Cultivo in-vitro como herramienta para la preservación de orquídeas

Introducción

El cultivo in vitro (término que literalmente significa en vidrio), incluye diferentes técnicas destinadas a multiplicar, entre otros, material vegetal o animal. El cultivo de tejidos vegetales involucra a diferentes técnicas para propagar material vegetal diverso, incluyendo protoplastos (células desprovistas de su pared celular), células, tejidos, órganos y plantas completas. Este tipo de cultivo consiste en tomar una porción de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente un medio de cultivo nutritivo esterilizado, que permita regenerar una o muchas plantas; las condiciones de asepsia y el poder controlar el crecimiento de los explantes hacen de este método una herramienta muy importante para la propagación masiva de plantas en vías de extinción, o plantas recalcitrantes o para clonar individuos que tienen características agronómicas y ornamentales deseables (mejores frutos, resistentes a las sequías, colores de la flores, etc.), donde las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902 (Stewart & Kane, 2006).

Otras numerosas aplicaciones del cultivo in vitro en plantas han sido: la obtención de plantas libres de virus, producción de semillas sintéticas, conservación de germoplasma, obtención de metabolitos secundarios, producción de nuevos híbridos, mejora genética de plantas, entre otros.

Las aplicaciones del cultivo in vitro en orquídeas tiene como principal uso la conservación en germoplasma, además, las plantas producidas de esta manera son de gran interés para los programas de reintroducción de especies nativas en áreas de preservación del medio ambiente (Araujo, 2004). Por ejemplo, en 1922 que se logró el primer experimento exitoso con germinación in vitro de semillas de orquídeas (Knudson, 1922). Ya que la familia Orchidiaceae es una de las más diversas dentro del reino vegetal debido a su extensa variedad de especies (Giovanny Giraldo, 2012), existen cálculos aproximados de 26.000 especies de orquídeas a nivel mundial, de las cuales, Colombia alberga aproximadamente un 15% (Betancur, 1988); la diversidad de ecosistemas presentes en la geografía colombiana, favorece la ecología de las orquídeas dando lugar a especies exóticas y endémicas. Actualmente se cree que existen 4.030 especies, agrupadas en 260 géneros, distribuidos en la región Andina (87,2%), Pacífica y Amazónica (10,6%), Caribe y Orinoquia que presentan los valores más bajos en términos de riqueza y abundancia (5% y 4%, respectivamente) (Andrade-C, 2011).

Además, algunas especies de orquídeas han sido catalogadas como bioindicadores del nivel de la fragmentación o integridad de las comunidades vegetales de las que forman parte, especialmente las que poseen un hábito terrestres (Díaz, 2009) puesto que son sensibles a los cambios ambientales, la destrucción del hábitat, la contaminación y las aplicaciones de plaguicidas, debido a que requieren condiciones especiales como la Microbiota del suelo y la permanencia de la flora autóctona para su supervivencia (Janeckova et al., 2006) y varias especies de esta familia de plantas presentan gran importancia ornamental y comercial debido a la diversidad de formas, tamaños y colores de sus flores; además, algunas tienen gran importancia industrial, como lo es Vanilla planifolia cuyas cápsulas son utilizadas en la fabricación de licores, bebidas, cosméticos y aromatizantes (Beltrán & Martínez, 1996) y los géneros Bletia y Cyrtopodium cuyos pseudobulbos son usados para la creación de pegamentos (Vinccon & Cetzal, 2013); incluso, a algunas especies de la familia Orchidiaceae se les han atribuido propiedades curativas debido a sus fragancias por medio de técnicas de aromaterapia. (Beltrán & Martínez, 1996)

No obstante, la germinación de las orquídeas en estado silvestre necesitan de agentes externos como son los hongos, especialmente de la especie (Rhizoctonia sp.) para obtener un porcentaje alto de germinación determinando una relación simbiótica semilla-hongo (jijón- meristemo de orquídea), esto debido a la ausencia de e endospermo en sus semillas, que es un factor limitante para su desarrollo y supervivencia in vivo (Salazar-Mercado, 2012).

