Detección de núcleos secundarios y evaluación de la bioactividad de Ruda
Resumen
Objetivo: Identificar los principales núcleos secundarios presentes en el extracto de ruda (Ruta graveolens) y evaluar su potencial antimicrobiano, antifúngico y antioxidante in-vitro.
Métodos: El trabajo se desarrolló realizando un extracto etanolico de ruda (Ruta graveolens). El extracto fue sometido a pruebas para la detección de carbohidratos, saponinas, taninos, flavonoides, alcaloides y cumarinas, además se evaluó la capacidad antifúngica y antimicrobiana del extracto mediante su dilución en agar y la siembra de Aspergillus niger y Strepyococcus aureus respectivamente. Por último se evaluó la capacidad antioxidante del extracto a través de los métodos DPPH y CATH.
Palabras clave: Ruta graveolens, núcleos secundarios, actividad antimicrobiana, actividad antifúngica, antioxidante.
Introducción
Las plantas son fuentes de un gran número de productos metabólicos de importancia comercial y son usados en las industrias farmacéutica, alimenticia, de cosméticos y como fuentes de numerosas sustancias de interés agroquímico.1 Se estima que más de 100 000 metabolitos secundarios son producidos por las plantas.2 Aproximadamente 1 600 estructuras químicas nuevas obtenidas a partir de plantas superiores se describen cada año, de las cuales un gran número tiene actividad biológica.3-4 La fitoquímica se encarga del estudio de metabolitos secundarios extraídos de plantas con el objetivo de identificar principios activos o que presenten actividad biológica,5 para ello se han desarrollado una serie de técnicas y procedimientos que permiten determinar de forma rápida la naturaleza química de los compuestos presentes en una muestra. En muchas ocasiones la detección de bioactivos permite orientar el tratamiento de enfermedades y en otros casos el reemplazo de compuestos sintéticos por compuestos de origen natural que sean mejor aceptados por el organismo.6 Por lo tanto no está lejos de la realidad que en los últimos años las investigaciones fitoquímicos sobre plantas tradicionalmente medicinales se haya incrementado enormemente.
La familia Rutaceae comprende alrededor de 161 géneros y más de 1600 especies7 dentro de las cuales algunas han demostrado una diversa variedad de compuestos bioactivos y capacidades antibióticas8 motivo que ha despertado su estudio y la caracterización detallada de su bioquímica. El género Ruta es conocido por su capacidad para emanar olores a través de sus hojas, la mayor parte de las especies del género son nativas de la región mediterránea 9-10 muchas de ellas son utilizadas en la medicina tradicional por sus capacidades terapéuticas.10-11 Dentro del grupo destacan las especies Ruta graveolens [Ruda] y Ruta chalepensis [Rua ó Fijel] ya que crecen bajo diferentes condiciones lo que ha permitido ampliar su cultivo y producción.12 Es común encontrar ruda cultivada en huertos o jardines, pues se utilizada como planta ornamental, medicinal, como especia e incluso como "protectora de energías".13 Investigaciones anteriores han demostrado que dentro del género Ruta existen especies que presentan terpenos y ácidos orgánicos14 flavonoides,15-16 compuestos cumaricos, cetonas aromáticas17 y alcaloides.18-19 Además dentro de los alcaloides encontrados se han identificado acridonas, furoquinonilonas y alquilquinonilonas.20-21 Se han identificado sustancias como la rutina y la inulina propias de este género.22 Se ha demostrado que tratamientos con Ruta graveolens tienen efectos antitumorales, antioxidantes, antiinflamatorios23 y antimicrobianos.24 Por sus propiedades ha sido empleada en el control de plagas demostrando el efecto de repelencia e insecticida a coleópteros como es el caso del gorgojo del frijol (Acanthoscelides obtectus) y el escarabajo de la patatas (Leptinotarsa decemlineata),25 también presenta efectos contra ácaros parásitos de abejas.26 Estudios proponen que esta planta puede ser una alternativa para el control de mosquitos trasmisores de enfermedades como es el caso del control de larvas de Culex quinquefasciatus y Anopheles albimanus,27 por ultimo ha demostrado efectos de control sobre nematodos que atacan raíces de plantas de cultivo.28-29-30 Por lo tanto está demostrado que el género Ruta ofrece una gran oportunidad para el estudio de componentes bioactivos. El objetivo de este trabajo fue identificar los principales núcleos secundarios presentes en el extracto de ruda (Ruta graveolens) así como su capacidad antibiótica o de control biológico.
