Los carbohidratos
representan una de las clases más comunes de compuestos
orgánicos presentes en la tierra y su
análisis y purificación resulta ser
de extrema importancia para los investigadores
bioquímicos.
En los sistemas
bioquímicos, los carbohidratos desempeñan diversas
funciones como
por ejemplo: son esenciales en el metabolismo de
las plantas verdes,
desempeñando un importante papel en la
utilización del CO2.
Representan las últimas fuentes de
carbono y de
energía en los organismos no-fotosintéticos y
pueden ser estructuralmente necesarios, como en el caso de la
celulosa de las plantas ó de la quitina, como
constituyente principal del caparazón de varios
organismos.
Otros tipos de carbohidratos juegan papeles diversos a la manera
de: lubricantes, factores de reconocimiento celular,
determinantes grupo
sanguíneos y como anticongelantes celulares.
Las glicoproteínas (proteínas
unidas a residuos de carbohidratos) por su parte, actúan
como enzimas,
anticuerpos, hormonas y
receptores glicoconjugados en la relación
huésped-patógenos. En éste caso, los
carbohidratos pueden participar en la conformación
estructural, metabolismo, tiempo de vida
media y en el aporte celular de las proteínas.
Así también, eventos como la
diferenciación y el reconocimiento celular y la actividad
hormonal; pueden verse afectados por causa de las porciones
glicánicas (carbohidratos) que conforman a las
glicoproteínas.1
Los carbohidratos son
componentes integrales de
moléculas amplias y complejas tales que las
glicoproteínas, glicoesfingolípidos y de un diverso
número de metabolitos secundarios de origen animal y
vegetal.
Los carbohidratos pueden unirse mediante
derivatización natural o por conjugación a una
amplia variedad de compuestos a
través de múltiples maneras de naturaleza
química o
enzimática.
El análisis de los carbohidratos puede dividirse en 2
áreas: mediante los métodos
basados en la cromatografía y de aquéllos que
emplean otras técnicas
diversas. Los primeros incluyen a los procedimientos
inmunológicos como la inmunoprecipitación y la
inmunofluorescencia a pesar de no ser específicamente
enzimáticos, pero en base a su etiología
biológica.
Dos tipos de análisis enzimáticos son
comunes: el específico para monosacáridos y, el
específico para la hidrólisis de
oligosacáridos de cadena larga.2 Dichos
métodos son extremadamente resolutivos pero se ven
limitados por las interferencias derivadas de los
contaminantes presentes en las soluciones de
prueba, e incluso por la presencia de otros azúcares,
sales y metales.
Además, tanto la pureza como el origen de las enzimas,
resultan ser críticos en la determinación de los
carbohidratos.
La actividad y especificidad de las glicosidasas aisladas de
diferentes fuentes, puede variar ampliamente. De la misma forma,
pueden surgir confusiones en la liberación de más
de un residuo monosacarídico después de la
hidrólisis de oligosacáridos ramificados mediante
una sola exoglicosidasa. La falta de una hidrólisis puede
no necesariamente indicar la ausencia de alguna unidad
monosacarídica particularmente no-reductora; ya que el
grado de liberación dependen tanto de la longitud como del
arreglo secuencial de las unidades sacarídicas vecinas que
conforman a la cadena oligosacarídica.
Aún más, se debe considerar
también, de que existe la posibilidad de que un
monosacárido dado se encuentre presente en la forma
furanosa en lugar de la piranosa, así como la presencia de
contaminantes inhibidores de glicosidasas.
La fuerte especificidad de los métodos
enzimáticos, resulta ser igualmente contraproducente, dado
que cada uno de los carbohidratos, requieren tanto de diferentes
condiciones para su análisis, como de diferentes series de
enzimas.
Mientras que los métodos enzimáticos han sido los
seleccionados para algunos carbohidratos, particularmente la
glucosa; los métodos cromatográficos han sido de
gran valía al bioquímico.
El análisis cromatográfico de los carbohidratos,
así como el de cualquier otro analito; puede dividirse en
2 distintas áreas: la
separación y la detección. La confusión se
puede presentar aquí, debido al hecho de que los
carbohidratos hidrosolubles, fuertemente polares y no
volátiles; no son separados con facilidad por alguno de
los métodos de rutina disponibles.
Dado que no son cromofóricos, no logran ser detectados
mediante la espectroscopia de absorción. La
derivatización de éstos, de manera a favorecer sus
características cromatográficas y de
absorbancia; pueden sin embargo, dar lugar a la formación
de múltiples picos para cada analito, como resultado de
una derivatización incompleta.