Aun cuando algunas especies sean abundantes localmente, la familia Orchidiaceae tiene el mayor número de especies amenazadas o en peligro de extinción, ocupando el primer lugar en las plantas; pese que se encuentran prácticamente en todos los ecosistemas naturales y en muchos de ellos hay gran número de especies, por particularidades en sus ciclos de vida varias orquídeas se encuentra con rangos de distribución geográficos y altitudinales reducidos, por lo que pueden estar gravemente amenazadas (Calderón-Sáenz 2007).

Por lo anterior, se ha optado por desarrollar como herramienta para la conservación de las orquídeas su cultivo in vitro. Con el fin de conocer un poco más sobre esta herramienta de conservación de orquídeas, en el presente trabajo se busca recopilar información básica sobre el cultivo in vitro de estructuras como semillas, meristemos y ápices en la familia Orchidiaceae.

Cultivo in vitro

El cultivo de tejidos vegetales comprende un conjunto de técnicas ampliamente usadas para propagación in vitro, sus resultados en tasas de germinación son más elevadas en comparación con el de germinación en condiciones naturales (Araújo, 2004). Sin embargo, una desventaja es el alto costo de componentes utilizados para el medio de cultivo, entre éstos, el agar (solidificante más utilizado), pues la demanda ha elevado su precio (Martín-Gordo et al. 2012). Se ha probado que la implementación de almidones o gomas como agentes gelificantes alternativos permite la disminución en los costos de los medios de cultivo para tejido in vitro de hasta el 70% comparados con los del agar, fisiológicamente hablando los mejores resultados se obtienen en las sustituciones parciales que se han estudiado (Martín-Gordo et al. 2012; Mengesha et al., 2012).

Debido a que la formulación del medio de cultivo es esencial para la propagación in vitro dado que este suministra los nutrientes necesarios (minerales, vitaminas, regula- dores del crecimiento, etc.) para el desarrollo de la planta, este deberá prepararse con diferentes combinaciones de nutrientes de acuerdo con los requerimientos de cada especie y parte a propagar ya que existen diferentes partes de las que se puede desarrollar una planta por el cultivo in vitro como lo son semillas, de meristemos (ápices y yemas), protoplastos y nodos(Faria et al., 2002).

2.1. Asepsia en el cultivo in vitro.

Es común el encontrar que los medios de cultivo preparados son repartidos en los recipientes que permiten la entrada de luz y de un tamaño adecuado para la planta a sembrar en dicho medio (frascos de vidrio regularmente), se tapan con papel aluminio y posteriormente se envuelven en papel periódico, se marcan lotes con la fecha y finalmente se llevan al autoclave donde son esterilizados con vapor húmedo bajo presión a 15 libras por 20 minutos (Botero et al. 2008), esto debido a que dichos medios no sólo presentan condiciones óptimas para el crecimiento de las orquídeas, existe un sin fin de hongos y bacterias que pueden crecer con gran facilidad.

Cultivo de semillas

En condiciones naturales, las orquídeas se propagan a través de la producción y dispersión de diminutas semillas, pero a pesar de que cada cápsula de orquídea puede contener entre 200.000 y 600.000 semillas dependiendo del género y la especie (Botero et al. 2008), sólo unas cuantas germinan y tienen la posibilidad de alcanzar la edad adulta, dificultando así su producción masiva (Cañas, 1991). La germinación de semillas de orquídeas en condiciones naturales presenta algunas limitaciones ya que carecen de endospermo y en consecuencia de la reserva de nutrientes necesarios para su desarrollo, esto hace indispensable la presencia de un hongo formador de micorrizas para que se puedan desarrollar (Chugh et al., 2009; Hossain et al., 2013; Pedroza – Manrique et al., 2010; Rosa – Manzano et al., 2014). Debido al poco conocimiento que se tiene de los hongos micorrizantes asociados, la germinación asimbiótica es comúnmente usada en la propagación de orquídeas tropicales (Botero et al. 2008) y dichos medios artificiales se convirtieron en una manera de conservar diferentes especies de orquídeas (chugh et al., 2009, Antonio, 2012; Mahendran et al, 2012).

