Bioensayos de toxicidad

Índice

2. Materiales y
métodos
3. Resultados y
discusión
4.
Conclusiones
5.
Recomendaciones
6.
Bibliografía

1.
Introducción

Los bioensayos de toxicidad permiten evaluar el grado de
afectación que una sustancia química tiene en
organismos vivos y éstos pueden ser agudos o
crónicos. Las pruebas agudas
cuantifican las concentraciones letales de un xenobiótico
a una especie en particular. El valor
calculado se denomina concentración letal media
(CL50) y corresponde a la concentración de un
xenobiótico que causa la muerte al
50 % de la población experimental al cabo de un
tiempo
determinado, generalmente en 48 o 96 horas. En contraste, las
pruebas crónicas estiman la concentración –
efecto media (CE50) de la sustancia de prueba que
causa un efecto al 50 % de la población experimental, al
cabo de un tiempo determinado (Rodríguez y
Esclapés, 1995).
Para regular las descargas de aguas residuales tóxicas hay
que utilizar datos de ensayos de
toxicidad hechos con organismos vivos y confiar en estos datos,
además de efectuar estudios detallados de las características físicas y
químicas de los contaminantes y de los cambios que ocurren
después de su descarga en el medio. Cuando se puedan
describir con precisión en términos químicos
y físicos los componentes tóxicos de un
contaminante y se disponga de técnicas
analíticas pertinentes y de suficiente información acerca de la toxicidad de esos
componentes para los organismos acuáticos, se
podrán establecer normas para tales
contaminantes en valores
numéricos para los componentes tóxicos (FAO,
1981).
Los bioensayos de toxicidad con agentes contaminantes en
organismos vivos bajo condiciones de laboratorio,
se han incrementado en estos últimos tiempos debido a la
brevedad con que se obtiene la información sobre las dosis
letales y subletales (CL50) que afectan negativamente
organismos vivos en los ambientes marinos, estuarinos y
dulceacuícolas (Villamar, 1996).
El uso de bioensayos para la evaluación
de toxicidad de sustancias liberadas al medio a través de
efluentes, ha llevado a la utilización de biomonitores
propios de los ambientes evaluados, lo cual favorece
indirectamente la preservación de la biodiversidad
local. Sin embargo, la variabilidad en la aplicación de
las técnicas experimentales para el mantenimiento
de organismos silvestres afecta la interpretación y
comparación de los resultados entre laboratorios, por lo
que se hace necesario desarrollar metodologías
estandarizadas para establecer condiciones controladas (Palacios
y Pereira, 1997). Utilizar organismos provenientes directamente
del hábitat natural puede distorsionar los resultados
obtenidos por fuentes de
variabilidad no previstas, como nutrición, dinámica de la población, estrés por
depredación, etc. (Sosnowski et al., 1979). Estas variables
pueden ser controladas o eliminadas con las poblaciones de
laboratorio; además, el entrecruzamiento
consanguíneo que ocurre a lo largo del tiempo en esas
poblaciones, resulta en una considerable reducción de la
variabilidad genética
(Lewontin, 1974).
Por otra parte, a causa de la complejidad del medio ambiente
acuático y de las comunidades biológicas que lo
integran es difícil establecer el grado de deterioro que
afecta a las especies o comunidades acuáticas. Por esta
razón es conveniente realizar bioensayos utilizando
organismos vivos en condiciones controladas de laboratorio. Sin
embargo, el objetivo
primordial de un bioensayo es reflejar la realidad de cómo
afectaría a los organismos vivos en su medio natural y
para ello es recomendable paralelamente investigar continuamente
las comunidades en su propio hábitat (Villamar, 1996).
La captación y utilización de zooplancton como
biomonitor data desde comienzos del siglo XX, hoy en día,
gracias al desarrollo de
técnicas para su cultivo en el laboratorio, representa una
herramienta que gana cada vez más reconocimiento en la
evaluación ecotoxicológica (Sosnowski et al., 1979;
Maciorowski, 1981). Según Reish y Oshida (1987), para la
realización de bioensayos es conveniente el uso de
zooplancton por su pequeña talla; requerimiento de poco
espacio de laboratorio y poco volumen de
agua; gran
sensibilidad a sustancias tóxicas; ciclo de vida
corto; requerimientos nutricionales generalmente conocidos, lo
cual lo hace ideal para estudios de bioacumulación.
Dentro de los organismos comúnmente utilizados en los
bioensayos de toxicidad se encuentran los cladóceros,
también llamados pulgas de agua, son crustáceos
pequeños que constituyen la mitad de la Clase Branchiopoda
(Figura 1). El caparazón (bivalvo) encierra al tronco,
pero no a la cabeza y suele terminar posteriormente en una espina
apical. La cabeza porta un sólo ojo nauplio mediano,
también posee antenas
frecuentemente largas y utilizadas en la natación.
Además, presenta de cuatro a seis pares de
apéndices troncales y el potsabdomen esta girado
ventralmente hacia delante. La mayoría de estos organismos
son pálidos y transparentes y viven casi exclusivamente en
agua dulce (Ruppert y Barnes, 1996).

Figura 1.- Vista general de cladóceros, Daphnia
pulex.
Fuente: Microsoft
Encarta 2001.
En condiciones favorables se reproducen
partenogenéticamente (asexualmente) (Figura 2) cada tres o
cuatro días, siendo la población constituida
solamente por hembras. Si el medio se torna desfavorable se
reproducen sexualmente, apareciendo en la población
hembras que producen huevos de resistencia
llamados efipios y machos, los cuales fecundaran estos huevos. Si
las condiciones ambientales vuelven a ser favorables estos
efipios darán hembras partenogenéticas (Tortorelli
y Hernández, 1995).

