Indice
1.
Abortos
2. Patogenia
3. Enfermedades abortivas causadas por
diversas bacterias
4. Campylobacteriosis genital
bovina
5. Aislamiento de
Campylobacter fetus
6.
Listeriosis
7. Tuberculosis
bovina
8. Enfermedades originadas por
hongos que pueden causar abortos
9.
Aspergilosis
10.
Mucormicosis
11.
Candidiasis
Se define como la expulsión uterina en cualquier
etapa de la gestación de un feto muerto o vivo que no ha
alcanzado el grado de desarrollo
para ser viable. El aborto no es
una enfermedad específica, sino un signo clínico de
numerosas enfermedades que afectan ya
sea al feto, a la placenta, al aparato
reproductor de la madre o que causan enfermedad
sistémica en la madre.
El aborto es sin
duda el signo de dichas enfermedades que más alarma causa
entre los propietarios, ya que se ven afectados por la
pérdida de fetos y bajas en la producción, además de que en muchos
casos la fertilidad subsecuente del animal se ve afectada
negativamente.
Se considera que aproximadamente el 90% de los abortos
son debidos a causas infecciosas. Los mecanismos por los cuales
un agente infeccioso produce aborto son variados y
dependerán del tipo de organismo infectante, el
órgano que ataca o la etapa de gestación en la que
actúa; muchas enfermedades sistémicas de la madre
pueden resultar en aborto aún cuando los órganos
reproductores no se vean directamente afectados, en éstos
casos el aborto puede resultar por una marcada elevación
de la temperatura
materna, la cual causa hipoxia y acidosis en el feto.
De la misma forma infecciones localizadas en cualquier
órgano y causadas por microorganismos Gram- pueden
resultar en una endotoxemia capaz de producir el aborto debido a
la capacidad que tienen las endotoxinas de inducir la síntesis
de prostaglandina F2α en muchos tejidos.
Ademαs, las endotoxinas causan
coagulaciσn intravascular, interfiriendo con
la coagulación sanguínea a nivel de la
placenta.
En el caso de infecciones que afectan directamente al feto o a la
placenta, el organismo responsable debe primero llegar al
útero gestante. Para lograrlo es posible que siga una de
las siguientes rutas:
- Vía hemática: Es la vía
más común y adquiere mayor importancia hacia el
final de la gestación. El organismo infectante puede
entrar al organismo materno a través del aparato
digestivo (Brucella abortus, Salmonella, Leptospira,
Listeria), o de la mucosa nasal o conjuntival ( Rinotraqueitis
infecciosa bovina, Leptospira, parainfluenza, diarrea viral
bovina); en todo aso siempre existe una bacteria o viremia
materna antes de que se produzca invasión del
útero, desde el cual el organismo infectante puede
invadir la placenta y luego pasar al feto. - Vía ascendente: ésta vía de
infección es más común en las fases
tempranas de la gestación. Los microorganismos pueden
entrar por vagina (Campylobacter, Trichomona, Corynebacterium
pyogenes, ureaplasma), desde donde ascienden hacia el
útero o pueden ser depositados directamente en el
útero durante la cópula o la inseminación
artificial. - Vía descendente: es la ruta más rara y
consiste en el descenso de una infección desde los
oviductos hacia el útero, puede ocurrir en casos de
peritonitis.
Una vez que el organismo infectante llega a la placenta,
se encuentran con una variedad de condiciones que favorecen su
establecimiento y desarrollo en ese lugar. Por ejemplo, la
tensión de oxígeno
en la placenta es baja y favorece el desarrollo de organismos
anaeróbicos. Además, la placenta produce algunas
sustancias que estimulan el crecimiento de algunos
microorganismos. La Brucella abortus, por ejemplo, es estimulada
por la sustancia erithritol que se encuentra en grandes
cantidades en la placenta y líquidos fetales. Esta
sustancia es un carbohidrato que Brucella abortus usa como fuente
de energía y que también se encuentra en
vesículas seminales y testículos
de los machos, lo que explica la preferencia de ésta
bacteria por éstos tejidos.
El insuficiente desarrollo inmunológico del feto, y por
ende de la placenta contribuye también a facilitar el
establecimiento de los microorganismos infectantes.
Cuando el microorganismo llega a la placenta o feto, se pueden
presentar una variedad de condiciones dependiendo de la
virulencia o patogenicidad del microorganismo:
- Si el microorganismo es de baja patogenicidad, y solo
causa una ligera inflamación de la placenta, es posible
que el aborto no se produzca y se lleve a cabo un parto a
término, aunque probablemente seguido de una
retención placentaria. - Si el microorganismo tiene una patogenicidad
intermedia la inflamación de la placenta puede ser
moderada, con focos de placentitis severa que irán
extendiéndose lentamente. Este avance progresivo de la
inflamación interfiere con el funcionamiento normal de
la placenta, lo que causa estrés
en el feto sin llegar a matarlo, como resultado del
estrés la hipófisis fetal libera ACTH, la cual
inicia la cascada de eventos que
desencadenan en parto, y como consecuencia se produce el aborto
de un feto recién muerto o el parto de un feto vivo pero
inmaduro, y por tanto con pocas posibilidades de
sobrevivir. - Si el microorganismo es de patogenicidad elevada
puede matar al feto muy rápidamente, ya sea por los
daños causados a la placenta o al feto mismo. En
éstos casos la muerte
fetal se producirá antes de que se desencadene el
mecanismo del parto, por lo que muchas veces el feto
morirá y permanecerá dentro del útero para
convertirse bien sea en un feto momificado, en un feto macerado
o en un feto enfisematoso. En algunos casos el feto será
finalmente expulsado varios días después de su
muerte,
presentando un grado de autólisis elevado que indica que
la muerte ha ocurrido tiempo
atrás.
La placentitis que a menudo resulta de la
infección del útero y placenta puede causar hipoxia
del feto. En éstos casos es común observar que el
líquido amniótico está teñido con
meconio, esto es el resultado de baja oxigenación del
intestino fetal, la cual causa que se incremente el peristaltismo
y se relaje el esfínter anal, resultando en
expulsión de meconio hacia la cavidad amniótica.
Además la hipoxia estimula el reflejo respiratorio del
feto, el cual comienza a hacer movimientos inhalatorios,
resultando en la inhalación de líquido
amniótico hacia los pulmones, lo cual resulta en
neumonía fetal. Al avanzar la hipoxia el feto muere por
asfixia, y en caso de sobrevivir hasta que se produzca el parto
es muy posible que muera en las primeras horas después del
nacimiento debido a la neumonía desarrollada durante la
vida fetal.
En los casos en los que el organismo infectante invada el feto a
partir de la placenta, dicha invasión puede seguir dos
vías:
- Puede penetrar al feto por vía circulatoria a
través del cordón umbilical.
Cuando la infección penetra el feto vía
circulatoria, el primer órgano encontrado va a ser el
hígado, el cual puede sufrir necrosis, como en el caso de
IBR o hepatitis
supurativa, o como en el caso de infecciones por Listeria o
Campylobacter fetus. Posteriormente el agente infectante invade
la circulación general del feto y puede lesionar otros
órganos, causando neumonía, lesiones renales o
lesiones oculares.
- Puede penetrar vía oral al tragar el feto
líquido amniótico contaminado con el
microorganismo infectante.
Si el agente infectante llega al feto atravesando las
membranas fetales para llegar a la cavidad amniótica, el
contacto de la piel del feto
con líquido amniótico contaminado favorecerá
el desarrollo de dermatitis o además el feto
deglutirá líquido amniótico contaminado, lo
que resultará en lesiones intestinales.
Causas de abortos mas comunes en animales domesticos
Infecciosas
- Bacterias:
- Brucelosis: Brucella abortus (bovinos),
Brucella suis (cerdos), Brucella melitensis (cabras),
Brucella ovis (ovinos), Brucella canis
(caninos). - Vibriosis: Campylobacter fetus (bovinos y
ovinos). - Salmonelosis: Salmonella abortus ovis (ovinos),
Salmonella abortus equi (equinos). - Leptospirosis: Leptospira pomona, Leptospira
gripotiphose, Leptospira icterohemorrágica,
Leptospira canicola, Leptospira hardjo, (afectan todas
las especies). - Listeriosis: Listeria monocytogenes (ovinos y
bovinos). - Metritis contagiosa equina: Haemophilus
equigenitalis. - Ureaplasmosis: Ureaplasma urealyticum
(bovinos). - Streptococcus zooepidermicus
(equinos). - Tuberculosis: Mycobacterium bovis
(bovinos). - Esporádicamente: Escherichia coli,
Corynebacterium pyogenes, Pasteurella multocida,
Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomona aeruginosa (en
cualquier especie).