Knudson (1922) demostró que en ausencia de hongos era posible la germinación de semillas de orquídeas, que dichas semillas eran capaces de desarrollarse en un medio rico en minerales y azúcares, dicha técnica se catalogó como germinación asimbiótica de semillas; en términos generales, el medio usado para la germinación asimbiótica es más complejo que para la germinación simbiótica, ya que todos los nutrientes orgánicos e inorgánicos y los azúcares deben estar disponibles para la orquídea en una forma apropiada, puesto que no existe la intermediación del hongo que facilite su nutrición (Botero et al. 2008). En este sentido existen varios métodos y medios desarrollados con el fin de llevar a cabo la conservación mediante micropropagación (chugh et al., 2009, Antonio, 2012; Mahendran et al, 2012), algunos medios que salen a relucir son Morel (1965), ½ MS (1962), Vacin y Went (1949) y Knudson C (1946) (Rodríguez et al 2007).

La formulación de sales Murashige y Skoog (1962), el cual fue desarrollado inicialmente para el crecimiento de callos de tabaco y en la actualidad se emplea como medio de cultivo basal para un grupo importantes de plantas de interés para la alimentación y con fines ornamentales como lo son las orquídeas (Faria et al., 2002).

Las cápsulas y/o semillas deben ser desinfectadas previa la siembra de semillas debido a que estas pueden presentar gran cantidad de microorganismos que pueden proliferar en el medio e inhibir el crecimiento de las semillas. Usualmente para las capsulas se usa un detergente comercial (twin o detergente en polvo) en solución por 20 minutos en agitación constante, seguidas de lavado con agua estéril y posterior inmersión en hipoclorito al 0.5% por 10 minutos y enjuagadas tres veces con agua estéril (Pedroza – Manrique et al 2010).

En todos los casos las semillas estériles se cultivan en recipientes de vidrio o plástico sobre un medio de agar nutritivo que contiene los azúcares y minerales necesarios para que las semillas germinen y crezcan, además se ajusta un pH específico, que según knudson (1951) el rango de pH óptimo varía entre 4.5 y 5.5 (Bertolini et al, 2014). Sin embargo, el conocimiento acerca de la mejor formulación del medio de cultivo para cada especie todavía es limitado, esto debido a que un gran número de factores influye en la germinación y el crecimiento in vitro de orquídeas y estos son altamente dependiente de las especies (Araújo et al 2006).

En resultados obtenidos con especies del estado de Tabasco (Catasetum integerrimun Hook, Encyclia alata, Encyclia cordigera, Epidendrum flexuosum, Epidendrum chlocorymbos, Epidendrum stamfordianum, Myrmecophila sp., Trichocentrum ascendens, Trichocentrum car- thagenense, Oncidium sphacelatum, Prosthechea cochleata, Nidema boothii, Trichocentrum lindenii), se han obtenido resultados aceptables con promedios de germinacio´n de semillas de un 70 a 90% empleando los medios VW (Vacin y Went), MS, y MS a la mitad de su concentración, todos ellos adicionados con 0.1% de carbo´n activado (Mayo Mosqueda et al, 2010).

3.1. Hormonas y elementos para el cultivo de semillas

En muchos casos se recomienda el uso de hormonas vegetales tipo auxina tales como ANA (ácido naftalenacético) y el AIA (ácido indol acético) en combinación con hormonas tipo citocinina, de las cuales la más recomendada es la BAP (Bencil amino purina) ( Pérez et al., 2001; Botero et al., 2008).