Figura 2.- Reproducción partenogenética,
hembra Daphnia sp. con huevos
partenogenéticos

Fuente: UDEC. 2001. http://www.udec.cl/bioensayos/recursos_biologicos.html

Debido a su amplia distribución, su importancia
ecológica y su sensibilidad a ambientes intervenidos, se
les considera especies indicadoras de condiciones ambientales
adversas. Además, por ser organismos de fácil
mantenimiento bajo condiciones de laboratorio, normalmente se
utilizan en pruebas de toxicidad acuáticas. En Venezuela
existen numerosas especies de cladóceros que habitan los
lagos naturales y artificiales, zonas inundables y charcas
temporales (Rodríguez y Esclapés, 1995). En este
sentido, Moina macrocopa (Figura 3) es una especie cosmopolita,
un crustáceo encontrado tanto en agua dulce como salobre,
habita en lugares donde las temperaturas oscilan entre 5 y 30
°C y con un pH del agua
desde neutral hasta ligeramente alcalino (Rodríguez y
Esclapés, 1995; Martínez y Gutiérrez, 1997).
Esta especie, como muchas otras de cladóceros, tolera
lugares donde existen abruptas disminuciones en la
concentración de oxígeno
disuelto y alcanzan altas densidades en cuerpos de agua con gran
cantidad de materia
orgánica (Martínez y Gutiérrez, 1997). Esta
especie es de talla relativamente grande comparada con otras
especies presentes en nuestro país, es fácil de
cultivar en el laboratorio, posee alta fecundidad y su ciclo de
vida es de 60 días a 20 °C. Se encuentra en ambientes
acuáticos con una dureza total que excede a los 150 mg/l
de CaCO3 (Esclapés, 1999). En Venezuela ha sido
reportada en Valencia, Edo. Carabobo, en el Edo. Aragua y en la
Isla de Margarita, Edo. Nueva Esparta (Pereira y García,
1995; Rodríguez y Esclapés, 1995; Hernández
et al, 1999).

Figura 3.- Vista general de Moina macrocopa.
Fuente: Lebendfutter-Zuchtansatz. 2001.
Existen numerosos trabajos realizados con cladóceros
sometiéndolos a metales pesados:
Pereira y García (1994), Rodríguez y
Esclapés (1995), Martínez-Tabche et al.(1997),
Baillieul y Blust (1999), Esclapés (1999). También
se han hecho experiencias utilizando insecticidas como
contaminantes: Bergling y Dave (1984), Gliwicz y Sieniawska
(1986), Chu et al. (1997), Dewey y Parker (1998), demostrando que
estos organismos son ampliamente utilizados como
bioindicadores.
La empresa
Bauxilum, de la Corporación Venezolana de Guayana
(C.V.G.), se encarga de las extracciones de bauxita y de la
producción de alúmina, utilizadas
comercialmente para la elaboración de aluminio
metálico. El proceso Bayer
(Bayer, 1887), como paso intermedio en la obtención del
aluminio, es la etapa industrial que extrae el óxido de
aluminio contenido en la bauxita. Este proceso genera un residuo
o desecho que se conoce como "lodo rojo", que es una
suspensión sólido/líquido, constituida
principalmente por 20 – 30 % de sólidos y una
solución acuosa cáustica. Los sólidos
están constituidos por una fracción gruesa formada
principalmente por arena silícica, y una fracción
muy fina con un alto contenido óxidos de hierro.
Además, el lodo rojo contiene: óxido de aluminio
residual, sílice, óxido de titanio y soda
cáustica (NaOH), ésta última disuelta en la
fracción líquida, lo cual le da un carácter
alcalino con pH superior a 12 (Manrique y Crespo, 1998).
Los hidróxidos son irritantes oculares y graves irritantes
cutáneos; muy corrosivos para ojos, piel y
membranas mucosas (Greenpeace, 2001). Particularmente el
hidróxido de sodio es una sustancia tóxica entre 50
y 500 mg/kg según la clasificación de Nancy – Metz
(2002). La DL50 por vía oral para conejo es de
500 mg/kg. Por otra parte, tiene efectos tóxicos en
peces y
plancton como consecuencia del cambio de pH
que produce; llegando incluso a ocasionar la muerte de
peces (Merck®, 1999).
En caso de inhalación produce quemaduras de las mucosas.
El contacto con la piel y con los ojos ocasiona quemaduras y
hasta perdida de la vista; por ingestión causa
irritación de las mucosas de la boca, la garganta, el
esófago y el tubo digestivo, con peligro de
perforación del esófago y el estómago (Nancy
– Metz, 2002).
El hidróxido de sodio es irritante y corrosivo de los
tejidos. En
biopsias de piel realizadas a personas voluntarias
exponiéndolas a disoluciones de NaOH 1 N en los brazos de
15 a 180 minutos se observaron cambios progresivos, empezando con
disolución de células en
las partes callosas, pasando por edema y llegando incluso a
destrucción total de la epidermis en 60 minutos (UNAM,
1998).
Se han reportados casos de disolución total de cabello,
calvicie irreversible y quemaduras del cuero cabelludo en
trabajadores expuestos a disoluciones concentradas de
hidróxido de sodio por varias horas. Las disoluciones de
concentración menor del 0,12 % dañan la piel humana
en aproximadamente 1 hora. Por otro lado, una disolución
acuosa al 5 % genera necrosis cuando se aplica en la piel de
conejos por 4 horas (UNAM, 1998).
La CL50-96h de NaOH en peces es 189 mg/l y en
organismos acuáticos la CL50 se encuentra entre
10 – 100 mg/l en 96 h (Merck®, 1999).
C.V.G. Bauxilum deposita su desecho de producción, lodo
rojo, en tres lagunas adyacentes al río Orinoco (Figura
4), Ciudad Guayana, Edo. Bolívar. Este sistema lagunar
fue construido en 1979 con un diseño
para 21 años de vida útil. Debido a que la
capacidad del sistema original ya fue agotada, se han hecho
modificaciones para prolongar su vida, como elevaciones de los
diques (Figura 5) y construcción de diques filtrantes (CAVSA,
2001a).

Figura 4.- Vista general de lagunas de lodo
rojo.