- Brucelosis: Brucella abortus (bovinos),
- Hongos
- Aspergillosis: Aspergillus spp (afecta todas
las especies). - Mucormicosis: Rhizophus, Absidia, Mucor (
Afectan todas las especies). - Candidiasis: Candida albicans
(equinos).
- Aspergillosis: Aspergillus spp (afecta todas
Criterios para el diagnostico de causas de
aborto
La historia clínica
individual es importante para el diagnóstico, pero
igualmente importante es la historia clínica a nivel del
hato; factores tales como incidencia de abortos,
repetición de calores, cambios en el índice de
concepción, edad o número de pariciones de las
hembras afectadas, pueden ser de gran utilidad en la
orientación del diagnóstico. Para llevar a cabo
ésta parte del diagnóstico en forma apropiada es
importante contar con registros
confiables de todos los aspectos reproductivos del
hato.
Muchas enfermedades que causan abortos presentan
además otros signos a nivel de aparato reproductor, los
que nos pueden ayudar a diferenciar entre enfermedades parecidas.
Como ejemplo de algunos signos característicos de una enfermedad podemos
citar el elevado índice de retenciones placentarias en
brucelosis bovina, incremento en el número de servicios por
concepción (infertilidad) en Vibriosis. En ocasiones la
enfermedad que está causando abortos en las hembras causa
signos característicos en los machos, como es el caso de
vesiculitis y epididimitis causadas por Brucella.
Para el diagnóstico a nivel de laboratorio es
necesario recordar que el aborto puede deberse a causas que
afectan a la madre, a la placenta, al feto, o a una
combinación de ellos, por lo que las muestras que se
envíen al laboratorio deben incluir muestras de material
biológico materno (suero, moco cervical o vaginal, etc.),
placentario (cotiledones, líquido amniótico, etc.)
y fetal (líquido abomasal, pulmones, etc).
Entre los errores mas frecuentemente cometidos por el
clínico están el no dar importancia a la
obtención de muestras de la madre, así como la
obtención de material placentario a partir de la
porción de la placenta que queda colgando por la vulva que
a menudo está contaminada por materia
fecal.
Antes de enviar muestras al laboratorio es importante examinar
detalladamente al feto y la placenta. En el feto se deberá
determinar la edad aproximada, ya que varias enfermedades causan
abortos en periodos específicos de la gestación;
también se deberá determinar si el feto presenta
signos de haber muerto tiempo antes de ser abortado
(autólisis, pigmentación), se deberá revisar
al feto en busca de lesiones específicas. En el caso de
placentas se deberá hacer un descripción de su condición, si
están frescas, descompuestas, retenidas o
hemorrágicas. Se examinará tamaño y peso de
la placenta, tamaño de los cotiledones y otros factores
que puedan indicarnos si la placenta estaba teniendo una función
normal o alterada.
Por la naturaleza misma
del problema es posible que el aborto se detecte varias horas o
días después de su ocurrencia, por lo que el feto y
las placentas pueden encontrarse en un estado
avanzado de autólisis o putrefacción, siendo
inutilizables para el diagnóstico de laboratorio. Por
ésta razón es importante la utilización de
pruebas de
diagnóstico que se aplican a nivel del hato, no
necesariamente en los animales que han abortado, y que nos pueden
indicar la presencia de una enfermedad en el hato que
podría explicar los casos de aborto que se hayan
presentado; como ejemplo tenemos la prueba de anillo en leche para
brucelosis.
3. Enfermedades
abortivas causadas por diversas bacterias
Brucelosis
Producida por diversas especies de Brucella, son causadas por
Brucella abortus (bovinos), Brucella suis (cerdos), Brucella
melitensis (cabras), Brucella ovis (ovinos), Brucella canis
(caninos). Se caracteriza por aborto al final de la
gestación y cifras elevadas subsiguientes de
infertilidad.
Frecuencia
Ampliamente distribuida, posee importancia económica en
casi todo el mundo, sobre todo en ganado lechero. La frecuencia
vería considerablemente entre países, regiones y
hatos. El microorganismo puede transmitirse al hombre y
causar fiebre ondulante al consumir leche infectada o entrar en
contacto con animales contaminados. El microorganismo puede
aislarse de muchos órganos, además de ubres y
útero.
Etiología
Se han registrado infecciones por Brucella abortus en la mayor
parte de las especies, pero con frecuencia sólo se observa
en bovinos que pueden tener cualquier edad, pero la
infección solamente persiste en animales adultos desde el
punto de vista sexual.
Transmisión
Se observa la concentración más elevada de Brucella
abortus en el contenido de útero gestante, en feto y
membranas fetales, pudiendo ser consideradas éstas
estructuras
como las fuentes
más importantes de infección. la enfermedad se
transmite por ingestión, penetración de la
conjuntiva y piel indemne y contaminación de la ubre durante el
ordeño.
La ingestión de pastos u otros alimentos
contaminados con secreciones de animales enfermos es el método
más frecuente de propagación. En la mayoría
de los casos la
contaminación es directa y aunque la posibilidad de
infección por medio de moscas, perros, ratas,
garrapatas, calzado, trajes y otros objetos inanimados existe,
sin embargo no se considera de mayor importancia en lo que se
refiere a medias de control
Patogenia
Brucella abortus tiene predilección por el útero
grávido, ubres, testículos y glándulas
sexuales masculinas accesorias, ganglios linfáticos,
cápsulas articulares y bolsas. La sustancia denominada
erithritol producida por el feto y que estimula el crecimiento de
Brucella abortus, ocurre normalmente en concentraciones muy
elevadas en la placenta y líquidos fetales y quizá
dependa de ella que se localice la infección en
éstos tejidos. Al producirse la invasión del
útero grávido las lesiones se inician en la pared
del órgano, pero pronto es ocupada la luz del
útero, dando lugar a endometritis ulcerosa grave de los
espacios situados entre los cotiledones. Los líquidos
fetales y cotiledones placentarios son invadidos inmediatamente
después con destrucción subsecuente de las
vellosidades. El aborto suele producirse hacia los tres
últimos meses de la gestación, siendo el periodo de
incubación inversamente proporcional a la etapa de
desarrollo del feto en el momento de la
infección.
Manifestaciones CLÍNICAS
El aborto después del quinto mes de gestación
constituye el signo clínico cardinal de éste
padecimiento, se registran casos de 2 y 3 abortos en la misma
vaca, retención de placenta y metritis. Infecciones mixtas
pueden producir metritis que puede ser aguda con septicemia y
muerte consecutiva o crónica seguida de esterilidad.
En machos se observan orquitis y epididimitis, afección de
uno o ambos sacos escrotales con tumefacción aguda y
dolorosa. Los toros suelen ser estériles cuando la
orquitis es aguda pero pueden recuperarse si el testículo
dañado es uno solo.
Patología Clinica
Los análisis de laboratorio usados en el
diagnóstico de brucelosis incluyen el aislamiento del
microorganismo y pruebas en busca de la presencia de aglutininas
contra Brucella abortus en suero sanguíneo, leche, moco
vaginal, suero lácteo y plasma seminal.
El aislamiento del microorganismo por cultivo o
inoculación al cobayo se efectúa a partir del
abomaso o pulmones de fetos abortados o de placenta. Si esto no
es posible podemos obtener una muestra de
exudado uterino, ya que el microorganismo persiste en el tejido
días después del parto. Pueden observarse frotis
obtenidos de puntos de fijación de la placenta. Se dispone
de pruebas serológicas para la identificación de
aglutininas contra Brucella abortus en suero sanguíneo y
leche. Se recomienda la prueba de anillo en leche para detectar
vacas infectadas.