El carbón activado también es un elemento ampliamente utilizado en cultivo de tejido de plantas, normalmente a una concentración del 0.5%, se usa para estimular enraizamiento en propagación de yemas puesto que puede absorber la citoquinina favoreciendo un balance endógeno auxina/citoquinina que facilite la iniciación de las raíces (Cheruvatour et al., 2010)

Los resultados dados a los 53 di´as desde la siembra de la semilla de Comparettia speciosa, demostraron que el 4,512% de semilla hinchada fue con el tratamiento Murashige con IBA 1 ppm BA 1 ppm siendo este el mejor (Molina Cabrera ,2012)

3.2. Aditivos naturales

Actualmente, amantes de las orquídeas producen sus propias plantas en laboratorios caseros a partir de germinación asimbiótica vitro, y para ello utilizan medios de cultivo constitución orgánica (Silva et al., 2002). Entre los extractos naturales utilizados en el cultivo de semillas de orquídeas, se pueden encontrar la pulpa homogeneizada banano, agua de coco, peptona, triptona, levadura, hidrolizado de caseína, jugo de tomate, jugo de piña y extracto de papa (Torres et al. , 2001). Estos aditivos contienen mezclas de vitaminas y aminoácidos y algunos actúan como reguladores del crecimiento (Pierik, 1989).

Diversos aditivos tales como coco complejo (endospermo, agua, leche), peptona de pulpa de banano (verde o maduro) han sido utilizados en medios de cultivo de tejidos y la germinación de la orquídea (George, 1993). Se puede encontrar informes de que el uso de pulpa de banano sobre la germinación de Cymbidium, Dendrobium, Phalaenopsis y Paphiopedilum (Arditti y Ernst, 1993), pero según Torres y Barbosa (2001), la pulpa de banano puede promover efectos diferentes en cultivo in vitro, como espesante y/o crecimiento de las raíces, dependiendo de la variedad y de la cantidad de pulpa utilizada.

El agua de coco, en general 3 a 15% (v / v) y el aditivo que más se ha utilizado para un número de especies en vitro, no sólo para estimular el crecimiento de callo, sino también para aumentar la formación embriogénesis somática, inducir la división de granos de polen, y en su primera aplicación, en la inducción del desarrollo de embriones inmaduros (Caldas et al., 1998). Knudson (1922) observó que la sacarosa, la fructosa y otros complejos 231 Quelato de hierro y agua de coco en la germinación in vitro de Rossioglossum grande (Orchidaceae), químicos de extractos vegetales, favorecen la germinación y promueven el desarrollo de los protocormos. El endospermo líquido de la semilla de coco se ha usado a varias concentraciones y varias especies establecidas in vitro, incluyendo las orquídeas, ya que contiene vitaminas, enzimas, azúcares, fuentes nitrogenadas, reguladores de crecimiento y una fracción de sales inorgánicas (Hicks, 2007). Los efectos promotores del agua de coco se deben a la presencia de compuestos orgánicos como citoquininas, zeatinas, kinetinas y purinas, que se consideran promotores del crecimiento vegetal (Yong et al., 2009; Hicks, 2007). Las citoquininas juegan un papel fundamental en la organogénesis vegetal, ya que inducen la formación de hojas y brotes y aumentan la velocidad de desarrollo y la germinación de la semilla (Werner et al., 2001; Huan et al., 2004)

Araújo et al (2006) encontraron que la adición de 100 g L-1 pulpa de banano promovió mayor alargamiento del brote y raíz, peso fresco, y mayor acumulación de raíces para plántulas de híbridos de semillas germinadas in vitro Cattleya loddigesii 'Gran' x Cattleya loddgesii 'Alba'.

Para la iniciación de la germinación y formación de plántulas de las especies Prosthechea vespa y S. klotzscheana, con el medio MS+Jugo de Piña, se encontró el mayor porcentaje de plántulas formadas de las especies objeto de estudio.(Salazar Mercado & Cansino, 2012). De esto se puede inferir que la adición adecuada de componentes orgánicos, como agua de coco y jugo de piña al medio de cultivo MS in vitro, es un elemento importante para la germinación y desarrollo de plántulas, debido a que son ricos en energía y contienen iones inorgánicos, aminoácidos, vitaminas, reguladores de crecimiento y ácidos orgánicos necesarias para el desarrollo de las semillas de orquídeas (Kitsaki et al., 2004, Yong et al., 2009; Abbas et al., 2011).