Figura 5.- Elevaciones de los diques de las lagunas de
lodo rojo.
Dichas lagunas actualmente presentan problemas de
filtración, debido a falta de obras de ingeniería que las acondicione a recibir el
producto del
proceso (pantallas impermeables) y al gran volumen en ellas
depositadas (lodo rojo, agua de lluvia); permitiendo el paso de
este material a otras lagunas naturales o al río Orinoco.
Además en períodos de lluvia por el aumento de
volumen en las lagunas existe la posibilidad que ocurran
desbordamientos, aunque nunca ha sucedido.
El almacenamiento de
los lodos rojos constituye un problema de gran magnitud para la
industria del
aluminio a nivel mundial (Stinson, 1979). Las bajas velocidades
de sedimentación de los lodos rojos hacen que los embalses
requieran cada vez mayores extensiones de terreno. Por otro lado
la soda cáustica (NaOH) constituye un factor de contaminación
ambiental. El rebose inesperado de un embalse de
almacenamiento, debido a condiciones climatológicas,
podría generar la
contaminación y muerte de los ríos y afluentes
aledaños a la planta (Manrique y Crespo, 1998).
Además, las características tixotrópicas de
los lodos rojos inducen problemas de consolidación,
invalidando las áreas o lechos de embalses para efectos de
construcción o reforestación (Nguyen y Boger,
1983).
El 24 de junio del año 2001 fueron reportadas en la
prensa local
"Correo del Caroní" (Pág. A -1) muertes
extrañas de peces en la laguna natural de Cambalache,
estado
Bolívar, Venezuela. Graffe (2001) estudia la existencia de
filtraciones en el Dique Nº 12 de las lagunas de lodo rojo,
el cual se intercepta con el canal Nº 5 para aguas de
escorrentía que culmina en la laguna natural de
Cambalache. Estas filtraciones representan una posible causa de
la mortandad de peces ocurrida en dicha laguna. Las filtraciones
están siendo remediadas temporalmente mediante el uso de
bombas que
devuelven el desecho a las lagunas de deposición (Figura
6).

Figura 6.- Bombeo de licor cáustico proveniente
de filtraciones existentes en las lagunas de
depósito.

La Dirección Estadal del Ministerio del
Ambiente y de
los Recursos
Naturales del estado Bolívar, Venezuela, expone el 9
de julio del 2001, en un reporte a la prensa local "Correo del
Caroní" (Pág. D – 1), la necesidad de realizar
experiencias con organismos vivos para determinar si realmente el
lodo rojo fue la causa de muerte de los peces. Es importante
señalar que en dicha zona descargan los desechos de una
granja de porcinos, de una fábrica de bloques y
además existe el relleno sanitario municipal Cambalache
(Graffe, 2001).
Esta situación es alarmante ya que en dicha zona se
encuentran viviendo aproximadamente 9.500 personas que tienen
libre acceso a las lagunas naturales y de lodo rojo, llegando
incluso algunos a pescar y consumir el agua de las
lagunas naturales, como por ejemplo, la laguna de Cambalache.
No se encuentra estipulado en algún decreto o norma de las
leyes
venezolanas las concentraciones máximas permisibles de
hidróxido de sodio en los vertidos
líquidos.

Objetivo General
Determinar, mediante el uso de bioensayos agudos, el efecto del
hidróxido de sodio (NaOH) principal componente del desecho
(lodo rojo) de la empresa C.V.G.
Bauxilum, sobre el cladócero Moina macrocopa.
Los objetivos
específicos son:

• Determinar la concentración letal media
  (CL50) para ejemplares de Moina macrocopa, sometidos
  a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH) utilizando
  agua sintética dura.
• Determinar la concentración letal media
  (CL50) para ejemplares de Moina macrocopa, sometidos
  a soluciones de hidróxido de sodio (NaOH) utilizando
  agua del río Orinoco
• Comparar la sensibilidad presentada por los
  ejemplares de Moina macrocopa, expuestos a soluciones de
  hidróxido de sodio (NaOH), en agua sintética dura
  y en agua del río Orinoco.

2. Materiales y
métodos

Organismo Experimental
Los bioensayos se realizaron con la especie Moina macrocopa
(Straus, 1820), la cual fue colectada del canal de aguas servidas
de la Ciudad de Juan Griego, Isla de Margarita, Venezuela e
identificada por el Laboratorio de Cultivo de Zooplancton del
Instituto de Investigaciones
Científicas (I.I.C.) de la Universidad de
Oriente, Núcleo Nueva Esparta, Venezuela.
La selección
de Moina macrocopa obedeció a la disponibilidad de cepas
por parte del I.I.C.; la existencia de protocolos
estandarizados para bioensayos de toxicidad específicos
descritos por Rodríguez y Esclapés (1995) y
Esclapés (1999); su condición cosmopolita,
reportándose en Venezuela en los estados Carabobo, Aragua
y Nueva Esparta (Pereira y García, 1995; Rodríguez
y Esclapés, 1995; Hernández et al, 1999); su
importancia ecológica y su sensibilidad a ambientes
intervenidos; además de ser organismos de fácil
mantenimiento bajo condiciones de laboratorio.

Preparación del Material de Vidrio
Toda la vidriería utilizada se limpió de acuerdo a
la metodología descrita por Esclapés
(1999).
Preparación del Medio de Cultivo:
Se siguieron los protocolos estándares de Esclápes
(1999).
Solución madre de KCl:
Se colocaron 8 g de KCl (grado reactivo) en un balón
volumétrico de 1 l, se aforó a 1 l con agua
destilada y se almacenó en botellas de polietileno de 1
l.
Solución madre de MgSO4:
Se colocaron 120 g de MgSO4 anhidro (grado reactivo)
en un balón volumétrico de 1 l, y se aforó a
1 l con agua destilada. La solución así preparada
se almacenó en botellas de polietileno de 1 l hasta su
uso.
Solución madre de NaHCO3:
Se colocaron 96 g de NaHCO3 (grado reactivo) en un
balón volumétrico de 1 l, se aforó a 1 l con
agua destilada y se almacenó en botellas de polietileno de
1 l.
Agua sintética dura:
Se añadieron 18,2 l de agua destilada en un envase
plástico limpio de 20 l, y se adicionaron
2,4 g de CaSO4.2H2O a 1 l de
agua destilada, contenida en un vaso precipitado de 2 l mezclando
hasta disolver por completo el soluto. Esta solución se
transfirió al envase de 20 l donde se mezcló con el
agua contenida en el recipiente mencionado.
Adicionalmente se agregaron al envase de 20 l las soluciones
madres en los siguientes volúmenes:

• 20 ml de KCl
• 20 ml de MgSO4
• 40 ml de NaHCO3

Se suministro aireación durante más de 2
horas.
En el laboratorio de Ambiente de C.V.G. Bauxilum se
determinó la dureza cálcica, dureza
magnésica y dureza total del agua sintética
dura.