Métodos y materiales
Método de extracción El material vegetal fue sometido a macerado en etanol al 96% durante 24h, la relación entre el material utilizado y el solvente fue 1:10. Los extractos fueron almacenados en viales de vidrio hasta su utilización.
Identificación de núcleos secundarios La detección de núcleos secundarios se realizó por diferentes metodologías distribuidas en grupos según el compuesto que identifican, a continuación se nombran las metodologías utilizadas:
Determinación de carbohidratos
Prueba con reactivo de Molish
Prueba con reactivo de Benedict
Determinación de la presencia de saponinas
Prueba de la espuma
Prueba de Rosenthaler
Determinación de la presencia de taninos
Prueba del cloruro férrico
Prueba de la gelatina-sal
Determinación de la presencia de flavonoides
Prueba de Shinoda
Ensayo de Zn/HCl
Cromatografía de capa delgada
La fase estacionaria utilizada en esta prueba consistió en sílíca gel GF254, mientras la fase móvil se compuso de acetato de etilo: ácido fórmico: agua (8:1:1). El revelado de la placa se hizo con exposición a la luz UV a una longitud de onda de 366 nm.
Determinación de la presencia de terpenoides/esteroides
Reacción de Salkowski
Determinación de la presencia de alcaloides
Reactivo de Tanred
Reactivo de Valser
Reactivo de Mayer
Cada metodología se encuentra descrita de forma específica en la guía de detección rápida de algunos núcleos secundarios5 motivo por el que no se hará hincapié en especificar los procedimientos realizados.
Determinación de la actividad antioxidante
Prueba Actividad estabilizadora del radical (DPPH)
Prueba Capacidad Antioxidante Total Hidrosoluble (CATH)
Determinación de la actividad antifúngica
La actividad antifúngica se determinó a través de la siembra A. niger en 2 placas de agar PDA con envenenamiento del medio a 15ml de agar por 1 ml de extracto concentrado y de extracto diluido. En la placa de agar se realizaron siete punciones diferentes (Ver Fig 1.) para observar la capacidad inhibitoria del crecimiento del hongo. La placa se incubo a 37°C durante 7 días.
FIGURA 1. Disposición de las punciones sobre la placa de agar para la prueba de actividad antifungica.
Determinación de la actividad antimicrobiana La actividad antimicrobiana se determinó a través de la dilución de una cepa de Shaphylocuccus aureaus en solución salina, que posteriormente fue sembrada en agar sangre, se prepararon 4 discos impregnados con diferentes tratamientos (extracto concentrado, extracto diluido, antibiótico estándar y control negativo) y con una disposición en 4 cuadrantes (ver Fig. 2). La placa fue incubada a 37°C durante 3 días.
FIGURA 2. Disposición de los cuadrantes sobre la placa de agar para la prueba de actividad antimicrobiana.
Resultados y discusión
DETERMINACION DE CARBOHIDRATOS
La prueba de Molish resulto positiva para la presencia de carbohidratos debido a la aparición del anillo rojo en la interface. La prueba de Benedict coincidió con los resultados obtenidos en la prueba de Molish ya que se presentó un precipitado rojo ladrillo luego de que la muestra fuera sometida 5 minutos al baño de maría. Los resultados obtenidos en este ensayo coinciden con lo registrado por Chen et al. (2001)31 quienes demostraron la presencia de sacáridos y glicosidos en un estudio fitoquimico realizado a diferentes plantas del genero Ruta.
DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE SAPONINAS
Tanto la prueba de espuma como la prueba con reactivo de Rosentaler resultaron negativas para la presencia de saponinas, anteriormente Hnatyszyn et al. (1974)32 reporto la presencia de saponinas en un extracto de R. graveolens, aunque se trata del único registro que fue posible encontrar en la literatura consultada. La no coherencia de los resultados puedes estar ligada a diversos factores, unos de origen biológico y fisiológico pues Salgueiro et al. (1997)33 han reportado que el clima, el genotipo, las condiciones de cultivo y las condiciones de crecimiento afectan la composición química de las plantas. Otros factores pueden estar relacionados con una diferencia en la composición química de las muestras, lo que lleva a resultados divergentes. Por ultimo puede deberse a problemas de calidad en el procedimiento.
DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE TANINOS
La prueba de cloruro férrico presento precipitado pardo verdoso lo que significa la presencia de taninos condensados tipo catecol, mientras la prueba de gelatina sal presento cambio en la coloración y precipitado, posiblemente el cambio de color se debe a la precipitación de los taninos que anteriormente se encontraban suspendidos. La presencia de taninos coincide con lo reportado por Kacem et al. (2015)34 quienes afirman que existen taninos en los extractos de Ruta chalepensis y el caso del extracto de etanol la presencia fue de 13.55 mg/g de peso seco, resultados que también fueron registrados por Khlifi et al. (2013)35 cuyos resultados registran una actividad de 5,47 mg/g de peso seco. Si se compara la proporción de los taninos contra otros componentes de los extractos registrados por otros autores se puede observar que los taninos no son los compuestos más abundantes. Lamentablemente las pruebas realizadas en este trabajo no son cuantitativas y no permiten comparar los contenidos de taninos presentes en el extracto estudiado con los resultados obtenidos por otros investigadores.
DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE FLAVONOIDES
La prueba de Shinoda y la prueba de Zn/Cl se presentaron como negativas para la presencia de flavonoides, este resultado difiere de lo encontrado por Kacem et al.(2015)34 y Hnatyszyn et al. (1974)32 quienes encontraron flavonoides en un extractos de Ruta chalepensis bajo diferentes métodos de extracción. Por otra parte Rojas et al. (2011) reportaron ausencia de flavonoides para un extracto de R. graveolens, estos resultados apuntan a que el extracto estudiado puede pertenecer a una muestra de la especie R. graveolens, aunque también entran en conflicto con el resultado obtenido para la prueba de saponinas. El trabajo de Rojas et al. (2011)36 con muestras de la zona de Mérida, Venezuela presenta unas condiciones de cultivo que se asemejan más a las vistas en el valle del Magdalena, esto acoplado a lo concluido por Salgueiro et al. (1997)33 respecto a las condiciones de cultivo y manutención pueden explicar el cambio en la composición de los extractos de R. graveolens y es un indicio para pensar que la química de las plantas puede cambiar su composición según la latitud a la que son mantenidas las plantas, aunque se requiere de más datos para determinar la validez de esta hipótesis.
La lectura de la placa de TLC demostró la presencia de Antocianinas y Flavonoides, dado que las antocianinas son consideradas glúcidos (Wong 1995)37 se puede afirmar que este resultado concuerda con lo encontrado en la prueba de carbohidratos. Por otro lado los resultados obtenidos en la cromatografía no coinciden con lo visto en prueba de flavonoides y dado que muchos autores han registrado la presencia de flavonoides en los extractos de la familia Rutaceae (Akkari et al. 2015, Kacem et al. 2015, Eun-Tae et al. 2014, Haddouchi et al. 2014, Khlifi et al. 2013, Raghav et al. 2006, Ivanova et al. 2005, Alzokery & Nakahara 2003, de Feo et al. 2002, Chen et al. 2001)8-31-34-35-38-39-40-41-42-43 es posible que la ausencia de estos en la prueba de flavonoides se deba a un error de procedimiento o a una condición no optima de los reactivos utilizados. Los autores anteriormente mencionados respaldan los resultados positivos para la presencia de flavonoides en el extracto de Ruda utilizado. Los flavonoles ya han sido identificados previamente en extractos de R. graveolens (Kacem et al. 2015)34 además han sido estudiados por su capacidad alelopática sobre algunas especies de arvenses (Aliotta 1996, 1995).44-45
DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE TERPENOIDES/ESTEROIDES (Reacción de Salkowski)
Los dos ensayos utilizados para detectar la presencia de terpenos resultaron positivos. Anteriormente se ha detectado la presencia de alcanfor en las hojas de Ruta chalepensis, el alcanfor es un compuesto perteneciente al grupo de los terpenos y se considera que puede estar presente en otras plantas dentro de la familia rutaceae (Mejri et al 2010).46 Aceites de R. graveolans han registrado hasta un 11.2% de terpenos en su composición (De feo el al. 2002) lo que significa un valor alto con respecto al presentado por compuestos como flavonoides o taninos. Dentro de la composición de extractos de R. graveolens se ha registrado la presencia de Rutina flavonoide responsable de la actividad antiinflamatoria y que opera como un captador de óxido nítrico (Panhwar & Memon 2013, Raghav 2006, Shen et al. 2002). 40-47 Dentro del grupo de los terpenoides y esteroides se ha registrado la presencia de cumarinas (Hnatyszyn et al. 1974)32 y fluocumarinas (Aliotta et al. 1996, 1995)44-45 en extractos de R. graveolens.