3.3. Medios combinados

Existen medios que combinan aditivos naturales como hormonas, ejemplo de esto tenemos:

La combinación de 50 y 200 ml L-1 agua de coco y 100 g L-1 pulpa de plátano en medio Knudsosn C, mostró una interacción significativa para el número de raíces, dicha interacción proporciona mejores resultados en número de raíces y la masa fresca de los brotes, respectivamente (Araújo et al 2006).

El medio C de Knudson adicionado con ANA (1 mg/lt) y 15% de agua de coco, promueve la germinación de manera eficiente en la especie Dendrobium chrysantum Wall. (Orchidiaceae) (De et al., 2006). Además, el agua de coco empleada en Cattleya mendelii Dombrain (Orchidiaceae) ha dado resultados significativos en la germinación, comparada otros medios de cultivo combinados como lo es Knudson con jugo de piña, AIA y GA3 (Salazar-Mercado, 2012).

Cultivo de meristemos y ápices

El cultivo de meristemos es un método efectivo para la eliminación de infecciones virales y es el material preferido para la conservación de germoplasma. La razón principal por la cual las células meristematica son resistentes a los virus es que el meristemo carece de tejidos vasculares, que es por donde se propagan los virus que van contaminando a la planta, pero esta no es la única razón, existen otros factores: a) El meristemo apical tiene una mayor velocidad de crecimiento y en consecuencia el virus "no alcanzan" al meristemo, b) en una célula meristematica el virus tiene mayor dificultad de acoplamiento con los ribosomas, debido a que estas células tienen un código de trabajo muy definido, y además, c) existe una competencia por uso de algunos metabolitos entre células y virus. (Muñoz, 2006).

En el caso de las orquídeas, es más complejo la extracción del meristemo, ya que se comienza partir de la germinación de la semilla y brotes en desarrollo. El proceso de germinación empieza cuando la semilla se hincha y toma un color verde, lo que origina una estructura indiferenciada en forma esférica denominada protocormo, este protocormo origina la plántula completa después de pasar por cinco etapas de desarrollo descritos por Seaton y Ramsay (2005): (1) formación del protocormo; (2) aparición de los rizoides; (3) aparición del meristemo apical; (4) desarrollo de la primera hoja; y (5) aparición de la primera raíz verdadera.

Después de identificado el meristemo se procede a la eliminación de hojas encontrando la parte apical para reconocer y extraer el meristemo, este se siembra y se debe esperar que el medio sea el adecuado para obtener un resultado positivo (Bertolini et al, 2014) como se hablará más adelante.

En el caso del corte del material vegetal antes de la siembra se recomienda, controlar el pulso, no olvidar la posición de los codos para contrarrestar las vibraciones de la cámara de flujo, trabajar con agujas de insulina si desea ya que el corte es más fino y pequeño y eliminar en lo que más pueda los primordios foliares ya que se obtendrá mejores resultado en la eliminación de virus. (Cruz, 2011).

Como anteriormente se dijo, el cultivo de meristemos provee plantas libre de virus, pero existen técnicas que proveen un mayor grado de confianza para conseguir dichos resultados, entre estas encontramos la termoterapia o la quimioterapia en combinación con el cultivo de meristemos donde: la termoterapia o tratamiento térmico consiste en elevar o bajar la temperatura para eliminar bacterias, micoplasmas e inactivar los virus en plantas enteras, órganos, tejidos o meristemos, cuando los virus son excesivamente dañinos.(Salazar, 2013) y la quimioterapia es la aplicación de productos químicos al medio de cultivo, lo que ocasiona una mayor probabilidad de obtener plantas libres de patógenos ya que, cuando se aplican diferentes productos quimioterapéuticos de manera exógena al medio de cultivo, estamos asegurando la obtención de material sano (rivero, 2007) .