Agua del río Orinoco:
El 31 de octubre de 2001 a las 8 a.m. se tomó una muestra de 160 l
de agua del río Orinoco en el muelle de C.V.G. Bauxilum,
estado Bolívar, Venezuela. El agua se filtró con un
tamiz de 60 m m, fue caracterizada por el laboratorio de Ambiente
de C.V.G. Bauxilum y se almacenó en cuatro envases
plásticos de 40 l. Antes de su
utilización se sometió durante 15 h a rayos
ultravioleta para su desinfección y se suministro
aireación por 2 h.

Cultivo de Moina macrocopa:
Dependiendo del tipo de bioensayo a ser utilizados, los
organismos de Moina macrocopa se colocaron en vasos precipitados
de 2 l, con 1 l de agua sintética dura o de agua del
río Orinoco. Después de realizar un recambio de
agua diario del 75 %, los organismos se alimentaron con alimento
formulado para zooplancton Z-plus® de la marca comercial
Zeigler®, a una ración de 180 mg/l. Debido
que el alimento es de tamaño de partícula de 100 –
150 µm, se permitió su disolución en medio de
cultivo durante 30 min y finalmente, se pasó por un tamiz
de 60 µm. Semanalmente se cambiaron de recipiente para la
limpieza del envase y tres veces por semana mediante limpieza de
fondo se extrajeron las mudas y otros sedimentos con una
micropipeta digital de 200 – 1000 m l marca
Labsystems®.
Durante el cultivo se mantuvo una temperatura de
20 ± 1 ºC; fotoperíodo de 9 h luz, 15 h
oscuridad y no se suministró aireación. Cuando se
observo disminución en la fecundidad o presencia de machos
se dividieron las cepas en réplicas para reducir la
densidad de
los organismos.
Los cladóceros se aclimataron durante 15 días a las
nuevas condiciones de laboratorio antes de ser utilizados en los
bioensayos.

Obtención de Neonatos
El día anterior a las pruebas, fueron separadas 40 hembras
presentando embriones en avanzado estado de desarrollo. Cada
hembra se colocó en un tubo de ensayo de 25
ml de capacidad con 15 ml de medio de cultivo, manteniendo las
mismas condiciones de cultivo, excepto por el fotoperíodo
que no se le aplicó.
A las 24 h se confirmaba la presencia de neonatos y estos se
separaban con una micropipeta digital de 200 – 1000 m l marca
Labsystems® transfiriéndose a botellas de
cultivo de vidrio
Kimax® de 250 ml de capacidad con 100 ml de
solución de exposición, comenzando por el control y
terminando con las concentraciones más altas. Se
tomó especial cuidado en el proceso transferencia para no
añadir demasiado medio de cultivo con el objeto de no
alterar las concentraciones.

Solución Madre de Hidróxido de Sodio
(NaOH)
Se preparó una solución madre de hidróxido
de sodio (NaOH) de 1000 mg/l a partir de hidróxido de
sodio (NaOH) (P.M. 40,00 gr/mol) en lentejas marca Riedel-de
Haën® con calidad A.C.S
(American Chemical Society). Se tomaron 1000 mg de
hidróxido de sodio, se disolvieron en agua destilada y
desionizada y se aforó a 1 l. Se almacenó en envase
de vidrio.

Preparación de diluciones de hidróxido de
sodio (NaOH)
Las soluciones de hidróxido de sodio se elaboraron
empleando vidriería volumétrica, a partir de la
solución madre de hidróxido de sodio de 1000 mg/l
diluyéndose con agua sintética dura o agua del
río Orinoco dependiendo del bioensayo a ser realizado, en
un volumen de 1000 ml.
Se determinó sodio total en todas las diluciones
utilizadas en los ensayos por espectrofotómetro de
absorción atómica Perkin Elmer®
1100B.

Bioensayos Agudos Preliminares:
Estas pruebas se realizaron con la finalidad de establecer el
intervalo de concentraciones de las soluciones de
exposición de hidróxido de sodio (NaOH) que
serían utilizadas en las pruebas finales (Tabla
1).

Tabla 1 Condiciones presentes durante los bioensayos
de toxicidad aguda con Moina macrocopa

Los bioensayos se realizaron en botellas
de cultivo de vidrio Kimax® de 250 ml.

Se utilizaron las diluciones de prueba (35, 50, 65, 75 y
100) mg/l de hidróxido de sodio con agua sintética
dura y (23, 25, 28, 30 y 33) mg/l de hidróxido de sodio
con agua del río Orinoco. Cada ensayo dispuso de un
control sin hidróxido de sodio.

Bioensayo Agudo Final:
Luego de determinadas las diluciones de hidróxido de sodio
(NaOH) a utilizar mediante los bioensayos preliminares, se
procedió con los ensayos finales. La diferencia en la
sensibilidad presentada por Moina macrocopa en los dos medios
expuestos a NaOH determinó el uso de concentraciones
distintas.

Bioensayo agudo final con agua sintética
dura:
Se sometieron los organismos a cinco diluciones (23, 25, 28, 30 y
33) mg/l de hidróxido de sodio y un control sin
hidróxido de sodio, todos con sus respectivas
réplicas. Se hicieron observaciones del número de
organismos vivos y muertos, considerándose muertos
aquellos individuos sin movimiento del
corazón
mediante la observación con microscopio
estereoscópico Nikon®; a los 15 min, 30
min, (1, 2, 4, 8, 24, 36, 48) h.
Se determinó el pH y el oxígeno disuelto (OD) a (0,
24 y 48) h en botellas de Winkler de 300 ml, el pH con equipo
Orion® 720A y el oxígeno disuelto con un
YSI® 58.

Bioensayo agudo final con agua del río
Orinoco:
Se siguió el mismo diseño experimental descrito en
el bioensayo anterior pero con las concentraciones (15, 18, 20,
23 y 25) mg/l de hidróxido de sodio y se utilizó
agua del río Orinoco como medio de dilución.
Las concentraciones de NaOH utilizadas en los bioensayos finales
se establecieron dentro del rango donde se presenta la
concentración letal media para Moina macrocopa,
permitiendo un eficiente cálculo
mediante los programas
computarizados utilizados.