Numerosas técnicas de separación de los
carbohidratos se han desarrollado a lo largo de los años.
La cromatografía en papel, aunque es extremadamente
barata; requiere de varias horas e inclusive días para la
separación de tan solo simples monosacáridos y si
se trata de oligosacáridos, éstas separaciones
resultan a menudo imposibles.3
Varias técnicas de cromatografía en capa
fina y de alta resolución de la capa fina, han logrado
desarrollarse.4
Mientras que una selección
adecuada de la fase estacionaria, fase móvil y
ocasionalmente una derivatización precromatográfica
pueden asegurar la separación de varios carbohidratos; una
limitada resolución proporcionada por el número de
platos de la capa fina, reduce el número de los posibles
analitos que pueden ser separados.
Los carbohidratos presentes como mono o como
oligosacáridos, deben ser derivatizados de manera a
poder
analizarlos mediante las técnicas de cromatografía
de gases.
Diversas técnicas de derivatización han sido
desarrolladas e incluyen: la formación de
alquil-éteres o alquil-ésteres, así como una
trimetil-sililación.5
En cualquiera de los
casos antes mencionados, las muestras deben someterse a un
pretratamiento, que a menudo incluye una remoción de
proteínas y sales, antes de la
derivatización.
A menudo. el método de
detección empleado para la cromatografía de gases,
como por ejemplo la ionización de llama o flama; tiende a
ser destructivo y en el mejor de los casos, el trabajo
preparativo requiere de reactivos de derivatización
tóxicos, caros o químicamente lábiles.
Aún más, los grandes oligosacáridos
aún derivatizados, pueden sufrir una descomposición
dentro del cromatógrafo. En el caso de los
monosacáridos, la derivatización puede ser
incompleta y dar lugar a la formación de múltiples
picos por cada analito.
La facilidad con la que se ha logrado establecer una interfase
entre la cromatografía de gases y la espectrometría
de masas; parece resultar muy útil en muchos de los casos.
Cantidades significativas de datos
estructurales pueden ser obtenidas cuando varios carbohidratos
derivados son analizados.6
Entre otras aplicaciones
recientes, podemos mencionar el de la separación de
carbohidratos sialilados, mediante la cromatografía por
fluidos supercríticos.
Dicho método promete avances pero al igual que la
cromatografía de gases, se requiere que los carbohidratos
sean derivatizados. Por otro lado, dado que se emplean bajas
temperaturas, se reducen las posibilidades de una
formación de artefactos inducidos
térmicamente.
En el caso de las técnicas de
cromatografía líquida en columna abierta, la de la
permeación en gel ha permitido la obtención de
mejores resultados.7
Otras técnicas a bajas
presiones incluyen una fase normal y una cromatografía de
afinidad con lectinas inmovilizadas.8
Mientras que
algunos carbohidratos son iónicos de manera natural
(azúcares aminados, ácidos
urónicos, carbohidratos complejos sialilados,
carbohidratos fosforilados, etc.) y pueden por lo tanto ser
naturalmente separados por intercambio iónico; la
adición de borato al eluante para el análisis de
los carbohidratos neutros, da lugar a la formación de
complejos borato-carbohidratos aniónicos que de igual
manera pueden ser separados por intercambio
iónico.9
Los carbohidratos muy polares
pueden ser también separados por métodos en fase
normal y bajo diferentes substratos que incluyen: la
hidroxiapatita, celulosa microcristalina, sílica y
soportes de mezclas de
carbón activado.
Los carbohidratos pueden ser separados tanto en su forma
natural no derivatizada o en sus formas químicas -acil y
–alquil.
Actualmente, la cromatografía líquida a alta
presión
o resolución incluye técnicas como: la
permeación en gel, materiales de
intercambio catiónico empacados con metales, fases de
sílica aminopropilo y de fase reversa.
Para el análisis completo de una mezcla compleja de
oligosacáridos derivados de glicoproteínas, se
requiere emplear una técnica de 2 columnas. El
fraccionamiento por tamaños mediante una columna
aminopropil, es seguida por una resolución de las especies
estructuralmente distintas dentro de cada fracción,
utilizando una columna de fase reversa.10
La fase
reversa ha permitido la separación de carbohidratos
derivatizados mediante columnas C-18. Los derivados más
comunes empleados en cromatografía de líquidos,
son: los benzoatos, alquil-éteres y
acetatos.11
Las técnicas
electroforéticas también pueden ser
incluídas como del tipo cromatográfico. Se han
usado en la separación de carbohidratos de manera
preparativa y analítica. En la mayoría de los
casos, son los glicopéptidos preparados mediante
hidrólisis enzimáticas o químicas; los que
logran ser separados de manera electroforética, aunque
también se les puede separar por cromatografía
líquida a altas resoluciones o presiones.
