hayan crecido los microorganismos:
A) MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR NUTRITIVO
B) MEDIOS DE CULTIVO CON AGAR SANGRE
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