Análisis de Datos:
Los datos obtenidos fueron analizados mediante los programas
Binomial, Logit, Moving Average y Probit, utilizando el programa
computarizado de Stephan 1977 (Esclapés, 1999).

3. Resultados y
discusión

Agua Sintética Dura
El cultivo de cladóceros puede realizarse con éxito
en muchos tipos de aguas naturales, pero es preferible el uso de
medios sintéticos reconstituidos. Estos medios son
fáciles de preparar, producen resultados predecibles y
permiten una adecuada tasa de crecimiento y reproducción
(Clesceri et al, 1998). La especie Moina macrocopa generalmente
habita en ambientes acuáticos que presentan una dureza
total superior a 150 mg/l CaCO3 (Esclapes, 1999). En
la Tabla 2 se observan los valores de
dureza presentes en el medio de cultivo.
Tabla 2 Determinación de valores promedios de durezas
presentes en el medio de cultivo agua sintética
dura

La dureza total obtenida (162,3 mg/l) es acorde al rango
preparado (160 – 180 mg/l CaCO3) y resulta ideal para
el cultivo de la especie.
El pH del medio varió durante el cultivo y los ensayos en
un rango de 8,1 – 9,0; con un promedio de 8,5. Lewis y Weber (1985)
señalan un rango óptimo de pH entre 7,0 – 8,6 para
Daphnia.

Agua del Río Orinoco
Tabla 3 Caracterización de los factores
físico-químicos presentes en el agua del río
Orinoco utilizada en los bioensayos

• Según Gaceta Oficial Nº 5021. Decreto
  Nº 883. Aguas Tipo 4A.

El pH (6,439) y los fenoles (0,606 mg/l) se encuentran
fuera de los valores permitidos en el Decreto Nº 883 (Gaceta
Oficial Nº 5021, 1995) si clasificamos el uso de la muestra
de agua del río Orinoco como agua de Tipo 4A (Aguas
destinadas a balnearios, deportes acuáticos,
pesca
deportiva, comercial y de subsistencia. Aguas para el contacto
humano total).
C.V.G. (1999) encontró valores máximos de fenoles
de 0,15 mg/l los cuales pueden ser provenientes de los efluentes
por los lavados de aceites de motores en las
industrias y
principalmente de los depósitos de brea de la industria
del aluminio. La aparición de estos altos valores de
fenoles (0,606 mg/l) en la muestra del agua del río puede
provenir principalmente de procesos
industriales metalúrgicos de Alcasa, Venalum y Sidor, y de
descargas del colector pluvial municipal.
La presencia de fenoles en las aguas puede causar sabores y
olores desagradables al producirse clorofenoles por la
aplicación de procesos de cloración; además
son compuestos tóxicos que pueden causar daños a la
salud del
ambiente (COVENIN, 1992). Al sumar varias aguas residuales
distintas, se supone que los efectos tóxicos de todas
ellas son estrictamente aditivos (FAO, 1981). Estos compuestos
pueden haber provocado un efecto sinérgico del
hidróxido de sodio sobre Moina macrocopa.
El pH del río Orinoco (6,439) aunque se encuentra por
debajo del límite mínimo (6,5) estipulado en el
decreto Nº 883 (Gaceta Oficial Nº 5021, 1995) para
aguas Tipo 4A, es una condición normal para este
río. C.V.G. (1999) encontró un pH entre 6,2 y 9,8
con una media de 6,9; Lewis y Sauders (1990) un promedio de 6,8;
y Vásquez y Sánchez (1984) reportaron una
variación entre 5,9 y 8,3 con un promedio de 7.

Cultivo de Moina macrocopa
Los organismos se adaptaron positivamente a las nuevas
condiciones de laboratorio y a los dos medios de cultivos
utilizados, se observó un aumento considerable de la
densidad antes de los siete días de cultivo. Fue necesaria
la disminución de la densidad semanalmente para garantizar
gran cantidad de hembras en estado de gravidez.
Se encontró en una oportunidad la presencia de machos y de
efipios en la cepa con agua sintética dura, los cuales se
eliminaron al disminuir la densidad. Ruppert y Barnes (1996)
indican que determinados factores, como pueden ser cambios en la
temperatura del agua o un descenso de la disponibilidad de
alimento debida a un aumento de la población, inducen a la
aparición de machos, y se producen huevos fecundados.
Posteriormente se dispuso de mayor control a la densidad para que
no representara una condición limitante en el crecimiento
de la población.
Los factores más importantes que controlan el crecimiento
poblacional y reproducción de los cladóceros son la
temperatura, intensidad de luz, cantidad y calidad de alimento
(Ojala et al, 1995). Tortorelli y Hernández (1995)
recomiendan como condiciones favorables para Daphnia, como
material biológico de bioensayo, temperatura de 20
± 1 ºC y fotoperíodo 12 h luz – 12 h
oscuridad. López y Cabrera (1988) señalan que la
mejor condición de crecimiento de población de
algunos cladóceros es aplicar un fotoperíodo de 12
h luz – 12 h oscuridad. En el presente trabajo no existió
esta misma condición pero se empleo un
fotoperíodo de 9 h luz – 15 h oscuridad, período
recomendado por Esclapés (1999), manteniendo la
temperatura a 20 ± 1 ºC.
Baillieul y Blust (1999) en su experiencia con Daphnia magna
expuesta a cadmio utilizaron una temperatura de 20 ± 1
ºC, fotoperíodo 14 h luz – 10 h oscuridad y un
pH ≈ 8; mientras el Centro Internacional de Investigaciones
para el Desarrollo (1998) sugiere una temperatura de 21 ±
2 ºC y un fotoperíodo de 16 h luz / 8 h oscuridad,
demostrando que los parámetros
físico-químicos varían un poco de autor a
autor pero todos se ubican dentro del rango utilizado en el
presente bioensayo.
Los individuos consumían el alimento, lo cual se
comprobó al presentar el tracto digestivo lleno. La
ración del alimento Z-plus® suministrada
(180 mg/l) diariamente fue la recomendada por Jiménez
(2000). Esta resultó eficiente para los organismos y
debido al recambio diario de agua no se presentaron problemas si
esta no era consumida totalmente. En el trabajo de
Jiménez (2000) el alimento para zooplancton
Z-plus® fue el que presentó mayor
crecimiento poblacional en salinidad de 0 ‰ para Moina
macrocopa al ser comparado con dietas de levadura y de la
microalga Scenedesmus abundans.
Las respuestas positivas de Moina macrocopa a los medios de
cultivo indica que las condiciones establecidas resultaron
óptimas.