Hay criterios especificados para el uso de la prueba de
aglutinación en tubo, animales con titulo de anticuerpos
contra Brucella abortus < a 30 UI serán aceptados
mientras que aquellos superiores a 67 UI serán eliminados
y los animales ubicados entre éstos títulos se
declaran indecisos.
Pruebas complementarias
- En suero sanguíneo: aglutinación en
tubo (lenta), aglutinación en placa( rápida),
fijación de complemento, inactivación por
calor,
aglutinación en placa ácida, mercaptoetanol,
rivanol, bloqueo de anticuerpos, fijación en
superficie. - En leche: anillo, aglutinación en placa leche
completa, aglutinación suero en tubo, placa en suero,
fijación de complemento en suero. - Prueba de aglutinación en moco vaginal o
plasma seminal. - Cultivo de moco vaginal, semen, heces o producto del
feto abortado.
Preparación de los antígenos
Para la práctica de las diversas pruebas de
aglutinación y para la prueba de fijación del
complemento (FdC) se emplean preparaciones antigénicas en
forma de suspensiones de células
enteras elaboradas a partir de las cepas lisas 99 o 1119-3 de
Brucella abortus. Para las pruebas del anillo lácteo, de
rosa de bengala y pruebas de aglutinación en placa
tamponada se utilizan preparaciones similares, aunque
teñidas respectivamente con hematoxilina, rosa de bengala
o verde brillante/violeta cristal.
Para la producción de antígenos de
diagnóstico debe usarse la cepa 99 (Weybridge) o la cepa
1119-3 (United States Department of Agriculture, USDA) de B.
abortus. Las cepas deben ser completamente lisas y no
aglutinables ni en solución salina ni en acriflavina al
0,1% (p/v). Tienen que constituir cultivos puros y ajustarse a
las características típicas de las cepas
independientes de CO2 del biovar 1 de B. abortus. Para obtener un
conjunto de cultivos germinales de partida es preciso cultivar
las líneas germinales originales. El lote germinal
así obtenido deberá presentar todas las propiedades
características de estas cepas, y deberá
conservarse después por liofilización o
congelación a la temperatura del nitrógeno
líquido.
Para proceder a la elaboración del antígeno, debe
inocularse un cultivo germinal de las cepas 99 o 1119-3 de B.
abortus en una serie de agares inclinados de infusión de
patata, que después se incuban a 37°C durante 48
horas. El agar de suero-dextrosa, así como el agar
soja-tripticasa (al que puede añadirse
suero equino al 5% o extracto de levadura al 0,1%), constituyen
medios
sólidos satisfactorios, siempre y cuando se utilice un
cultivo germinal conforme a las instrucciones expuestas
más arriba. Tras comprobar la pureza del cultivo, se
resuspende éste en solución salina tamponada con
fosfato (PBS) estéril, pH 6.4, y se
siembran capas de agar de infusión de patata o agar de
dextrosa-glicerol en frascos de Roux. Después se dejan
éstas en incubación a 37°C durante 72 horas,
con la superficie inoculada vuelta hacia abajo. Tras comprobar la
pureza de los cultivos de los frascos, sometiendo una muestra de
cada uno de ellos a tinción Gram, se recogen los
organismos. Para ello se añaden a cada recipiente 50-60 ml
de solución salina fenolada (0,5% de fenol en
solución de cloruro sódico al 0,85%), se agitan
suavemente los frascos y se decanta la suspensión.
Después se mata a los organismos por calor,
manteniéndolos a 95°C durante 1 hora. Previa
comprobación de la ausencia de organismos viables, se
almacena el antígeno a 4°C.
Un sistema
alternativo de producción de antígeno consiste en
un cultivo celular, ya sea por lotes o continuo, en un
fermentador. Para este cultivo se utiliza un medio líquido
con la siguiente composición (por litro de agua
destilada): D-glucosa (30 g), una peptona de gran pureza (30 g),
extracto de levadura (Difco) (10 g), dihidrógenofosfato
sódico (9 g) e hidrógenofosfato bisódico
(3,3 g). El pH inicial es de 6.6, aunque tiende a aumentar hasta
7.2-7.4 durante el ciclo de crecimiento. Es necesario cerciorarse
de que los lotes de peptona y de extracto de levadura son capaces
de inducir un buen crecimiento, sin formación de
células anormales o disociadas. Durante la fase de
crecimiento se requiere ventilación y agitación
vigorosas, y puede ser necesario asimismo ajustar el pH por
adición de HCl 0,1 M estéril. El inóculo de
células germinales se elabora tal y como ha quedado
descrito más arriba. En el caso del cultivo por lotes,
éstos deben incubarse a 37°C durante 48 horas. Las
series de cultivo continuo pueden prolongarse durante periodos
mucho más largos, aunque su mantenimiento
exige una mayor habilidad técnica. El cultivo se recoge
por centrifugación con el fin de sedimentar los organismos
que, a continuación, serán resuspendidos en
solución salina fenolada y sometidos a una temperatura de
80°C durante 90 minutos (lo que causará su muerte).
Tras comprobar la ausencia de viabilidad del cultivo, se guarda
éste a 4°C. En el curso del proceso
deberán realizarse comprobaciones periódicas de los
cultivos, tanto en medio sólido como en medio
líquido, a fin de verificar su pureza, la presencia de un
número adecuado de organismos viables y la posibilidad de
disociación de las colonias a formas rugosas. Puede
determinarse el volumen del
concentrado celular de las suspensiones muertas mediante
centrifugación de volúmenes de 1 ml en tubos
Wintrobe, a 3.000 g durante 75 minutos.
El antígeno para la prueba de FdC (Weybridge) se
prepara a partir de un concentrado de organismos muertos de la
cepa 99 o 1119-3 de B. abortus, diluyendo dicho concentrado en
solución salina fenolada hasta alcanzar una
concentración del agregado celular del 2%. Se diluye luego
esta suspensión en solución salina fenolada, se
titula frente al antisuero estándar internacional contra
B. abortus (International Standard anti-B. abortus serum, ISABS)
o un suero estándar equivalente, y se ajusta la
concentración celular a fin de obtener la sensibilidad
adecuada. Tras incubación a 37°C durante 18 horas,
debería obtenerse una suspensión estable
blanco-grisácea sin agregación o depósitos
visibles. El antígeno utilizado en la Unión
Europea (UE) debe ser estandarizado frente al ISABS de tal
forma que produzca un 50% de fijación frente a una
dilución de 1/200 del suero estándar.
Es necesario que la dilución antigénica produzca
también una fijación completa a las diluciones
inferiores del suero, dado que una concentración de
antígeno demasiado débil (o demasiado fuerte) puede
no inducir un 100% de fijación a las diluciones inferiores
del suero. En el caso de que haya dos diluciones
antigénicas apropiadas, se elegirá la
suspensión en la que el antígeno esté
más concentrado, lo que evitará la aparición
de la prozona. Por lo general, y al término del proceso,
el antígeno se presenta en forma de concentrado, que antes
de su utilización deberá ser disuelto en diluyente
de FdC. El antígeno no debe ser congelado.
En la fase de recogida es preciso realizar comprobaciones de la
pureza y lisura de las células que van a utilizarse para
la preparación de los antígenos de las pruebas del
anillo lácteo, de rosa de bengala, de aglutinación
en placa tamponada, de aglutinación o de FdC. Una vez
muertas, estas células deben formar suspensiones estables
en solución salina fisiológica y no manifestar
indicios de autoaglutinación. Una vez muertas las
células, debe comprobarse también la ausencia de
viabilidad de la suspensión: tras 10 días de
incubación a 37°C, no deberá observarse signo
alguno de crecimiento.
a) Pruebas del antígeno tamponado de
Brucella
- Prueba de aglutinación en placa de rosa de
bengala
El antígeno para la prueba de aglutinación
en placa de rosa de bengala se prepara depositando células
muertas de la cepa 99 o 1119-3 de B. abortus por
centrifugación (por ejemplo, durante 10 minutos a 23.000 g
y 4°C), y resuspendiendo después las células de
manera homogénea en solución salina fenolada, a
razón de 1 g por 22,5 ml. (Nota: si durante la
preparación del concentrado celular se ha empleado
celulosa carboximetil sódica como agente de
sedimentación, será necesario eliminar los residuos
insolubles antes de proceder a la tinción. Para ello se
filtrará la suspensión con un pre-filtro AMF-CUNO
Zeta-plus [tipo CPR 01A].) Por cada 35 ml de esta
suspensión se añade 1 ml de rosa de bengala (Cl.