DETERMINCIÓN DE LA PRESENCIA DE ALCALOIDES
FIGURA 4. Pruebas de presencia de alcaloides. Las 3 pruebas para la presencia de alcaloides (Tanred, Meyer y Valser) resultaron positivas, lo cual es acorde a la gran variedad de alcaloides reportados para la familia rucaceae. Hnatyszyn et al. (1974)32 fueron los primeros en reportar la presencia de alcaloides, aunque no fue sino hasta 1990 cuando Ulubelen & Tan48 publicaron de forma detallada la composición de alcaloides presentes en extractos de R. chalepensis. Touati et al. (2000)19 ha reportado una composición de alcaloides en Ruta montana que es muy similar a la vista en R. chalepensis.
Para R. graveolens se han registrado alcaloides como acridona, arborinina, furoquinolina hidroxilada, skimmianina y graveolina, algunos de ellos con capacidad mutagenica y fotomutagenica ya demostrada (Perez et al. 1999).49
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA
Los dos ensayos realizados en agar PDA resultaron positivos en la inhibición del crecimiento de A. niger, anteriormente se ha descrito la capacidad fungicida en aceites esenciales dentro del grupo Ruta e incluso se muestran más efectivos que los fungicidas sintéticos (Haddouchi et al. 2013).39 Ivanova et al. (2005)41 reportaron que el efecto fungicida de R. graveolens no se presentó sobre una cepa de Candida albicans, posiblemente por el desarrollo de resistencia a los componentes responsable. Se han planteado algunas teorías respecto al compuesto o compuestos responsables de la actividad antifungica algunos autores confieren esta propiedad a los monoterpenos aromáticos (Haddouchi et al. 2013),39 aunque otros autores confieren esta actividad a los terpenos alcohólicos y a las cetonas (Mailhebiau, 1994),50 pero también se ha planteado que es la Rutacridona la responsable de esta actividad (Meepagala et al. 2005).20 Lamentablemente se debe profundizar en el estudio individual de cada uno de estos compuestos pues la Rutacridona se ha reportado como una sustancia mutagénica (Perez et al. 1999)49 y hasta el momento no se ha llegado a un consenso acerca de cuál es la sustancia responsable de esta actividad.
FIGURA 5. Placas de agar PDA a los 7 dias de cultivo, a la derecha la placa de agar con envenenamiento de extracto concentrado, a la izquierda la placa de agar con envenenamiento de extracto diluido.