Preparación de Diluciones de Hidróxido de
Sodio (NaOH)
Las concentraciones de sodio total determinadas, en todas las
diluciones utilizadas en los bioensayos, por
espectrofotometría de absorción atómica
resultaron muy similares a las esperadas, indicando que las
diluciones se prepararon correctamente (Tabla 4).
Tabla 4 Concentraciones de sodio total presentes en las
soluciones utilizadas en los bioensayos

Se presentó sedimento de color blanco en
las soluciones más altas de hidróxido de sodio (pH
> 10,6) con agua sintética dura. En aguas sumamente
alcalinas (pH 11) una fracción del calcio disuelto se
puede precipitar (Margalef, 1983). El sedimento encontrado pueden
ser carbonatos de calcio precipitados al existir un aumento de pH
en las diluciones, pero este no interfirió en las botellas
utilizadas en los bioensayos ya que se tomo la parte superior de
la solución y el sedimento fue despreciado.

Bioensayos Agudos Preliminares
Bioensayo agudo preliminar con agua sintética dura
No existió muerte en ninguna solución durante las
primeras 4 h de exposición. Todas las concentraciones
probadas (35, 50, 65, 75 y 100) mg/l de NaOH reportaron un 100 %
de mortalidad a las 48 h, y las cuatro mayores a las 36 h. El
control presentó tres individuos muertos (15 %) (Tabla 5,
Figuras 7 y 8).

Tabla 5 Mortalidad de Moina macrocopa presentada en
Bioensayo agudo preliminar con agua sintética
dura

Fig 7.- Mortalidad de Moina macrocopa presentada en
Bioensayo agudo preliminar con agua sintética
dura.

Fig 8.- Porcentaje de mortalidad de Moina macrocopa
presentada en Bioensayo agudo preliminar con agua
sintética dura a las 48 horas.
Las concentraciones de hidróxido de sodio (35, 50, 65, 75
y 100) mg/l utilizadas en este bioensayo resultaron sumamente
tóxicas para los individuos de Moina macrocopa, provocando
la muerte de todos los organismos expuestos.
Nancy-Metz (2002) reportan un CL50 en 24 h de
hidróxido de sodio en
Daphnia de 150 mg/l, lo cual es un valor alto al compararlo con
los resultados obtenidos en el bioensayo preliminar de agua
sintética dura donde se encontró un 80 % de
mortalidad de Moina macrocopa al exponerlo a 50 mg/l de NaOH a
las 24 h.
Las Tablas 6 y 7 muestran los valores obtenidos de oxígeno
disuelto y pH respectivamente. El oxígeno disuelto
varió entre 8,52 y 9,02 mg/l en todas las soluciones. El
pH fue diferente en todas las concentraciones observándose
los menores valores en el control (8,146) y en 35 mg/l de NaOH
(9,807), y el mayor valor para 100 mg/l de NaOH (11,219); con una
desviación con respecto al control de 1,658 – 2,917. Esto
sugiere que el hidróxido de sodio fue el responsable del
aumentó de pH.

Tabla 6 Valores de Oxígeno Disuelto (OD)
determinados en el Bioensayo agudo preliminar con agua
sintética dura

Bioensayo agudo preliminar con agua del río
Orinoco
Debido a que existió un 100 % de mortalidad en las
concentraciones (35, 50, 65, 75 y 100) mg/l de NaOH utilizadas en
el bioensayo preliminar con agua sintética dura, se
experimentó con menores concentraciones (23, 25, 28, 30 y
33) mg/l de NaOH en el ensayo de
biobusqueda con agua del río Orinoco.
No se presentaron muertes en ninguna concentración durante
las primeras 2 h de exposición. Todas las
concentraciones
utilizadas (23, 25, 28, 30 y 33) mg/l de NaOH presentaron por lo
menos un 70 % de mortalidad a las 48 h, las tres concentraciones
más altas tuvieron un 100 %. El control no presentó
mortalidad (Tabla 8, Figuras 9 y 10).

A las 36 h de exposición las concentraciones
mayores de NaOH (30 y 33) mg/l provocaron la muerte a todos los
cladóceros; a las 48 h no se encontró ningún
individuo vivo en 28 mg/l y sólo uno en 25 mg/l. En la
menor concentración (23 mg/l) murieron 14 organismos (70
%) a las 48 h. Lo que indica que la CL50 se encuentra
por debajo de esta concentración.
El oxígeno disuelto osciló entre 8,57 y 9,03 mg/l
en todas las soluciones de exposición (Tabla 9). El pH
presentó una media de 6,490 en el control, mientras en las
demás diluciones se ubicó por encima de 10,4; con
una desviación con respecto al control superior a 3,95
(Tabla 10).

La concentración de oxígeno disuelto se
ubicó en un rango óptimo en todas las
concentraciones (entre 8,57 y 9,03 mg/l); a diferencia del pH que
se presentó sumamente elevado (> 10,4) en las
diluciones de NaOH. La diferencia en la desviación con
respecto al control del pH entre las diluciones de NaOH en el
agua sintética dura (1,658 – 2,917) y en el río
Orinoco (3,959 – 4,290) demuestran que el pH sufrió un
mayor aumento en el río, aun cuando las concentraciones de
sodio utilizadas en el agua sintética dura fueron
superiores.

Bioensayos Agudos Finales
Bioensayo agudo final con agua sintética dura
El control no presentó muertes y sólo en 30 mg/l de
NaOH ocurrió 100 % de mortalidad a las 48 h. En ninguna
concentración ocurrieron muertes durante las primeras 8 h
de exposición. El mayor aumento de mortalidad se
ubicó entre 25 y 28 mg/l de NaOH, de 7 (35 %) a 18 (90 %)
muertes respectivamente, indicando que entre ese rango se ubica
en CL50. La mortalidad en las tres concentraciones
mayores fue similar (18, 20 y 19 muertes) representando
más del 90 % de mortalidad (Tabla 11, Figuras 11 y
12).