No. 45440) al 1% (p/v) en agua destilada. Se deja la mezcla en
agitación a temperatura ambiente
durante 2 horas, y a continuación se filtra a
través de un algodón. Hecho esto, se centrifuga
para depositar las células teñidas, que
después se resuspenden de modo homogéneo a
razón de 1g de células por 7 ml de diluyente (21,1
g de hidróxido sódico disueltos en 353 ml de
solución salina fenolada, más 95 ml de ácido
láctico y ajustado a un total de 1.056 ml con
solución salina fenolada). Esta suspensión debe ser
de un color rosa
intenso, y el sobrenadante de una muestra centrifugada
debería quedar exento de coloración; el pH debe ser
de 3.65±0,05. Después de la filtración a
través del algodón, se filtra dos veces más
la suspensión a través de un prefiltro de fibra de
vidrio Sartorius
No. 13430. A continuación se ajusta el volumen del
concentrado celular a un 8%, a falta de proceder a la
estandarización final frente a sueros estándar. Se
guarda la suspensión a 4°C en la oscuridad. Nunca debe
congelarse el antígeno.
Cuando se procede con arreglo al protocolo
estándar, el antígeno de la prueba de
aglutinación en placa de rosa de bengala debe producir una
reacción claramente positiva frente a diluciones 1/45 y
1/47,5 del ISABS (en solución salina), pero no a
diluciones de 1/55. También debe ofrecer, ante un
determinado panel de sueros, una pauta de reacciones positivas y
negativas semejante a la que induce un lote previamente
estandarizado.
Protocolo
La prueba de aglutinación en placa o en tarjeta de rosa de
bengala constituye un procedimiento
adecuado para la realización de cribas (screening) de las
muestras de suero. Para la realización de esta prueba se
mezcla el suero (0,03 ml) con un volumen igual de antígeno
sobre una placa de esmalte o de porcelana blanca. Cada
reacción debe ocupar aproximadamente un diámetro de
2 cm. Se agita suavemente la mezcla durante 4 minutos a
temperatura ambiente, y después se examina para detectar
en ella la presencia de aglutinación (1). Toda
reacción visible a simple vista será considerada
positiva. Esta prueba es muy sensible, en especial sobre animales
vacunados, y deberán confirmarse las muestras positivas
mediante la prueba de FdC o una técnica de
detección específica de IgG-1. Se producen falsos
negativos, que pueden ser detectados mediante nuevos
exámenes del animal a intervalos mínimos de 3
meses.
- Prueba de aglutinación en placa de Brucella
tamponado
El antígeno para la realización de esta
prueba se prepara a partir de la cepa 1119-3 de B. abortus
según el protocolo descrito por Angus y Barton (2).
Se necesitan dos soluciones de
tinción: una solución de tinción
biológica certificada de verde brillante en agua destilada
(2 g/100 ml) y una solución de tinción
biológica certificada de violeta cristal en agua destilada
(1 g/100 ml). Una vez preparadas, se guardan ambas soluciones por
separado durante un periodo de 24 horas, transcurrido el cual se
mezclan a volúmenes iguales en un frasco oscuro y se
guardan en la nevera, durante un periodo no inferior a 6 meses,
antes de su utilización. Puede usarse la mezcla de
tinción entre los 6 y los 12 meses posteriores a su
preparación. Transcurrido este tiempo deberá
desecharse la mezcla.
El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente 150 g de
NaOH en 3-4 litros de solución salina fenolada
estéril. Se añade ácido láctico (675
ml) a esta solución, y se ajusta el volumen final a 6
litros con solución salina fenolada estéril. El pH
de la solución deberá ser de 3.63-3.67.
Se diluye el agregado celular de B. abortus en solución
salina fenolada hasta una concentración de 250 g/litro. Se
añaden 6 ml de tinción por litro de
suspensión celular, y se agita vigorosamente la mezcla
antes de filtrarla a través de algodón absorbente
estéril. Se hacen sedimentar las células en una
centrífuga refrigerada, y después se resuspende el
agregado celular en diluyente tamponado (descrito más
arriba) hasta una concentración de 50 g/100 ml. Se deja
esta mezcla en agitación durante 2 horas, y después
se diluye todavía más por adición de 300 ml
de diluyente tamponado por cada 100 ml de suspensión
celular (esto es, hasta una concentración final de 50 g de
concentrado celular/400 ml de diluyente tamponado). Se remueve la
mezcla a temperatura ambiente durante 20-24 horas, antes de
ajustar la concentración celular a un 11% (p/v) en
diluyente tamponado. Antes de la realización de la prueba
es preciso remover esta suspensión durante toda la noche.
A falta de las pruebas finales de control de
calidad, se embotella el antígeno, se marca en la
etiqueta una fecha de caducidad de 1 año y se guarda a
4°C hasta el momento de su utilización. No debe
congelarse la preparación.
El pH del antígeno tamponado debe ser de
3.7±0.03, y el pH de una mezcla suero/antígeno de
razón 8:3 debe ser de 4.02±0.04. La
suspensión al 11% de células teñidas debe
tener un color verdeazulado. Debe verificarse cada lote de
antígeno, sometiendo a prueba un mínimo de 10
sueros débilmente reactivos y comparando los resultados
con los que deparan uno o más lotes anteriores de
antígeno. Si es posible, los lotes de antígeno
deberán compararse con el antígeno estándar
preparado por el NSVL del USDA.
Protocolo
Para una primera criba (screening) de las muestras de suero,
éstas pueden ser sometidas también a la prueba de
aglutinación en placa tamponada. Se mezcla el suero (0,08
ml) con un volumen de 0,03 ml de antígeno sobre una placa
de vidrio dividida en cuadrados de 4 cm de lado. Tras la mezcla
inicial, se somete la placa a un movimiento
basculante repetido tres veces, a fin de garantizar una
dispersión uniforme de los reactivos. Después se
incuba la placa en una cámara húmeda a temperatura
ambiente (20-25°C) durante 4 minutos. Se retira la placa y se
repiten los movimientos descritos anteriormente, después
de lo cual se devuelve la placa a la cámara para una
segunda incubación de 4 minutos. En este punto debe ser
retirada, removida de nuevo y examinada en busca de indicios de
aglutinación (1). Toda reacción visible a simple
vista será considerada positiva. Al igual que la prueba de
aglutinación en placa de rosa de bengala, esta prueba es
muy sensible, especialmente en el caso de animales vacunados. Las
muestras positivas deben ser verificadas mediante la prueba de
FdC o una técnica de detección específica de
IgG-1. Se producen falsos negativos, que pueden ser detectados
mediante el examen de nuevas muestras del animal extraídas
a intervalos mínimos de 3 meses.
b) Prueba de fijación del complejo
La prueba de FdC es el método más extendido para
una confirmación del diagnóstico. Existen numerosas
variantes de la misma pero, con independencia
de la que se elija, deberá usarse en la prueba un
antígeno preparado a partir de una cepa lisa autorizada de
B. abortus, como la cepa 99 o la 1119-3. El antígeno,
además, deberá ser estandarizado frente al segundo
ISABS. Es posible preparar el antígeno para la prueba de
FdC mediante procedimientos
especiales (1, 12), pero también cabe servirse del
antígeno empleado para la prueba de aglutinación
típica, previa dilución 1/200 (en solución
tampón FdC) de la suspensión stock del mismo antes
de su estandarización. Antes de su estandarización
frente al segundo ISABS (descrita más adelante), el
volumen del agregado celular de la suspensión
antigénica concentrada para la prueba de FdC debe ser de
aproximadamente un 2%. La concentración de fenol no debe
exceder el 0,5%. La apariencia del antígeno, una vez
llevado a una dilución 1/10 en solución salina
fenolada, debe ser el de una suspensión blanca, densa y
uniforme, sin agregación o depósito visibles tras
una incubación a 37°C durante 18 horas. A la
dilución de trabajo utilizada en la prueba no debe
producir efectos anticomplementarios. El antígeno no debe
ser congelado.
