Dunaniella Viridis

Indice
1.
Introducción
2. Materiales y
métodos
3. Resultados
4. Conclusiones
5. Bibliografía

1.
Introducción

Dunaniella VIRIDIS,es un alga halotolerante ,flagelada ,
perteneciente al reino eucariota y a la familia
Clamidaceae ,la cual, vive en lagunass saladas(en nuestro caso) ,
en los que muchas veces es la única microalga presente en
su medio. (http://www.terra.es/personal2/naturenotes/dbiologia/biologia_extremofilos.htm)<1>.
Los lagos salinos son generalmente someros, por lo que el viento
puede provocar en ellos turbulencia que mezcla en forma eficiente
todo el volumen
acuático Por lo anterior, es muy probable que algunas
comunidades acuáticas vean disminuída su diversidad
biológica más como una respuesta a la homogeneidad
del hábitat .
La reducción de la biodiversidad
en lagos salinos puede llegar a ser tan drástica,
especialmente en los hipersalinos, que ésta puede estar
limitada a un productor primario, halotolerante que como un
estrés
fisiológico inducido por la salinidad. El papel
ecológico de los lagos salinos como sitio de refugio,
alimentación, reproducción y crianza de multitud de
aves
migratorias es innegable. La pérdida de lagos salinos pone
en peligro la viabilidad de estas especies de aves.
http://www.conabio.gob.mx/biodiversitas/lagos.htm<2>.Este
es el caso del flamenco común (Phoenicopterus ruber
roseus) Los excrementos de esos mismos flamencos al caer al
agua de los
lagos proporcionan un campo de cultivo fenomenal para el desarrollo de
Dunaliella
En nuestro csao,fue extraída de la Laguna de Fuente de
Piedra en la provincia de Málaga(UTM:30SUG4309);la cual es
uno de los mayores complejos endorreicos de España(MONTES Y
MARTINO.1987;LINARES,1990).<6>.
Nuestro objetivo
será el estudio de la influencia de las composiciones de
fosfato y nitrato en el crecimento del microalga Dunaliella
viridis;
Hay que señalar que ausencia de nitratos en el medio, el
crecimiento es casi despreciable, aunque el contenido en
ß-caroteno alcanza un 8% del peso seco en 4 días.
(http://www.cartuja.csic.es/SEFV99/abstracts/biotecnologia/p.7-33.htm)<3>

En respuesta al las altas concentraciones de solutos en el
medio,Sintetiza altas concentraciones de glicerol intracelular 7
M (56%) como soluto compatible  para mantener el balance
osmótico de lo contrario sufriría fenómenos
de ósmoticos no deseables para su desarrollo
(http://www.terra.es/personal2/naturenotes/dbiologia/biologia_extremofilos.htm)
<4>
En el siguiente trabajo se intentará demostrar que
Dunaliella salina no sufre cambios significativos ante las
concentraciones de nitrogeno y fosfato que se han suministrado
para dicho trabajo

2. Materiales y
métodos

Actividad Nº1:
Preparación De Medios De
Cultivo E Inóculación De Dunaliella Viridis En
Dichos Medios
Materiales:

• -sales de nitrato purificadas
  sólIdas
• -sales de fosfato purificadas
  ´sólidas
• -matraces de 5E3L
• -Dunaliella viridis procedente de Laguna de Fuente de
  Piedra(UTM:30SUG4309)

Métodos:
–A–Dilución de dichas sales en las siguientes
concentraciones:
1-Alto nitrato(5mM)+alto fosfato(0.26mM)
2-Alto nitrato(5mM)+bajo fosfato(0.052mM)
3-Bajo nitrato(1mM)+alto fosfato(0.26mM)
4-Bajo nitrato(1mM)+bajo fosfato(0.052mM)
–B—Inoculación en los diferentes medios de
Dunaliella viridis
–C—Los cultivos se mantendrán en agitación
permanente,bajo lus continua de 150 micromoles por metro cuadrado
y segundo ;a una temperatura de
25 grados centígrados

Actividad Nº2:
Medida De La Densidad
Celular
Materiales:

• -viales eppendorf
• -microscopio
• -lugol
• -cámara cuentaglobulos
• -cubreobjetos

Método:
Conteo por microscopio en camara cuentaglobulos ;para lo cual se
habra teñido antes con lugol .dicho compuesto pone de
manifiesto el pirenoide del microalga
El valor medio se
multiplica por 160000,lo que nos dará una densidad de
nº de cállulas por ml.