La concentración de oxígeno disuelto
varió entre 8,76 y 9,04 mg/l (Tabla 12). El pH
aumentó conforme aumentaba la concentración de
NaOH, teniendo el mínimo en el control (8,413) y el
máximo en 33 mg/l NaOH (9,956), con una desviación
con respecto al control de 1,159 – 1,359; se observa una
diferencia de aproximadamente 1 unidad al compararlo con las
mismas concentraciones preparadas en el bioensayo preliminar con
agua del río Orinoco (Tabla 13).

La concentración letal media
CL50 para Moina macrocopa sometida a diluciones de
NaOH en medio preparado se encontró entre 25,42 – 25,72
mg/l (Tabla 14).

Bioensayo agudo final con agua del
río Orinoco

No se observó mortalidad en el control, ni en la
menor concentración (15 mg/l); la mayor mortalidad (90 %)
ocurrió en la concentración más alta (25
mg/l) a las 48 h. No existieron muertes en ninguna
solución durante las primeras 4 h del ensayo. La
concentración letal media CL50 se ubico entre
20 y 23 mg/l NaOH, donde también fue el mayor aumento de
mortalidad. Este rango es de menor concentración que el
encontrado en el agua sintética dura (Tabla 15, Figuras 13
y 14).

Fig 14.- Porcentaje de mortalidad de Moina macrocopa
presentada en Bioensayo agudo final con agua del río
Orinoco a las 48 horas.

La concentración de oxígeno disuelto
varió entre 8,70 y 9,01 mg/l (Tabla 16); muy similar a las
variaciones encontradas en todos los bioensayos. El pH
presentó gran diferencia entre el control (media de 6,5) y
todas las concentraciones con NaOH (entre 10,027 y 10,554);
presentando una desviación con respecto al control
superior a 3,57 (Tabla 17).

Tabla 16 Valores de Oxígeno Disuelto (OD)
determinados en el Bioensayo agudo final con agua del
río Orinoco

Los valores de la concentración
letal media CL50 calculados para Moina macrocopa
sometida a diluciones de NaOH en medio natural se ubicó
entre 21,52 – 22,34 mg/l.

Tabla 18 Valores de CL50 a las 48 h para
individuos de Moina macrocopa expuestos a hidróxido de
sodio (NaOH) en agua del río Orinoco, obtenidos a
través de diferentes métodos de
análisis

Comparación de los Medios de
Exposición
La concentración de oxígeno disuelto en todas las
diluciones utilizadas de 0 a 100 mg/l de NaOH (incluyendo
preliminares), en los dos medios de exposición, se
comportó de manera similar ubicándose entre 8,52 y
9,04 mg/l, indicando que la cantidad de hidróxido de sodio
utilizada no afectó el oxígeno disuelto en los
medios.
El pH aumentó en todas las soluciones donde se agrego
hidróxido de sodio pero se presentó una diferencia
entre el comportamiento
en el agua del río Orinoco y el agua sintética
dura, siendo mucho mayor el aumento de pH en el agua del
río.
La mayor parte de los seres vivos se desarrollan en un rango
óptimo de pH entre 6,5 – 8,5 (Kemmer y McCallion, 1989).
Esclapés (1999) propone un pH entre 7,0 – 8,6 para el
cultivo de Daphnia magna,
Daphnia pulex y Moina macrocopa. Los cambios en el pH del
organismo alteran la ionización de las proteínas
(Ecker et al, 1994). Bajos valores de pH producen inhibiciones en
las reacciones enzimáticas de los organismos
acuáticos (Kemmer y McCallion, 1989). La presencia de
elevadas concentraciones de pH como las existentes en los
bioensayos finales, > 9,5 en agua sintética dura y >
10 en agua del río Orinoco, pudo haber provocado un efecto
negativo en las actividades enzimáticas de los individuos
de Moina macrocopa.
Los cladóceros poseen apéndices respiratorios en
las patas y el trasporte de oxígeno resulta apoyado por la
presencia de hemoglobina en la hemolinfa (Margalef, 1983). La
afinidad hemoglobina-oxígeno se ve afectada por
variaciones en la temperatura y el pH. El efecto Bohr describe
que una disminución en el pH y un aumento en la
temperatura provocan una reducción en la afinidad
hemoglobina-oxígeno; mientras un aumento en el pH y una
disminución de la temperatura aumenta la afinidad
hemoglobina-oxígeno (Ecker et al, 1994). El aumento de pH
producido en los medios por efecto del NaOH dificulta la
separación de las moléculas de oxígeno de la
hemolinfa de Moina macrocopa generando un déficit de
energía y obstaculizando la llegada del oxígeno a
los músculos.
Los fenoles producen graves irritaciones oculares y
cutáneas; su exposición crónica puede
ocasionar la muerte por daños hepáticos y renales
(Greenpeace, 2001). Rand y Petrocelli (1986) exponen que la
toxicidad de un compuesto puede incrementarse bajo la presencia
de otro u otros xenobióticos. Faría (2001)
encontró que la mezcla de 6 hidrocarburos
aromáticos policíclicos resultaron más
tóxicos para mejillones Perna perna y Perna viridis que
los xenobióticos o crudos utilizados en otras
investigaciones, posiblemente por el efecto sinérgico
producido entre los seis compuestos. FAO (1981) afirma que
sustancias tóxicas tan diferentes como el fenol, el
cobre y el
amoníaco interaccionan de manera casi aditiva y producen
efectos letales en los peces de agua dulce. La existencia de los
fenoles en el agua de río puede haber actuado de manera
sinérgica con el hidróxido de sodio y el pH
aumentando su grado de toxicidad.
Los valores de CL50 calculados por el método
Moving Average, en los dos medios de exposición, no son
confiables por presentarse una concentración alta que
provoca menos porcentaje de muerte que una de menor
concentración produciendo que los límites de
confiabilidad se encuentren muy cerca.
La CL50 calculada por el método Probit en el
agua sintética dura, no puede utilizarse ya que la
probabilidad
encontrada (0,02) es menor que la mínima requerida
(0,05).
Los valores encontrados de CL50 de NaOH para Moina
macrocopa en 48 h fueron menores en agua del río Orinoco
(21,52 – 22,34 mg/l) que el agua sintética dura
(25,42 – 25,72 mg/l). Posiblemente la presencia de altas
concentraciones de fenoles pudo intervenir, pero el
parámetro que debe haber afectado en mayor grado debe ser
el aumento de pH. El control con agua de río tuvo un pH
promedio de 6,5 mientras todas las concentraciones de NaOH se
encontraron por encima de 10 (pH), esta significativa
variación afecta los procesos osmóticos de los
organismos. Merck® (1999) señala que el
NaOH produce un efecto perjudicial sobre los medios
acuáticos debido a que altera su pH. Al comparar las
desviaciones con respecto al control calculadas en los valores de
pH, se observa que las desviaciones en el agua de río
(3,579 – 4,290) fueron superiores con respecto al agua
sintética dura (1,159 – 2,917); aun cuando las
concentraciones de NaOH utilizadas en los ensayos con agua del
río Orinoco eran menores.
Al preparar el agua sintética dura los 2,4 g de
CaSO4.2H2O no se disolvieron completamente,
aun después de someter la solución a calor. El
sedimentó no disuelto se colocó en la
solución total de agua sintética dura pero se
despreció al momento de realizar los bioensayos para que
no afectara a los organismos.
Los valores de CL50 de NaOH a 48 h sobre Moina
macrocopa determinados en agua sintética dura y agua del
río Orinoco, se encuentran dentro del amplio rango (10 –
100 mg/l) de CL50 a 96 h mencionado por
Merck® (1999) para organismos
acuáticos.
El hidróxido de sodio destruye las células al
reaccionar con las sustancias líquidas que contiene,
produciendo liberación de calor Merck®
(1999). Entre mayor sea la concentración y el tiempo de
exposición el daño generado es más
grave.
En la Tabla 19 se observan las condiciones físico –
químicas de las tres lagunas naturales adyacentes a las
lagunas de lodo rojo. Estas lagunas se encuentran en un alto
grado de deterioro ambiental resaltando los valores de pH (>
9,9); aluminio (≥ 1,8 mg/l); color (≥ 500); hierro (hasta
9,7 mg/l) y sodio (hasta 610 mg/l).