El método de microtitulación constituye un
procedimiento adecuado para la realización de esta prueba.
Todas las diluciones se realizan en solución tampón
preparada a partir de una solución stock de: cloruro de
sodio (42,5 g), ácido barbitúrico (2,875 g),
dietilbarbiturato de sodio (1,875 g), sulfato de magnesio (1,018
g) y cloruro de calcio (1,147 g) en un litro de agua destilada.
Esta solución debe ser diluida antes de su empleo, por
adición de cuatro volúmenes de una solución
de gelatina al 0,04% (el conjunto constituye el tampón
FdC). El sistema revelador es una suspensión de
hematíes frescos de oveja al 3%, sensibilizados con un
volumen igual de suero de conejo antihematíes de oveja
diluido hasta el punto en que contenga el quíntuple de la
concentración mínima necesaria para producir un
100% de hemólisis en presencia de una dilución 1/30
de complemento fresco de cobaya. Este último debe ser
titulado de manera independiente para determinar la
concentración mínima necesaria para producir un
100% de lisis en una suspensión de hematíes de
oveja sensibilizados; esta concentración quedará
definida como la unidad de complemento. El antígeno
estándar de B. abortus para la prueba de
aglutinación será diluido en un tampón FdC
hasta una concentración tal que arroje un 50% de
fijación de complemento (1,25 unidades) ante una
dilución 1/200 del segundo ISABS (que puede solicitarse al
Laboratorio de Referencia de la OIE para la brucelosis2). Se
diluyen los sueros problema en volúmenes iguales de
tampón FdC, después de lo cual serán
inactivados por calentamiento a 58°C durante 50
minutos.
Protocolo
- Utilizando placas de microtitulación de 96
pocillos clásicas, se depositan volúmenes de 25
µl de suero problema diluido en los pocillos de la
primera y segunda hileras. Además, se depositan unidades
de 25 µl de tampón de FdC en todos los pocillos
salvo los de la primera hilera. - Se practican entonces diluciones seriadas de
razón 2, transfiriendo volúmenes de 25 µl
de suero de la segunda hilera en adelante. - Se añaden a cada pocillo 25 µl de
antígeno diluido a la dilución de trabajo,
así como 25 µl de complemento con un contenido de
1,25 unidades. Se preparan los pocillos control, que
deberán alojar: sólo diluyente; suero +
complemento + diluyente; antígeno + complemento +
diluyente; y complemento + diluyente. Cada uno de ellos
deberá contener un volumen total de 75
µl - Se incuban las placas a 37°C durante 30 minutos,
con agitación durante los 10 primeros minutos, o bien a
4°C durante toda la noche. - Se añaden a cada pocillo volúmenes de
25 µl de hematíes de oveja sensibilizados, y se
incuban de nuevo las placas a 37°C durante 30 minutos, con
agitación ocasional en el curso de los primeros 10
minutos. - Tras dejar reposar las placas a 4°C durante 2-3
horas, a fin de posibilitar la sedimentación de las
células no lisadas, se procede a la lectura
de los resultados.
Se compara el grado de hemólisis con los
estándares correspondientes a un 0, 25, 50, 75 y 100% de
lisis celular. Los resultados deben expresarse siempre en
Unidades Internacionales de FdC (UI de FdC), calculadas en
relación a las que se han obtenido en una
titulación paralela con un suero estándar calibrado
frente al ISABS. Por lo general, se considerarán positivos
los sueros que induzcan fijación completa a un
título equivalente o superior a 20 UI de FdC/ml. En las
pruebas realizadas sobre animales vacunados pueden aparecer
falsas reacciones positivas. Las hembras vacunadas con vacunas de la
cepa 19 a la edad de entre 3 y 6 meses serán consideradas
positivas si los sueros producen reacción de
fijación positiva a un título de 30 UI de FdC/ml,
siempre y cuando los animales tengan por lo menos 18 meses de
edad en el momento de ser sometidos a prueba. También
pueden darse falsos positivos en animales infectados por
organismos antigénicamente afines a Brucella. Estos suelen
causar muchos menos problemas en
la prueba de FdC que en las pruebas de aglutinación
descritas en (a).
c) ELISA indirecto
Se han descrito numerosas variantes de esta técnica ELISA
indirecta. El mercado ofrece la
posibilidad de adquirir diversos ensayos
comerciales, pero sólo se recomienda el uso de aquellas
pruebas ELISA que utilizan lipopolisacárido (LPS) liso de
B. abortus. El espectro de isotipos y subclases de
inmunoglobulina bovina detectables por ELISA depende de la
especificidad del conjugado anti-inmunoglobulina (o anticuerpo
secundario) que se emplee en la prueba. Un ELISA indirecto
específico para la detección de anticuerpos contra
la IgG1 da resultados que equivalen casi exactamente a los de la
prueba de FdC. Esta prueba puede ser utilizada para el estudio de
muestras tanto de leche como de suero. La utilización de
conjugados específicos tanto para la cadena pesada como
para la ligera de la molécula de inmunoglobulina
proporciona una sensibilidad de diagnóstico en cierta
medida mayor que la prueba de FdC, aunque entraña una
cierta pérdida de la especificidad de diagnóstico.
Al igual que las demás pruebas convencionales empleadas
para el estudio serológico de la brucelosis bovina, el
ELISA indirecto no permite distinguir entre anticuerpos
resultantes de una infección y anticuerpos inducidos por
vacunación con la cepa 19.
Las técnicas
ELISA pueden ser usadas como pruebas de criba (screening) o como
pruebas de confirmación. No obstante, la eficacia de ELISA
en términos de sensibilidad y especificidad de
diagnóstico dependerá de la especificidad a la
inmunoglobulina que posea el conjugado (véase más
arriba), así como del factor de dilución elegido
para las muestras problema. El empleo de conjugados de
especificidad de amplio espectro, así como el de
diluciones bajas, redundará en una prueba de criba de
elevada sensibilidad de diagnóstico. Por el contrario, los
conjugados de especificidad de espectro reducido (p.e.
anti-IgG1), y las diluciones altas del suero problema,
resultarán en una prueba de confirmación de
especificidad de diagnóstico elevada.
La prueba se lleva a cabo en miniplacas de poliestireno
de 96 pocillos de fondo plano. La elección de la miniplaca
tendrá un ligero efecto sobre la eficacia de la prueba, en
términos de la actividad de fondo a la que dará
lugar. Cuando se utiliza el antígeno LPS, las miniplacas
de adherencia proteica entre débil y media proporcionan el
nivel más bajo de ruido de
fondo.
La solución tampón para el tapizado
antigénico es carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9.6,
compuesta por: NaHCO3 (2,93 g), Na2CO3 (1,59 g) y NaN3 (0,2 g) en
1 litro de agua destilada o desionizada. El tampón
diluyente del conjugado y de los sueros problema es PBS 0,01 M,
pH 7.2 + Tween 20 al 0,05% (v/v), que se compone de: Na2HPO4
(1,21 g), KH2PO4 (0,20 g), NaCl (8,00 g) y KCl (0,20 g) en 1
litro de agua destilada o desionizada + 0,5 ml de Tween 20 por
litro. La solución tampón de lavado es PBS 0,002 M,
pH 7.4, + Tween 20 al 0,05%.
El conjugado empleado debe contener un anticuerpo policlonal
específico tanto de la cadena pesada como de la ligera de
la IgG1 bovina, marcado con peroxidasa de rábano. El
sistema de substrato es H2O2 4,4 mM y ABTS 3,6 mM (ácido
2,2'-Azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico]) en
tampón fosfato/citrato 0,05 M, pH 4.5, cuya
composición es: Na2HPO4 0,2 M (25,7 ml), ácido
cítrico 0,1 M (24,3 ml) y agua destilada/desionizada (50
ml) (ajústese el pH en caso necesario). La solución
de parada de la reacción enzimática consiste en
dodecilsulfato de sodio al 4% o NaN3 0,1 M en agua
destilada/desionizada.