Actividad nº3:
NEFELOMETRÍA(medidad de la absorbancia a 750nm):
Materiales:

• -Espectrofotómetro
• -cubetas
• -microalga

Método:
Tomar cultico in vivo,añadir al espectrofotómetro
1-2ml y medir absorbacia a 750nm
Construir gráfica que enfrenmte densidad celular y
datos
ibtenidos
Ver si es la misma para todos los cultivos

Actividad Nº4:
MEDIDA DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS
Extracción de acetona a partir de pellets y medidad
espectrofotométrica
Materiales:

• -Espectrofotómetro
• -Centrífuga de mesa
• -tubos
• -acetona

Método de extracción y medida
*1-tomar 5ml de muestra y
centrifugar durante 5min
*2guardar sobrenadante para medir fosfato con método
verde malaquita
*3resuspender el pellet en 4ml de acetona para extraer
pigmentos
*4mezclar y enrasar a 5ml con H2O destilada
*5centrifugar 1min
*6medir la absorbancia del sobrenadante resultante
-750nm turbidez
-664nm máximo de absorción de la clorofila A
-480nm máximo de absorción de pigmentos
carotenoides
*7cálculos:
-para clorofila A:multiplicar resultados por factor de
10,3(mg/ml)
-para carotenoides:multiplicar por factor de 10(mg/ml)

Actividad Nº5:
MEDIDAS DE NITRATOS,NITRITOS Y AMONIO
Se filtran 10ml de cultivo y se congelan para psterior
análisis

Actividad Nº6:
MEDIDA DE FOISFATO:
Materiales:

• -filtros GF/C
• -tubos
• -reactivo verde malaquirta
• -espectrofotómetro
• -soluciones
  conocidas de fosfato de 2.5,5,10,15,25 micromoles por
  litro

Método:

• -usar sobrenadanbte de la extracción de
  pigmentos
• -_filtrarlo por GF/C
• -mezclar en un tubo 2ml de muestra y 4 de verde
  malaquita
• -esperar 5min
• -medir absorbacia a 660nm(el blanco será el
  reactivo)
• –hacer lo mismo con las concentraciones conocidas y
  construir recta patrón

Actividad Nº6:
MEDIDA DE Ph:
Materiales:
-Electrodo
Método:
-se miden los cultivos con el electrodo

Actividad Nº7:
MEDIDAD DE LAS TASAS DE FOTYOSÍNTESIS Y RESPIRACIÓN RESPECTIVAMENTE:
Método:
-Incubaciones de unos 10 min en luz y oscuridad
midiendo el oxígeno
inicial y el final

Cálculos:
OXÍGENO INICIAL-OXÍGENO FINAL=X(mg/Ml)
X(mgO2/L*0.125L/Ycélulas(en 125mL incubados /10min
Explicación:0.125mL es el volumen de cultivo introducido
en el mnatraz para hacer las incubaciones.
Se multiplica por el número de células
conocido que hay en un .mL,y se divide por 10 que es el tiempo total prar
tener el calculo en unidades por min
Se puede transformar luego a picogramos hora multiplicandp por
60

3. Resultados

Observaciones:
El día 1 es en realidad el 3º de cultivo(Carlos
Jiménez UJA)
Aunque se realizaron dos inoculaciones de Dunaliella viridis en
fechas diferentes consecutivas; sólo se muestra el
inóculo número uno ,correspondiente al periodo
comprendido entre los días 29 de Octubre de 2002 y 15 de
Noviembre del mismo año; ya que el número dos
presentaba más errores en las toma y realización de
muestras
Las gráficas aquí mostradas fueron
realizadas con Microsoft
Excel, así como con Microsoft word
el texto.
Las zonas que aparecen en las gráficas sin líneas
corresponden a datos omitidos por una toma de ficiente de los
datos

Gráficas:

• K para n+p+=16021333 y r=0.15
• K para n+p-=15000000 y r=0.13
• K para n-p+=13362666 y r =0.0.12
• K para n-p-=7535466 y r=0.13

TABLAS:

R de crecimiento de cultivos

Tratamiento mediante ANOVA NO CONCLUYENTE

Respiración

Fotosíntesis:

Cálculos:

Análisis de la varianza para el
crecimiento

Discusiones:
En resultado estadístico para las columnas(nitratos)
F<Feperimental ;luego acepto que existe influencia de los
tratamientos de nitrato en el crecimiento.
Por el contrario la muestra(fosfatos),no influye en el
crecimiento.
Esto puede ser debido a que existe una cantidad de fosfatos lo
suficientemente significativa como para que no sea el elemento
limitante del crecimiento en la muestra.
Cabe hacer las siguientes observaciones:
**El día 15 del tratamiento se ve un decaimiento
generalizado del crecimiento, el cual coincide con un incremento
en la producción de carotenos ;lo cual verifica
de forma no estadística, la afirmación
de<5>,en la que se comenta el aumewnto de de lam
producción de carotenos por prte del material
biológico que hemos estudiado,cuando la
concentración de nitratos baja.
Esto último ocurre de manera más acentuada cuando
el nitrato es el único componente deficitario.Esto se
puede observar en la gráfica adjunta en la sección
resultados.
No obstante hacría que continuar,con la observación del inóculo para obtener
más datos.
Como elucubración sobre este fenómeno se
podría decir que el alga puduiera que produjera una
respuesta generalizada ante cualquier tipo de stress y que la
producción de carotenoides fuera una de estas respuestas.
Estea producción de carotenos se observa sobre todo( nivel
comparativo entre la s gráficas)cuando el nitrato empieza
a escasear y todavía el fosfato no ha caído
demasiado.
**Cuando aumenta el ion amonio en grandes cantidades en un
sistema, es
indicativo de que se está desarrollando una
producción regenerada(Jaime Rodríguez;Ecología,1999;204)<5>.En nuestrpo
sistema se puede observar que los cuatro medios hasta el tercer
día no no se separan,gráficamente hablando
demasiado en sus concentraciones de NH+4,se podría decir
que hasta este momnento no existe producción
regenerada.
Este descenso coincide con una suave suvida generalizada en los 4
medios del nitrio ,el cual es un intermediario en la
asimilación del nitrogeno por parte de Dunaliella.
Dicha producción esta catalizada por la nitrato reductasa
que es la enzima que controla el procenso de
asimilacón(Jaime Rodrigue;Ecología;1999;pp148).
En nuestro cultivo N-P+ se puede ver como la bajada de nitratos
es más acentuada y esto puede ser,a parte de por ,una
,rápida asimilación,pórquela haber
suficiente fosfato en el medio las reacciónes de
fosforilación-defosforilación no están
limitadas,por lo que se pueden producir más
fácilmente la fijación de nitratatos ya que
probablemente la nitrato reductasa encuentre más
fácilmente el ATP necesario para su funcionamiento.
Esto también sería extrapòlable a los
procesos
anabólicos necesarios para la formación de enzimas,entre
ellas la anteriormente mencionada.
Por lo cual;si no hay suficiente fosfato el nitrato se
asimilará más lentamente por la falta de enzimas y
energía química que son
necesarias..ÉSTE PUDIERA SER el motivo por el cual
Dunaliella asimila más lentamente el nitrato en los medios
faltos de fosfato

4.
Conclusiones

1-dunaliella viridis no es afectada significativamente
por las concentraciones de fosfato utilizadas en el ensayo.
2-Dunaliella viridis es afectada significativamente por las
concentraciones de nitrato usadas en el ensayo.
3-posible sobreproducción de carotenoides después
del agotamiento de nutrientes.Para comprobación
habría que continuar más tiem`po el ensayo.
4-Posibles beneficios económicos por producción de
carotenoides en condiciones de de stress por bajs
[nitrato]
5-Posiblemente al estar adaptada a medios pobres en fosfato
optimice sus recursos lo que
le hace no tenerlo como recurso limitante en el medio.
6-si el recurso limitante es el nitrógeno significa que
probablemente este abunde en su medio por eso no ptimizaría su uso tanto como el
fosfato

5. Bibliografía

<2> ( Alcocer, J. y E. Escobar. 1992. La
producción primaria en aguas athalasohalinas. Rev. Soc.
Mex. Hist. Nat. 43: 101-108.
Alcocer, J. y W.D. Williams. 1993. Lagos salinos mexicanos. Pp.
849-865. In: Biodiversidad marina y costera de México.
S.I. Salazar y N.E. Gonzáñez (eds.). CONABIO y
CIQRO. México. 865pp. )(2)
<3> <4> Avron, M. & Ben-Amotz, A. (1979).
Metabolic Adaptation of the Alga Dunaliella to low water
activity. In Strategies of Microbial Life in Extreme
Environments, Berlin: Dahlem Konferenzen, 1978. (Ed. M. Shilo). .
pp. 83-91.)>3>
<5> Jaime Rodríguez:EOLOGÍA;Ediciones
Pirámide 1999
<6>Montes C. Y P.martino(1987).Las aguas salinas
españolas pp95-145 en Bases científicas para la
protección de humedales de España.Reqal academia de
ciencias
exactas,Físicas y naturales.Madrid
Palabras Clave: Dunaliella
Viridis,Halófitos,Halotolerante,Carotenoide

Autor:

Antonio García Blesa