4.1. Medios utilizados para el cultivo de meristemos y ápices:

Se han desarrollado distintos métodos de propagación por meristemos dependiendo del tipo de explante, brotes vegetativos en crecimiento, los cuales deberán ser esterilizados en Hipoclorito de calcio o de sodio al 4% por 20-30 minutos. Luego se enjuagan en agua destilada estéril y se procede al aislamiento y siembra de los meristemos o de las yemas en medio de cultivo.(Debora, 2009).

Donde, Cada medio utilizado para el cultivo in vitro de plantas tiene
condiciones especiales de nutrientes para un crecimiento óptimo de la
especie, los cuales son específicos de acuerdo a la parte de la planta
que se está cultivando y a la respuesta que se desea obtener (Penacho,
et al. sf).

por ejemplo, esta propagación masiva a partir de meristemos permite la comercialización de orquídeas nativas y de gran valor a partir de unos pocos especímenes, ya que la multiplicación in vitro de orquídeas es alta y en periodos cortos de tiempo, donde, se han evaluado diversos medios de cultivo, como en resultados obtenidos en Costa rica se encontró que para la regeneración de meristemos extraídos, el medio de cultivo Murashige Y Skoog (1062) suplementado con 0,5 mg/l de benciladenina (BA) fue el mejor medio de cultivo, en el cual se obtuvo un 100% de regeneración de los meristemos(Muñoz-Bustos,1998) y en otras investigaciones se ha encontrado que el pH adecuado para el cultivo de meristemos es de 4.8 y 5.5 (también para semillas).(Arditti, 1993).

También, según Huang, 1984; Gutiérrez y Chen-Han, 1999; Homes et al., 1972 citado por Alvarado, 2000. El uso del agua de coco también es bastante común en el cultivo de meristemos de Cattleya, especialmente en la etapa de introducción por su capacidad de estimular la formación de cuerpos protocórmicos en las células epidérmicas y por la presencia de altos valores de aminoácidos esenciales en el endospermo líquido del coco.

sin embargo, cuando se presenta casos de oxidación en el cultivo de meristemos además de lavar los explantes con Ácido Ascórbico, Tiourea y L-Cisteína, en trabajos como el realizado con orquídeas C. skinneri y en el híbrido C. skinneri x C. maxima, se utilizó el medio líquido para una mayor difusión de los fenoles y el uso Carbón Activado en medio semisólido de enraizamiento fueron prácticas para contrarrestar la oxidación, que produjeron una respuesta positiva, también es muy frecuente el uso de medio de cultivo líquido en agitación ya que promueve la división celular y mantiene disueltos los poli fenoles que liberan los tejidos, la oxigenación celular y el aprovechamiento de nutrientes es mayor. (tesis de skinneri).

Por último, otro aspecto importante son las intensidades de luz usadas para el cultivo de semillas, de meristemos o yemas, que van desde la oscuridad hasta los 300 Lux, generalmente obtenidos con lámparas fluorescentes y algunas veces complementados con lámparas incandescentes. Los fotoperiodos más adecuados para la germinación de semillas y cultivo de tejido de plántulas son también adecuados para el cultivo de meristemos (Arditti, 1993).

Conclusión

Como vimos a lo largo de la revisión, son múltiples las metodologías y las estructuras que se pueden usar para la propagación in vitro de orquídeas como el cultivo de semillas y de meristemos (ápices y yemas) y así velar por su preservación. Sin embargo, son procesos complejos y con muchos desconocimientos en la fisiología, fisonomía y respuestas de estas plantas mediante este tipo de multiplicación, no obstante, esto se debe a la gran variedad de especies que presenta esta familia de plantas y los escasos esfuerzos en su estudio, por lo anterior, es necesario seguir generando avances y estudios como los mencionados para que esta frontera de conocimiento disminuya.

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Autor:

Medina-Hernández, J.D.1,

Montilla-Alvarez, T.A.1,

Muñoz-Ramírez, J.S.*1

Ramos-Sanabria, F.L1.

1 Curso de metodología de la Investigación, Estudiante de Pregrado, Programa de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad del Tolima, Tolima, Ibagué, Colombia.