Preparación del antígeno
Puede extraerse LPS liso, mediante el método de agua
caliente/fenol caliente, a partir de células de B. abortus
muertas por calor. Brucella difiere de la mayoría de las
demás bacterias Gram
negativas en que, tras la extracción, su LPS queda
retenido en la fase de fenol en lugar de la fase
hídrica.
Para la extracción se suspenden, en 170 ml de agua
destilada, ya sea 5 g de células liofilizadas o bien 50 g
de concentrado celular húmedo de la cepa 99 de B. abortus.
Se calienta esta suspensión a 66°C. Se añade un
volumen igual de fenol al 90% (p/v) en agua destilada,
también llevado a 66°C, y se remueve la
solución de manera continua durante 20 minutos.
Transcurrido este tiempo, se enfría la mezcla a 4°C y
se centrifuga durante 20 minutos a 12.000 g y 4°C. Se deja
reposar el sobrenadante (que contiene el LPS) en un embudo
separador, a temperatura ambiente durante 24 horas. Se recupera y
filtra (Whatman #3) la fase de fenol (capa inferior), y se
añaden tres volúmenes de metanol (con metanol al 1%
saturado con acetato de sodio). Se deja precipitar la
solución a 4°C durante 2 horas. A continuación
se resuspende el precipitado en el volumen mínimo
necesario de agua destilada, y se centrifuga a 6.000 g durante 20
minutos. Se resuspende el sedimento en 80 ml de agua destilada y
se remueve a 4°C durante toda la noche.
A continuación se centrifuga la solución durante 15
minutos a 10.000 g y 4°C, y se decanta el sobrenadante. Se
añaden de nuevo 80 ml de agua destilada al sedimento, se
remueve durante 1 hora y se centrifuga de nuevo como se ha
descrito anteriormente. Se reúnen los sobrenadantes, se
filtran (filtro de membrana de 0,3 µm) y se añaden
ribonucleasa, desoxirribonucleasa y proteinasa K, a razón
de 50-100 µg de cada una. Se incuba la mezcla a 20°C
durante 18 horas, después de lo cual se precipita de nuevo
con metanol y se resuspende del mismo modo que se ha hecho
anteriormente. Se dializa la suspensión frente a agua
destilada hasta que quede libre de fenol (lo que se comprueba
añadiendo cloruro férrico al agua destilada y
esperando a que no aparezca el habitual color morado). El
antígeno resultante se liofiliza en volúmenes tales
que contengan cantidades de 1 mg de LPS.
Protocolo
- Se diluye el antígeno LPS en tampón de
tapizado hasta una concentración establecida mediante
titulación cruzada, por lo general de cerca de 1
µg/ml, y se depositan volúmenes de 100 µl de
esta solución en todos los pocillos. Se dejan
después las miniplacas en incubación, ya sea a
37°C durante 2 horas o a 4°C durante toda la noche.
Dado que se trata de la técnica ELISA en fase
sólida, será necesario lavar las miniplacas entre
cada uno de los pasos de la prueba, a fin de eliminar el exceso
de reactivos que no se hayan fijado o no hayan reaccionado. De
tres a cuatro ciclos de lavado con tampón de lavado son
suficientes. Antes de la adición del siguiente reactivo,
las placas deberán ser volteadas y golpeadas sobre una
superficie absorbente, no filamentosa, con objeto de eliminar
todo posible residuo. - Se llevan los sueros problema y los controles a una
dilución de 1/200 en tampón diluyente y se
aplican volúmenes de 100 µl de estas soluciones en
los pocillos oportunos. Se cubren o sellan las placas y se
colocan en un agitador rotatorio. Se incuban a 37°C durante
1 hora en agitación constante. Se lavan las placas como
se ha descrito anteriormente. - Se diluye el conjugado enzimático en
tampón diluyente y se añaden volúmenes de
100 µl del mismo a todos los pocillos. Se cubren o sellan
las placas y se colocan en un agitador de placas rotatorio. Se
incuban a 37°C durante 1 hora en agitación
constante. La dilución óptima de conjugado debe
ser aquella que, al reaccionar con el control fuertemente
positivo en condiciones estándar, arroje una absorbancia
comprendida entre 1,0 y 1,4 unidades de absorbancia
(véase el paso vi). Siempre que sea posible
deberá usarse el ISABS. Se lavan las placas como se ha
descrito anteriormente. - Se prepara una solución fresca de
substrato-cromógeno, añadiendo 60 µl de una
solución stock de H2O2 (al 3%) a 12 ml de tampón
fosfato/citrato más ABTS 3,6 mM. Se colocan 100 µl
de la solución substrato-cromógeno en cada
pocillo. Se transfieren después las placas a un agitador
de placas rotatorio y se incuban a 37°C durante exactamente
15 minutos en agitación constante. Tras la
incubación de 15 minutos se añaden 100 µl
de solución de parada a todos los pocillos, y se agitan
brevemente las placas sobre el agitador a fin de garantizar una
mezcla completa. Todos los pocillos contienen ahora un volumen
total de 200 µl. - Se lee la subsiguiente coloración con un
fotómetro de miniplacas, utilizando un filtro de
interferencia de 405 ó 414 nm. - Los datos pueden
ser expresados de formas diversas, pero se recomienda expresar
la reactividad del suero problema en forma de porcentaje de
positividad con respecto a un suero control fuertemente
positivo estandarizado (19).
Los sueros control fuertemente positivos deben
prepararse de tal manera que, prediluidos en suero negativo,
exhiban una actividad de anticuerpos que caiga en el fragmento
lineal de la curva dosis/respuesta correspondiente al suero
original no diluido, justo debajo de la porción en meseta
de dicha curva. Hoy en día se está trabajando en la
preparación de un suero estándar primario elaborado
según este criterio, con vistas a su utilización
internacional para el calibrado de pruebas de ELISA indirecto.
Dicho suero debería estar disponible en breve plazo.
Utilizando este protocolo de ELISA indirecto en condiciones de
laboratorio óptimas, el valor umbral
(o punto final) que discrimina entre resultados positivos y
negativos debe situarse entre un 10 y un 15% de positividad.
Dentro de este intervalo, la sensibilidad de diagnóstico
debería ser igual o superior a la que ofrece la
técnica del antígeno tamponado de Brucella en las
pruebas realizadas sobre ganado infectado, y la especificidad de
diagnóstico debería ser equivalente a la que
proporciona el método de FdC en pruebas realizadas sobre
ganado no vacunado. Cabe suponer que la especificidad de
diagnóstico en el examen de grupos vacunados
es en cierta medida inferior a la que ofrece la FdC.
A falta de agua de calidad
óptima, o si se modifica cualquiera de los
parámetros de la prueba, puede ser necesario elevar el
valor umbral para obtener la adecuada eficacia de
diagnóstico.
Diagnostico
- Asegurar le edad del feto mediante inspección
y registro de
crías. - Tomar muestras de sangre para
pruebas serológicas con relación a Vibriosis,
listeriosis y Leptospirosis. - Examinar líquidos uterinos y contenido de
abomaso fetal a la primera oportunidad en busca de tricomonas,
y subsiguientemente por métodos
de cultivo para identificar brucelas, vibriones, Trichomona,
listeria y hongos. - Completar pruebas mediante cultivos de los pulmones
fetales para leptospira y placenta o líquido uterino en
busca de bacterias y hongos especialmente si no se dispone de
feto. - Examinar placenta fijada para formular en su caso
diagnóstico de placentitis. - En fetos abortados se observan petequias
múltiples características en piel, conjuntiva y
mucosas, hipertrofia de ganglios linfáticos y
afección nodular del hígado.
Control
Se basa en la higiene,
vacunación, prueba y eliminación de reactores.
Medidas higiénicas como el aislamiento o
eliminación de animales infectados, destrucción de
placentas, secreciones uterinas y fetos abortados,
desinfección de zonas contaminadas.
Prevención: administración de la vacuna contra la
brucelosis cepa 19 o RB51.