Tomado de: Laboratorio de Ambiente C.V.G.
Bauxilum.

*Según Gaceta Oficial Nº 5021.
Decreto Nº 883. Aguas Tipo 4A.

Las lagunas de Cambalache, Caribe y la Aguadita
están sufriendo un grave proceso de contaminación. Si comparamos los
parámetros físico-químicos reportados por
Ingeniería Caura (1992) con los encontrados por el Lab.
Ambiente C.V.G. Bauxilum en el 2001, vemos como el pH aumento de
7,3 a 9,2 en Cambalache, de 8,5 a 10,22 en Caribe y de 8,8 a
10,56 en la Aguadita; el sodio de 8,1 a 610 mg/l en Cambalache,
de 56,06 a 166 mg/l en Caribe y de 52,65 a 175mg/l en la
Aguadita; el aluminio bajó de 3,86 a 1,8 mg/l en
Cambalache, subió de 0,24 a 4,1 mg/l en Caribe y de 1,89 a
3,6 mg/l en la Aguadita. Muchas de las condiciones se han ido
desmejorando con el paso del tiempo lo que debe haber producido
una disminución de la diversidad
biológica.

Ingeniería Caura (1992) identificó
individuos de Moina sp. en la Aguadita (0,30 % de densidad de
zooplancton) y en Cambalache (19,62 % de densidad de
zooplancton). Por presentarse el mayor porcentaje de
cladóceros en la laguna de Cambalache concluyeron que esta
era la que disponía de las mejores condiciones
físico-químicas y biológicas. Actualmente
las buenas condiciones de esta laguna han decrecido
significativamente, el pH es sumamente alto (9,9) y el sodio
procedente presuntamente del lodo rojo se ubica en 610 mg/l, que
comparado con el sodio presente en la menor concentración
de NaOH (28 mg/l) utilizada con agua del río Orinoco que
presentó un 100 % de mortalidad para Moina macrocopa a las
48 h, demuestra que solo pueden existir las especies más
aptas y de mejor adaptación a las variaciones del
ambiente.
Es recomendable realizar un muestreo
sistemático de zooplancton de las tres lagunas naturales
para verificar si aun se encuentran presentes especies de
cladóceros o si por el contrario todas han sido
extintas.
C.V.G. Bauxilum en asociación con la empresa francesa
Pechiney está desarrollando el proyecto de
deposición en seco de los residuos industriales de la
planta; para así en un futuro próximo minimizar el
impacto
ambiental, garantizar la operación de la planta de
alúmina por un período de por lo menos de 30
años, y además cumplir con todas la regulaciones
ambientales vigentes (CAVSA, 2001a). Aproximadamente para el
año 2005 C.V.G. Bauxilum dispondrá de un lodo rojo
sumamente espeso, disminuyendo el envío de líquidos
a las lagunas de lodo rojo que se irán secando
paulatinamente por evaporación (CAVSA,
2001b).
Además la Universidad Simón Bolívar y la
empresa KD Engineering de Estados Unidos,
se encuentran realizando pruebas para neutralizar el agua de las
lagunas mediante la utilización de plantas pilotos,
las cuales han dado resultados satisfactorios y con el estudio de
factibilidad económica se determinará la
construcción de una planta industrial (CAVSA, 2001b).
La CL50 de NaOH para Moina macrocopa encontrada en
agua del río Orinoco se adecua y asemeja más a las
condiciones ambientales presentes en las lagunas naturales
adyacentes a las lagunas de lodo rojo en C.V.G. Bauxilum, por lo
que es el método indicado al momento de estudiar impactos
puntuales y específicos de una región. Pero si por
el contrario, el trabajo que se quiere realizar es pionero y
universal el método ideal es con el medio de agua
sintética dura; ya que este es un protocolo
estandarizado y puede aplicarse a cualquier ecosistema
acuático, pero ofreciendo una visión sumamente
global. Además es un ensayo
reproducible en cualquier lugar y tiempo.
En el ambiente natural, debido posiblemente a un efecto
sinérgico con la presencia de fenoles, un aumento de pH
podría causar grandes mortalidades, como ocurre con la
especie Moina macrocopa.