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
La actividad antimicrobiana del extracto puede considerarse positiva ya que tanto el extracto concentrado [Cuadrante 1] como el extracto diluido [Cuadrante 2] presentaron halo de inhibición semejantes al encontrado con el antimicrobiano comercial [Cuadrante 3], por último el control positivo [Cuadrante 4] no presento actividad inhibitoria. En varias ocasiones se ha demostrado la capacidad antibacteriana de los extractos de Ruta graveolens y Ruta chalepensis sobre organismos como Listeria monocitogenes, Staphylococcus aureus y Bacillus cereus (França & Nascimiento 2015, Haddouchi et al. 2013, Alzoreky & Nakahara 2003),39-49-51 Micrococcus flavus, Micrococcus luteus (França & Nascimiento 2015),51 aunque, los mismos extractos parecen no tener efectos inhibitorios sobre organismos como Eschechia coli y Salmonella infantis aún bajo diferentes condiciones (França & Nascimiento 2015, Ivanova et al. 2005, Alzoreky & Nakahara 2003).41–42-51 Aparentemente dentro del grupo Ruta la única especie sin capacidad antimicrobiana es R. angustifolia que además carece de alcoholes monoterpenos en la composición de sus extractos con respecto a otras plantas del grupo Ruta (Haddouchi et al. 2013).39 Fluorocumarinas y flavonoides aparecen como responsables de la actividad antibiótica in vitro en las rutaceas (Aliotta et al. 1996, 1995),44-45 efecto que además parece ser potenciado cuando el extracto se realiza bajo el procedimiento de maceración con etanol (Ivanova 2005).41
FIGURA 6. Placa de agar sangre a los 7 días de cultivo.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
Se encontró que el extracto de R. graveolens si presenta actividad antioxidante en los dos ensayos realizados, aunque esta actividad al parecer estar ligada a condiciones de concentración. El modelo de regresión lineal para el ensayo CATH permitió obtener una relación mucho mejor con respecto al obtenido en el ensayo DPPH. No se encontraron registraron anteriores de ensayos CATH realizados a extractos o aceites esenciales en plantas del grupo Ruta, pero fue posible establecer una relación positiva entre la concentración del extracto y la absorbancia. El ensayo CATH permitió calcular un 91% de inhibición promedio en el extracto analizado, valor que ha sido apoyado por otros autores (Kacem 2015, Khlifi et al. 2015)34-35 aunque bajo otros ensayos para actividad antioxidante.
FIGURA 7. Modelo de regresión lineal para el ensayo CATH.
La figura 8 muestra la regresión lineal obtenida por el ensayo DPPH, la cual presento una relación negativa entre la concentración y la absorbancia obtenida, este resultado ha sido registrado anteriormente por Khlifi et al. (2013)35 quienes obtuvieron una disminución en el % de inhibición por encima de las 150PPM del extracto. Este comportamiento pudo deberse a las características del extracto o a un impedimento en la capacidad del ensayo para desarrollarse bajo concentraciones tan altas, en cualquiera de los casos se requiere profundizar en el estudio y la dinámica de los compuestos responsables de la actividad antioxidante.
FIGURA 8. Modelo de regresión lineal para el ensayo DPPH.
El factor de relación entre cada ensayo y la regresión lineal estandarizada para el ácido ascórbico muestra que para el ensayo CATH existe una relación que tiende a 0 es decir que presenta una tendencia confiable mientras el ensayo DPPH presenta valores por encima de 1, valores que solo pueden presentarse cuando ha existido algún problema en el procedimiento o en la lectura por parte de los equipos, en este caso se recomienda descartar el ensayo dado que no presenta validez.
Anteriormente se ha atribuido la capacidad antioxidante de algunos extractos a las antocianinas (Panhwar & Memon 2013),47 los fenoles y a los flavonoides (Raghav et al. 2006)40 presentes en los extractos, afirmación que puede ser sustentada debido a que las pruebas para detectar la presencia de antocianinas y flavonoides mostraron resultados positivos.
Conclusiones
El extracto etanolico de ruda (Ruta graveolens) analizado presenta las características comunes del genero Ruta, así como la presencia de carbohidratos, taninos, terpenos, alcaloides, antocianinas y flavonoides (flavonoles). Se demostró que el extracto de Ruda presenta actividad antioxidante, antimicrobiana y antifúngica, lo que confirma su uso en la medicina tradicional. Este estudio permitió observar que existen aspectos aun no determinados sobre el comportamiento de los metabolitos presentes en el extracto de ruda y que se requiere profundizar en el estudio de estos para determinar futuros usos y aplicaciones.
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DETECCIÓN RÁPIDA DE ALGUNOS NÚCLEOS SECUNDARIOS, CARACTERIZACIÓN DE UNA DROGA CRUDA Y EVALUACIÓN DE POTENCIAL BIOACTIVO EN UN EXTRACTO ETANÓLICO DE RUDA.
RAPID DETECTION OF SOME SECONDARY NUCLEUS, CARACTERIZATION OF RAW DRUG AND EVALUATION OF BIOACTIVE POTENCIAL IN ETANOLIC EXTRACT OF RUDA.
Autor:
Daniel R. Cruz-Dueñas.
Teresa Mantilla-López.
Maria Camila Olaya-Peña.
Camila Zabala-Hernandez.