4. Campylobacteriosis
genital bovina
Aislado por primera vez en 1913 a partir de abortones de
vaca y de oveja, el Campylobacter fetus, fue durante mucho tiempo
considerado como un agente simple de los abortos en al ganado
vacuno. La aplicación de la inseminación artificial
y el tratamiento de los toros han contribuido considerablemente a
la reducción de ésta afección. Sin embargo,
ésta enfermedad es hoy una causa importante de aborto en
la oveja. La Vibriosis presenta todos los caracteres de una
enfermedad venérea. Es de naturaleza enzoótica y
hace su aparición generalmente después del
acoplamiento con un macho infectado; la inseminación
artificial a partir de un semen contaminado puede contribuir a la
diseminación de la enfermedad. E toro constituye un
verdadero reservorio natural de Campylobacter fetus, ya que su
presencia no produce ningún signo de enfermedad. Las
hembras afectadas se inmunizan espontáneamente
después de algunos meses, y su poder
reproductor vuelve a ser normal. Recientemente se han realizado
ensayos con el fin de proteger hembras por medio de
vacunación.
Agente Etiológico
Campylobacter fetus, es un bacilo curvo microaerofílico,
sin agrupación definida, Gram negativos, con movimiento
característico en espiral que se observa en
microscopía de campo oscuro o contraste de fases.
Difícil de observar en frotis teñidos a campo
claro, generalmente móviles, acapsulados y no
esporulados.
En el plano patológico pueden considerarse dos variedades
de Campylobacter fetus. El Campylobacter fetus serotipo
venerealis, el más frecuentemente encontrado; y el
Campylobacter fetus serotipo hyointestinalis responsable de
abortos esporádicos en bovinos, ovinos y cerdos.
Campylobacter fetus ya sea del tipo venerealis o hyointestinalis
producen formas alargadas en los cultivos, sobre medios de verde
brillante. Las dos subespecies son catalasa +, Campylobacter
fetus ss. venerealis es H2S(-), mientras que el
Campylobacter fetus hyointestinalis es H2S
condicionado, es decir, que solo dará lugar al
desprendimiento de H2S cuando el medio sea adicionado
de cistina.
Epidemiologia
Los bóvidos son naturalmente receptivos, pero ésta
receptividad varía según el sexo, la edad
e incluso según los individuos; las hembras inmaduras
resisten generalmente a los intentos de transmisión. En el
toro, el Campylobacter fetus vive de forma saprofita en la
superficie de la mucosa prepucial, los toros jóvenes son
más resistentes a la infección. En la vaca, el
Campylobacter fetus presenta un tropismo particular para el
aparato genital y especialmente para el útero
grávido, en el cual se desarrolla con preferencia a nivel
del espacio útero-corial. Es interesante señalar
que ciertas cepas semejantes al Campylobacter fetus son fuente de
infección para la especie humana y que los trastornos
observados consisten en diarreas y abortos.
Vias De Infección
Enfermedad esencialmente venérea, la Vibriosis se
transmite del toro a la vaca y recíprocamente con
ocasión del coito, pudiendo también transmitirse
por medio de la inseminación artificial, cuando se usa un
semen contaminado. La transmisión toro a toro puede
llevarse a cabo en caso de recogidas sucesivas cuando no se toma
la precaución de reservar una vagina artificial para cada
toro. La transmisión por contacto entre animales sanos y
animales infectados es negada por diversos autores, en
éste caso la contaminación se produciría
durante el celo y como consecuencia de un posible contacto entre
los órganos genitales externos de una hembra infectada y
la de una no infectada. Ciertas cepas de Campylobacter pueden
provocar una infección ocasional del ganado vacuno por
otra vía distinta a la venérea; frecuentemente
ésta infección se acompaña de aborto y no de
infertilidad. Sin embargo un toro puesto en contacto de una cama
previamente contaminada por un toro infectado, tiene un 50% de
probabilidades de albergar el microorganismo y propagarlo 1 a 2
meses más tarde.
Localización
En al macho el Campylobacter fetus se localiza a nivel de la
mucosa prepucial. En la hembra se encuentra en los distintos
segmentos del aparato genital: vagina, cuello y útero.
Este alcanza los cuernos uterinos de 12 a 14 días
después de la infección y en un 25% de los casos,
llega hasta los oviductos. La infección regresa
después de 40-60 días para localizarse en el
segmento vaginocervical; las secreciones vaginales permanecen
virulentas durante 2-4 meses. Sin embargo se puede encontrar
Campylobacter fetus en la vagina de vacas gestantes. El
microorganismo se encuentra en el feto (líquido abomasal,
riñón, hígado), en membranas y
líquidos fetales y en los flujos uterovaginales
después del aborto.
Patogenia Y Lesiones
Después de una infección provocada por el coito o
la inseminación, la mucosa vaginal presenta una
inflamación con destilación de exudados, en los que se
puede demostrar la presencia de Campylobacter fetus durante los
primeros 9 días. El Campylobacter fetus puede comprometer
la fertilización y la implantación y ser origen de
una mortalidad embrionaria. Las primeras modificaciones
histológicas del endometrio son observadas 16-21
días después de una infección
experimental.
En el útero grávido el Campylobacter fetus se ubica
sobre los cotiledones que se vuelven hemorrágicos y se
cubren de placas blanquecinas, grisáceas o amarillentas;
la base se engruesa por la presencia de un exudado viscoso, gris
amarillento, mientras que los espacios intercotiledonarios
están edematosos y recubiertos de depósitos
granulosos y grisáceos. El feto no presenta necesariamente
lesiones particulares; sin embargo en ciertos casos puede
encontrarse un edema gelatinoso subcutáneo y un exudado
fibrinohemorrágico más o menos abundante a nivel de
las cavidades pleural y pericárdica. En éstas
condiciones el hígado puede hipertrofiarse y contener
islotes necróticos.
Sintomatología
La repetición de celos y la irregularidad estral en las
hembras cubiertas constituyen un claro exponente para sospechar
que el macho está infectado. Los dos síntomas
dominantes en la infección en la hembra son la
infertilidad y los abortos. Los ciclos estrales se repiten con
tendencia a la irregularidad o a alargarse; se pueden observar al
mismo tiempo síntomas de vaginitis y cervicitis, y
también ciertas descargas purulentas.
Después de un periodo de tres a cuatro meses se establece
un estado de inmunidad que influirá sobre la posible
evolución de la enfermedad en el hato; la
fertilidad tiende a volver a la normalidad y los individuos
adultos se reestablecen en primer lugar.
El aborto vibriónico sobreviene no importa en qué
momento de la gestación, lo más corriente hacia el
quinto mes, pero la cantidad de abortos son generalmente escasos,
la infección por Campylobacter fetus hyointestinalis se
exterioriza generalmente por abortos esporádicos; la
fertilidad en éste caso puede ser normal. En caso de
aborto precoz el feto puede ser expulsado con todas sus
envolturas, mientras que la retención placentaria es
frecuente si el accidente se sitúa en las proximidades del
final del parto ; frecuentemente ésta es origen de una
infección uterina secundaria, nueva causa de
infecundidad.
Inmunidad
La curación espontánea del ganado, 3-6 meses
después de haber comenzada la infección es
considerada como la resultante de una inmunidad adquirida, pero
de la cual se desconoce el tiempo de persistencia. Los estudios
experimentales realizados han demostrado la presencia de
anticuerpos en moco cervical y suero sanguíneo, estando en
función de la vía utilizada para obtener la
inmunización y el tipo de antígeno empleado. Sin,
embargo existe una relación directa entre la intensidad de
la actividad uterina y la presencia de anticuerpos en el moco
uterino.
Diagnostico
Los síntomas clínicos conducen solamente a una
sospecha de la enfermedad; la prueba real de la existencia de
ésta depende del laboratorio, y se basa en poner en
evidencia, bien el agente infeccioso o bien los anticuerpos que
éste ha producido.
Identificación del agente
La campilobacteriosis se diagnostica bacteriológicamene,
ya sea por aislamiento de Campylobacter fetus en cultivo o por
inmunofluorescencia. El cultivo bacteriológico puede
realizarse bien directamente a partir de muestras o bien
después del transporte y/o
enriquecimiento de las mismas. En caso de que el procesado de las
muestras en laboratorio vaya a realizarse en un plazo superior a
las 6 horas desde la recogida de las mismas, será
indispensable mantenerlas en un medio especial de transporte. Si
no se utiliza dicho medio de transporte, las muestras deben ser
remitidas al laboratorio en un recipiente opaco y aislado
térmicamente (a una temperatura de entre 4 y
30°C).