Diversas técnicas han sido empleadas en la
detección de los carbohidratos después de la
separación cromatográfica. Aquí se incluyen
las revelaciones con sprays o inmersiones de tiras de papel en
paltos de capa fina conteniendo diversos reactivos de
coloración. Aunque se trata de métodos sensitivos,
resulta muy difícil realizar un análisis
cuantitativo.
Dentro de los sprays cromogénicos se mencionan: el
ácido tiobarbitúrico para la determinación
de ácidos siálicos; el orcinol-ácido
sulfúrico para determinar galactosa; antrona para hexosas;
carbazol para ácidos urónicos; el resorcinol para
residuos de ácidos siálicos unidos, y otros
generales y específicos.
Los métodos de detección basados en reacciones de
unión enzimática, también han sido empleados
y como ejemplo, se menciona el uso de la galactosa-oxidasa para
determinar galactosa.
Otra técnica fuera de línea y que permite
monitorear la radioactividad presente en carbohidratos marcados
presentes en muestras colectadas, es la del centelleo
líquido.
En gases, además de la ionización de llama, se
tienen otros detectores como el de
Nitrógeno-Fósforo que determinan carbohidratos
amino derivatizados; mientras que el detector de captura de
electrones, permite la determinación de muestras
derivatizadas con residuos halogenados o que contienen el grupo
arilo.
Muchos carbohidratos exhiben actividad óptica,
pero el problema que se presenta es que algunos desvían la
luz hacia la
izquierda (levógiros), otros hacia la derecha
(dextrógiros) o son inactivos.
En líquidos, los métodos de detección son
las bajas longitudes de onda ultravioletas (190 a 210
nm)12 y el índice de
refracción13 que es un método más
bien no selectivo. La adición de cualquier soluto y el
cambio
mínimo de la temperatura,
afectan éstos índices por lo que se dificulta su
empleo.
Dionex (Sunnyvale, Calif.) ha recientemente introducido
al mercado las
series BioLCTM tanto para sistemas de
separación como de detección.
Mientras que tanto la coulombimetría como la
amperometría, parecen ofrecer limitados resultados en el
análisis de los carbohidratos: una técnica reciente
"la pulsación amperométrica" parece brindar mejores
resultados.14
El detector de pulsación
amperométrica logra detectar carbohidratos no reductores
(alditoles y glicósidos) con la misma sensitividad para
los reductores.
La combinación de resinas peliculares de intercambio
aniónico con una detección
pulso-amperométrica, parecen ofrecer hoy en día, el
más rápido, selectivo, sencillo, sensitivo y el
mejor método de análisis de los
carbohidratos.15
Referencias
- Sharon, N., Complex Carbohydrates: their chemistry,
Biosíntesis and Functions
(Addison-Wesley, New York, 1975). - Slomiany, B.L., Slomiany, A. and Zdebska, A., J.
Biol. Chem. 257, 2863 (1984). - Carlson, D.M., J. Biol. Chem. 243, 616
(1968). - Slomiany, B.L., Slomiany, A. and Zdebska, A., J.
Biol. Chem. 259, 14743 (1984). - Albersheim, P. et al., Carbohydr. Res. 5, 340
(1967). - Strecker, G. et al., Anal. Biochem. 111, 17226
(1981). - Kremmer, T. and Boross, L., in: Gel Chromatography.
Theory. Methodology and Applications (Wiley-Interscience, New
York, 1979). - Picard, J.K. and Feizi, T., Molecular Immunology 20,
1215 (1983). - Green, E.D. et al., J. Biol. Chem. 260, 15623
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(1985). - Daniel, P.F. et al., Carbohydr. Res. 97, 161
(1981). - Bergh, M., Koppen, P. and Van Den Eijden, D.
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(1983). - Rocklin, R.D. and Pohl, C.A., J. Liquid Chromatogr.
6, 1577 (1983). - Olechno, J.D., Carter, S.R., Edwards, W.T. and Dennis
G. Gillen (Dionex Corp., Sunnyvale, California)
September-October 1987.
Autor:
ºMauricio Alfredo Ondarza Benéitez
ºUniversidad Autónoma de Tamaulipas. Unidad
Académica Multidisciplinaria Reynosa-Rodhe. Ingeniería Ambiental. Carretera a San
Fernando-cruce con canal Rodhe. Col. Arco Iris. Reynosa,
Tamaulipas.