- Toma de muestras
En el macho:
Moco o secreciones prepuciales; semen.
El moco prepucial o el esmegma pueden ser obtenidos por raspado
(24), succión (con una pipeta de Bartlett) (1) o lavado
prepucial (6). También puede obtenerse el esmegma de la
vagina artificial, tras recoger el semen mediante el lavado de
dicha vagina con 20-30 ml de solución salina tamponada con
fosfato (PBS). Para realizar el lavado prepucial se introducen
20-30 ml de PBS estéril, pH 7.2, en la bolsa prepucial.
Tras practicar sobre ésta un masaje vigoroso durante 15-20
segundos, se recoge el líquido de lavado en un frasco
estéril, que inmediatamente se sella y envía al
laboratorio.
El semen debe ser recogido en las condiciones de mayor asepsia
posible. Para proceder a su recogida se utiliza un tubo
estéril, que se sella inmediatamente después. Las
muestras de esmegma obtenidas por raspado o succión,
así como las muestras de semen, pueden ser diluidas en PBS
o sembradas directamente en un medio de cultivo o un medio de
enriquecimiento (medios de enriquecimiento y transporte [MET],
medio de Stuart o medio SBL). Se sellan las placas que contienen
el medio de transporte y se envían al laboratorio de
análisis en un recipiente termoaislante (a 4-18°C) y
opaco (9).
En la hembra:
Moco vaginal y cervicovaginal.
La toma de muestras puede realizarse con una torunda, o bien por
succión (con una pipeta de Bartlett) o lavado de la
cavidad vaginal. Para obtener muestras de buena calidad es
indispensable utilizar un espéculo estéril,
preferiblemente desechable (25).
Previa limpieza de la región vulval, se realiza un lavado
de la cavidad vaginal introduciendo 20-30 ml de PBS
estéril con una jeringa unida a un catéter
estéril. Se succiona y reintroduce el líquido
cuatro o cinco veces antes de recogerlo definitivamente en un
frasco estéril, que inmediatamente después
será sellado y remitido al laboratorio. También
puede recogerse el líquido de lavado vaginal mediante un
tampón de gasa estéril mantenido en el interior de
la vagina durante 5-10 minutos después de la introducción de PBS. Las muestras de moco
vaginal obtenidas por succión deben ser diluidas en PBS o
sembradas directamente en un medio de cultivo o
enriquecimiento.
Fetos abortados, placentas
En caso de aborto, las muestras más adecuadas son,
además de la placenta, el contenido estomacal, el
hígado y los pulmones del feto. La recogida de muestras
deberá realizarse en las condiciones de mayor asepsia
posible. Las muestras serán remitidas al laboratorio en un
recipiente refrigerado y termoaislado (a 4-8°C).
Procesado de las muestras
A su llegada al laboratorio, las muestras serán sembradas
directamente en medio de cultivo o, en caso necesario, sometidas
a un tratamiento adicional.
- Muestras del tracto genital
Dado que el moco vaginal puede ser muy viscoso, es
posible que se precise su licuefacción. Para ello se
añade un volumen igual de una solución de
cisteína (solución acuosa de hidrocloruro de
cisteína a una concentración de 0,25 g/100 ml, pH
7.2, esterilizada por filtración a través de una
membrana). Transcurridos 15-20 minutos, puede sembrarse el moco
diluido y licuado en medio de aislamiento. Cuando el moco no es
muy viscoso, es posible sembrarlo directamente o bien disuelto en
un volumen igual de PBS, pH 7.2.
- Fetos abortados, placentas
El contenido del estómago fetal se siembra
directamente sobre un medio de cultivo adecuado. Los
órganos y trozos de órganos internos se esterilizan
a la llama y seguidamente se homogenizan, hecho lo cual se
siembra el homogenado en el medio de cultivo.Tras el lavado de
las membranas placentales con solución salina normal o PBS
a fin de eliminar la mayor parte de la contaminación de
superficie, se raspan las vellosidades coriónicas y se
transfiere el raspado a medios de cultivo.
- Medios de enriquecimiento y transporte (MET)
Existen varios MET disponibles, como el de Clark (Australia),
el de Lander (Reino Unido), el medio SBL (Francia) y
los medios de Foley y Clark (utilizados en Estados Unidos)
(12, 18-20).
• MET australiano
El MET australiano es un medio excelente, aunque su
preparación resulta larga y difícil, lo que
dificulta su empleo sistemático cuando debe procesarse un
gran número de muestras. Contiene suero bovino
estéril más 5-fluorouracilo (300 µg/ml),
sulfato de polimixina B (100 Unidades Internacionales [UI]/ml),
verde brillante (50 µg/ml), ácido nalidíxico
(3 µg/ml), y cicloheximida (100 µg/ml). Se distribuye
esta mezcla en frascos de 10 ml provistos de un tapón
interior de goma y un tapón exterior de rosca
metálico. Se colocan los frascos en un baño
maría a 100°C. Cuando el medio se ha solidificado, se
perfora el tapón de goma con una pipeta y se reemplaza el
aire contenido en
el frasco por una mezcla de 5% de oxígeno, 5% de
dióxido de carbono y 90%
de nitrógeno. Es necesario llevar a cabo este paso dentro
de un recipiente anaeróbico. Antes de su
utilización se guardará el medio así
preparado en el refrigerador durante una semana. Su vida media a
4°C es de 3 meses.
Con uso de una jeringa se inyecta en el medio aproximadamente 1
ml de la muestra problema, haciendo pasar la aguja a
través del tapón de goma. Se guarda aproximadamente
a 18°C y se remite al laboratorio el frasco así
inyectado. El tiempo invertido en su transporte no debe exceder
las 48 horas.
Cuando el frasco llega al laboratorio, debe ser incubado a
37°C durante 4 días, transcurridos los cuales se
introducen en él 3 ml de solución salina normal.
Tras vigorosa agitación del frasco, se extrae 1 ml de
líquido de su interior, que será sometido a
continuación a una prueba de detección de
Campylobacter, ya sea mediante su aislamiento en cultivo o por
inmunofluorescencia.
• Medio de Lander (Reino Unido)
Este medio es en un caldo de Mueller-Hinton, al que antes de su
esterilización se añaden 5 g de carbón
bacteriológico/litro. Llegado el momento de su
utilización se añaden, en condiciones de
esterilidad, los siguientes ingredientes por litro: dos frascos
de factor de crecimiento para Campylobacter (Oxoid), sangre de
caballo hemolizada (70 ml), vancomicina (40 mg), sulfato de
polimixina B (10.000 UI), cicloheximida (100 mg), trimetoprima (
20 mg) y 5-fluorouracilo (500 mg ). Se distribuyen
volúmenes de 10 ml del medio en contenedores universales
de 28 ml, en los que puede permanecer almacenado durante por lo
menos 3 semanas a 4°C.
Se inoculan las muestras problema al medio. Previamente, pueden
haberse pasado los fragmentos de muestra a través de un
filtro de 0,65 µm de diámetro de poro. Tras una
incubación de 3 días a 37°C, se distribuye el
medio en medios de cultivo y de aislamiento.
• Medio SBL modificado (Francia)
Este medio, descrito por Gastrin (1968) y modificado
posteriormente por Clark (5), presenta la siguiente
composición por litro: agar (8 g), tioglicolato de sodio
(0,5 g), glicerofosfato de sodio (10 g), una solución
acuosa de cloruro cálcico al 1% (10 ml), cisteína
(hidroclorhidrato) (250 mg) y una solución acuosa de azul
de metileno al 0,1% (2 ml). Tras su esterilización por
autoclavado, y a fin de transformar el medio en un medio
selectivo, se añaden a él los siguientes compuestos
por ml: polimixina (1 UI), novobiocina (5 µg), bacitracina
(15 unidades) y cicloheximida (20 µg). Finalmente, se
distribuye el medio en condiciones de esterilidad en tubos
anaeróbicos.
Pueden colocarse en este medio de transporte torundas empapadas
en diferentes muestras, y enviar el conjunto al laboratorio
dentro de un recipiente termoaislado (a 18-30°C). Este debe
llegar a su destino en un plazo de 24-48 horas.
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